一、小鼠2-细胞、4-细胞胚胎G_1期检测及同步化的研究（论文文献综述）
黄浩文[1]（2021）在《OSR2在细胞周期阻滞中的作用 ——肾脏缺血再灌注损伤研究新机制》文中认为目的:运用生物信息学技术分析早期肾脏缺血再灌注损伤（Renal ischemia re-perfusion injury,RIRI）的激活通路和关键差异表达基因。验证关键差异分子OSR2（odd-skip related 2）在体内外肾小管损伤模型中的表达变化,初步研究其对细胞周期和细胞凋亡的调控,探讨其在肾脏损伤中的可能作用。方法:1.GEO数据库中查询并筛选肾脏早期缺血损伤的数据集,将数据集归一化后分析获得差异性表达基因（differentially expressed genes,DEGs）。顺铂及过氧化氢构建体外AKI模型后,获得其RNA高通量测序结果,同样方法分析得到体外模型的DEGs。并将共同DEGs提交到David数据库,来进行GO及KEGG通路的富集分析,应用STRING和Mogrify网站找到中枢差异性的转录因子,最终使用R将差异分析结果可视化。2.qPCR以及Western blot检测体外RIRI模型的中枢差异基因的表达变化。细胞周期方面,构建体外荧光泛素化细胞周期指示器（Fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator,FUCCI）细胞,观察FUCCI细胞在缺氧刺激下的荧光变化。免疫印迹法检测cyclin E1、cyclin D1、p21和p27等细胞周期相关蛋白的表达变化。细胞由碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）染色后流式细胞仪观察细胞周期变化。此外,在凋亡检测方面,使用hoechst 33342染色缺氧刺激的细胞,通过使用荧光显微镜观察亮蓝色凋亡细胞来计算凋亡比例,Western Blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3和cleaved-PARP,Annexin V和PI对细胞进行双染色后,流式细胞仪检测凋亡率的改变。3.肾动脉夹闭法构建缺血再灌注小鼠模型,免疫荧光染色观察关键基因的表达与细胞定位,HE染色评价肾小管损伤情况,初步地分析关键基因OSR2的表达与肾脏损伤可能关系。结果:1.在GEO数据库中筛选出符合条件的数据集GSE126805,结合体外AKI模型（H2O2、顺铂刺激）的高通量测序结果,进行差异表达基因分析。分析可得,GSE126805数据集、H2O2和顺铂处理组的上调DEGs分别为168个、755个和72个。其中,H2O2刺激组和GSE126805数据集的共同DEGs数值为74个（包括FOSB、OSR2和Gadd家族等）。共同DEGs的KEGG通路富集分析发现,这些共同DEGs介入了凋亡通路的调控。此外,将这些共同DEGs通过STRING数据库和cytoscape软件进行分析,发现凋亡相关的蛋白Gadd45g、TRIB1和IER5的Degree评分均较高,并且这些蛋白和OSR2均存在一定的联系,并结合Mogrify数据库数据对共同的DEGs的评分。最终,我们筛选出关键差异转录因子——OSR2。2.qPCR和Western blot观察H2O2刺激的肾小管上皮细胞中OSR2的表达模式。发现H2O2刺激肾小管上皮细胞后,OSR2表达相比于正常对照组显着升高且在2h达高峰,在4h后逐渐下降至低水平。H2O2刺激FUCCI工具细胞（细胞周期可视化细胞）发现,与正常未刺激组相比,4h后绿色荧光细胞（S期细胞）增多。Western blot发现,H2O2刺激组的细胞较正常组,促进G1期向S期转换的蛋白cyclin D1和cyclin E1在4h上升,而抑制细胞进入S期的p27在4h后表达下降。流式细胞术显示,相比正常对照组,H2O2刺激的细胞在4h后S期细胞比例增多。Hoechst 33342染色发现,H2O2刺激细胞中凋亡的细胞数目在4h后明显增多。Western blot发现,H2O2刺激的细胞中Bax、cleaved-caspase3和cleaved-PARP蛋白在4h后表达,较正常组明显下调。而Bcl-2蛋白在4h后,较正常组表达上调。流式细胞术显示,与正常组相比,H2O2刺激组4h后凋亡细胞比例明显增多。3.小鼠体内实验中发现,相较于假手术组,肾动脉夹闭26min+对侧肾脏切除组近端小管上皮细胞在术后4h OSR2的表达水平明显升高。此外肾小管损伤评分发现,与假手术组比较,肾动脉夹闭26min+对侧肾脏切除组的近端小管有着明显的损伤。结论:1.通过生物信息学分析,根据GSE126805数据集和体外H2O2刺激肾小管上皮细胞RNA测序结果。这些数据的共同DEGs的通路富集发现凋亡通路的激活,STRING数据库和Mogrify数据库分析筛选出关键转录因子——OSR2。2.体外模型发现OSR2表达后,肾小管上皮细胞发生G1/S期阻滞,并且细胞的凋亡程序开始激活。3.RIRI小鼠体内实验发现,肾小管上皮细胞表达的OSR2伴随着肾小管上皮细胞损伤。4.OSR2是肾脏IRI发生的早期关键分子,其可能通过引发细胞周期阻滞导致凋亡发生从而参与肾小管损伤的发生。
沈毓峰[2]（2021）在《牛蒡子苷元衍生物抗鲤春病毒血症病毒活性及机制研究》文中研究说明鲤春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus,SVCV）诱发的鲤春病毒血症（Spring viremia of carp,SVC）是一种严重危害鲤科鱼类的水生动物病毒性疾病,具有发病急、传染性强、致死率高等特点,给水产养殖业造成巨大的经济损失。目前,由于疫苗免疫防控的缺乏和局限,药物防控仍然是病害防控的有效手段。医用抗病毒药物盐酸吗啉胍、利巴韦林等被禁用以来,抗病毒药物在生产中应用寥寥无几,因此水产抗病毒药物的创新研究受到了极大的关注,也是产业的迫切需求。中草药具有易降解、环境友好等优点,具有抑菌、驱虫、抗肿瘤、抗病毒等多种生物学活性,是药物创新的出发点和药源库。本研究首先测定牛蒡子、川芎等37种中草药的抗SVCV活性,发现抗病毒活性最高的为牛蒡子,其活性成分为牛蒡子苷元（Arctigenin,ARG）;进一步对27种合成的ARG衍生物进行活性评价;并通过RNA-seq转录组学分析等手段,深入研究衍生物的抗病毒机制,以期为开发新型抗SVCV药物提供理论依据。本研究取得结果如下:1.中草药及活性成分抗SVCV活性研究以最大安全浓度筛选具有抗SVCV活性的中草药,实时定量PCR（Real-time quantitative PCR,RT-q PCR）检测结果显示:牛蒡子、川芎、白芍等7种中草药对SVCV的抑制率超过90%,其中牛蒡子对SVCV的抑制作用最佳。采用高效液相色谱对粗提物分析发现:牛蒡子苷（Arctiin,ART）和ARG是牛蒡子中的主要成分,含量分别为233.68 mg/g和12.28 mg/g;ART和ARG抗病毒活性研究结果显示:ARG显着抑制SVCV诱导的细胞病变,说明ARG可能是牛蒡子的主要活性成分;通过RT-q PCR、病毒滴度检测和细胞结构观察,发现ARG显着降低了病毒滴度并减轻SVCV对细胞结构的损伤,其半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)为0.81μM,证实了ARG具有体外抗SVCV活性。ARG抗SVCV活性在体试验研究显示:试验鱼脾脏和肾脏中SVCV基因表达量在用药后第1天显着降低,ARG治疗组鱼体内病毒滴度显着低于病毒组,且累计存活率比病毒组提高了20%。以上研究证实,ARG可以作为开发抗SVCV药物的先导化合物。2.牛蒡子苷元衍生物抗SVCV活性研究采用EPC细胞体外抗病毒活性筛选模型,对以ARG为先导化合物合成的27种衍生物的构效关系研究发现:18种衍生物具有抗SVCV活性,其中12种为含氮杂环类衍生物;8、20、25和27号衍生物IC50值低于ARG（0.81μM）,27号衍生物4-（2-甲基咪唑）辛氧基牛蒡子苷元（MON）的IC50值最小,为0.18μM,抗病毒活性最佳。通过MON注射给药的方法证实了其在体抗病毒活性优于ARG,MON在SVCV感染后第6天仍具有降低病毒滴度的作用,在脾脏和肾脏中的抗病毒活性维持到第7天,有效改善了SVCV感染引起的组织损伤,且MON治疗组的存活率较SVCV感染组增加了36.7%。由此可见,衍生物MON在细胞水平和个体水平的抗SVCV活性均优于ARG。3.衍生物MON对宿主细胞转录组水平的影响转录组测序（RNA-seq）结果发现:（1）与对照组相比,MON处理组共获得10776个差异显着基因,包括4538个上调基因以及6238个下调基因;对比SVCV感染组,MON治疗组共获得10881个差异基因,其中4314个基因上调,6567个基因下调;通过分析上调和下调倍数最高的前20个基因发现:两个对比组（MON处理组与对照组对比,MON治疗组与SVCV感染组对比）中均包含与能量代谢相关的基因,表明MON可能影响宿主细胞早期能量代谢;（2）GO注释结果表明,一系列与细胞周期相关的进程在衍生物MON作用后显着改变;（3）KEGG通路分析发现,衍生物MON作用后的差异表达基因富集的通路中最显着的为细胞周期通路,与能量代谢相关的PPAR通路也在两个对比组中显着富集。以上结果表明MON在SVCV感染初期主要影响细胞周期和能量代谢调控相关的基因和通路。4.衍生物MON对细胞周期和ATP合成调控研究基于转录组学结果,测定衍生物MON对EPC细胞的细胞周期和ATP合成的影响,探究该化合物的抗SVCV作用机制。试验结果显示,MON处理使EPC细胞周期G2/M期细胞比例显着增加,显着抑制SVCV诱导的S期阻滞;MON在处理6 h和12 h均显着抑制EPC细胞ATP合成。采用线粒体呼吸链复合物抑制剂降低ATP合成发现,SVCV诱导的细胞周期S期阻滞和SVCV的增殖均被抑制,表明降低宿主细胞ATP合成能有效抑制SVCV诱导的细胞周期S期阻滞,干扰SVCV增殖。此外,通过构建SVCV N蛋白真核表达质粒p EGFP-SVCV-N并进行细胞转染发现,MON显着地抑制了p EGFP-SVCV-N的表达,表明MON能够影响与细胞周期调控相关的N蛋白的表达,进一步证实了MON对细胞周期的调控作用。综上,衍生物MON在SVCV复制前期通过降低EPC细胞的ATP合成,抑制SVCV诱导的细胞周期S期阻滞,干扰病毒增殖。5.衍生物MON对SVCV诱导的细胞凋亡调控研究通过细胞荧光染色的方法检测细胞凋亡相关形态学指标发现:SVCV感染诱导EPC细胞凋亡小体形成及微丝微管系统解聚,出现典型的细胞凋亡特征,而衍生物MON处理后,EPC细胞与对照组相比无明显差异,未出现细胞凋亡特征;采用流式细胞术对细胞凋亡的程度检测结果显示:SVCV感染48 h后,43.7%的细胞发生凋亡,经MON处理后,凋亡细胞的比例降低至8.7%;凋亡相关蛋白和酶活性检测结果表明,衍生物MON抑制促凋亡蛋白bax的表达,促进抗凋亡蛋白bcl-2的表达,并有效恢复caspase8,9和3蛋白的表达和酶活性;通过测定呼吸链复合物抑制剂对细胞凋亡的影响发现,MON的抗凋亡作用与其对ATP合成的抑制作用有关;进一步通过病毒释放检测结果显示:细胞上清液中的病毒滴度在MON处理后显着降低,表明MON处理能够减少病毒粒子的释放量。综上,衍生物MON在SVCV复制后期通过抑制SVCV诱导的细胞凋亡发生,减少病毒粒子的释放量。综上所述,以ARG为先导化合物合成的衍生物MON抗SVCV作用机制主要表现为:在病毒复制前期通过降低宿主细胞ATP合成,抑制SVCV诱导的细胞周期S期阻滞,从而干扰病毒增殖;在病毒复制后期通过抑制SVCV诱导的细胞凋亡,减少病毒粒子的释放量。因此,本研究对中草药抗SVCV活性的研究具有重要意义,为抗SVCV新型药物的研发提供了理论依据。
王平[3]（2020）在《SOX30基因在雄性生殖发育毒性中的作用及机制初步研究》文中提出研究背景:近50年以来,人类的平均寿命已得到显着提高,但是生殖健康总体水平却呈现出下降的趋势。根据文献的统计分析,从1973到2011年,全球男性精子总数和密度分别降低约5.33×106个/年和0.7×106/m L.年[1-2];同时临床上各种男性生殖疾病的发病率也在逐渐增加[3-4]。已有的研究表明,基因与环境交互作用是造成男性生殖功能损伤尤其是生精障碍等不孕不育的重要原因之一[5]。其中,邻苯二甲酸酯（PAEs）是人类体液中最常被检出的环境有机污染物,其中又以邻苯二甲酸二丁酯（DBP）为代表受到广泛研究。目前的研究表明,DBP可以诱导雄性生殖损害,DBP暴露后导致睾丸生精细胞早熟脱落和精子数量下降,具有支持、营养和保护生精细胞功能的支持细胞内蛋白骨架解聚是生精细胞早熟脱落的重要节点[6-10]。尽管DBP生殖发育毒性已有大量的研究报道,但其分子机制还未充分阐明。SOX蛋白是一类基因转录调控分子,在生殖细胞的发生、分化和成熟等过程中起重要的调控作用,同时也参与了包括癌症在内的众多疾的发生[11,12]。SOX30基因是最近发现的SOX家族成员,本课题组前期也首次报道,在成体小鼠睾丸中SOX30基因低甲基化而高水平表达,推测SOX30可能在维持正常的雄性生殖功能方面具有重要作用[13]。最新的国内外一些报道也表明SOX30基因是精子形成所必需的,与睾丸发育紧密相关[14-16],但是SOX30基因在生殖系统发育中的功能和机制尚不清楚。此外,在前期研究中,我们发现DBP处理诱导的睾丸病理损伤和生精过程中,SOX30基因表达发生改变,提示SOX30可能在DBP诱导的雄性生殖损伤中发挥作用,但是二者的应答作用和机制还需实验证实。本研究拟通过SOX30基因敲除小鼠模型,分析不同基因型雄性小鼠的各脏器组织的病理特征,评价SOX30在生殖发育中的潜在作用。其次,通过DBP诱导的TM4细胞体外损伤模型及SOX30差异表达TM4细胞模型,探讨SOX30在DBP诱导的TM4细胞增殖抑制中的作用和分子机制。研究方法:1.SOX30基因敲除对雄性小鼠各重要脏器组织形态及生殖功能的影响通过基因重组构建SOX30基因敲除小鼠并进行PCR鉴定基因型,称重各脏器质量并计算脏器指数（包括心、肝、脾、肺、肾、大脑、胸腺、睾丸、附睾和骨髓）,显微观察不同基因型小鼠各脏器组织结构和形态特征,分析SOX30基因敲除对小鼠各脏器发育的作用。重点观察睾丸、附睾组织形态及附睾精子数目,检测睾丸组织激素水平,分析SOX30对生殖功能的影响。2.SOX30在DBP致TM4细胞增殖抑制中的作用及机制体外构建DBP诱导TM4细胞损伤模型,通过CCK8法分析DBP染毒对TM4细胞形态及增殖的影响,流式细胞术（FCM）检测DBP染毒后TM4细胞周期的变化,PCR及WB检测周期相关分子蛋白。通过慢病毒感染和si RNA干扰技术构建SOX30差异表达TM4细胞模型,并采用通过FCM、WB和PCR法分别检测SOX30差异表达后TM4细胞周期及相关分子的表达变化。在此基础上,采用FCM法检测DBP处理及SOX30干扰后TM4细胞周期变化,验证DBP通过调控SOX30表达诱导TM4细胞周期阻滞的作用及机制。研究结果:1.SOX30基因敲除可导致雄性小鼠部分脏器病理损伤及生精障碍（1）野生型（WW）、杂合型（KW）和纯合型（KK）雄性小鼠体质量之间未见差异（P>0.05）;KK组小鼠睾丸脏器指数较WW和KW组明显降低（P<0.05）;提示SOX30基因敲除影响雄性小鼠睾丸发育。（2）显微观察一般脏器组织病理形态特征发现,与WW组和KW组比较,KK组雄性小鼠的部分脏器结构和形态发生改变:?大脑神经元及胶质细胞数量减少,胶质纤维结节形成;?肝细胞显着增生;?脾脏红髓增生;（4）骨髓巨核成簇伴小梁旁异常分布。结果提示:SOX30敲除可潜在影响大脑、肝脏、脾脏发育和造血细胞分化。（3）通过对不同基因型雄性小鼠性腺病理形态观察发现,与WW组和KW组比较,KK组雄性小鼠睾丸组织体积和曲细精管直径变小（P<0.05）,曲细精管内生精细胞脱落,可见空泡变性和巨细胞,管腔中央无梭形精细胞;KK组附睾病理和精子涂片中未见精子,提示SOX30敲除可导致小鼠生精障碍。通过ELISA法检测3组基因型雄性小鼠睾丸组织中T和INH-B的水平,结果发现:与WW和KW组比较,KK组小鼠睾丸组织匀浆中T和INH-B显着下降（P<0.05）。表明敲除SOX30可影响小鼠睾丸T和INH-B合成分泌。2.SOX30基因参与DBP诱导的TM4细胞增殖抑制（1）DBP处理可诱导TM4细胞G1期阻滞通过CCK8法实验发现DBP暴露下可显着抑制TM4细胞增殖,且与DBP暴露诱导TM4细胞G1期阻滞有关;PCR检测发现DBP处理后细胞周期调控分子CDK2、CDK6下降,SOX30表达量明显上调（P<0.05）。提示DBP处理可诱导TM4细胞G1期阻滞,SOX30、CDK2、CDK6等是候选的调控分子之一。（2）干扰SOX30基因表达可部分恢复DBP诱导的TM4细胞G1期阻滞利用慢病毒感染构建的SOX30过表达TM4细胞模型,发现SOX30过表达可诱导细胞G1期阻滞。PCR和WB验证发现SOX30过表达后细胞周期相关调控分子CDK2和CDK6降低。同时,在si RNA转染的SOX30敲低细胞模型中,我们发现DBP暴露诱导的TM4细胞G1期能够部分恢复,细胞周期分子CDK2和CDK6的表达也显着升高,进一步证实SOX30参与了DBP诱导的TM4细胞G1期阻滞,且CDK2和CDK6是SOX30发挥调控作用的重要分子。结论:1.SOX30敲除可导致小鼠大脑、肝脏、脾脏出现病理损伤,并导致骨髓造血细胞分化发育异常,提示SOX30基因可能在大脑、脾脏和骨髓造血中具有重要的调控作用,可能参与多种脏器的功能调节。2.SOX30敲除可导致小鼠睾丸组织病理损伤、睾丸T和INH-B激素合成分泌异常并导致精子生成障碍,提示SOX30基因在小鼠睾丸发育及生精过程中具有重要作用,3.SOX30参与调控DBP诱导的TM4细胞G1期阻滞,CDK2和CDK6是SOX30参与调控通路中的重要下游分子。
康宇[4]（2020）在《非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究》文中研究表明哺乳动物的胚胎早期发育开始于精子和卵子融合形成合子,之后经历卵裂、囊胚孵化、子宫定植等过程最终发育为完整个体。胚胎植入前发育的过程中会发生一系列重要的生物学事件,如母源——合子转化、合子基因激活、细胞谱系分化等。这些事件的有序发生均依赖于细胞内复杂的分子调控机制,并且极易受到环境应激因素的影响,如高温和内分泌干扰素都会干扰发育中的配子和胚胎正常发育,甚至产生可遗传的表观遗传变异。非人灵长类（NHPs）由于与人类极高的相似性,对其植入前胚胎发育机制的研究有助于解答人类早期胚胎发育的重要问题,同时,非人灵长类也是人类疾病研究的重要动物模型。本论文以猕猴和食蟹猴为对象,利用体外受精技术,开展植入前胚胎发育的转录调控机制和转化研究。研究通过收集猕猴植入前胚胎各个发育阶段的胚胎单细胞样本进行转录组测序,建立了完整的猕猴体外受精胚胎植入前发育转录组图谱。之后经过深入分析胚胎植入前发育过程的转录调控模式,发现灵长类早期胚胎发育中存在转录阻滞现象,桑葚胚时期的胚胎中有部分细胞的转录组停滞在合子基因激活之前阶段。在研究中还构建了体细胞核移植胚胎和单性生殖胚胎,这两类胚胎是研究合子基因组重编程机制及父源/母源印记基因调控的重要材料,通过获取这些胚胎的植入前发育单细胞转录组数据并与正常体外受精胚胎进行比较,发现体细胞核移植（SCNT）和单性生殖（孤雄/孤雌）胚胎的转录模式存在更为普遍的延迟,分析表明这种延迟主要是由异常的表观遗传修饰而导致的合子基因组激活不完全,胚胎发育率下降。通过外源手段消除体细胞核移植胚胎异常的H3K9me3,可以提高体细胞核移植胚胎发育率并且获得克隆动物。非人灵长类是研究人类疾病的理想动物模型。本论文利用CRISPR/Cas9技术进行了食蟹猴植入前胚胎的靶向基因编辑,获得DAX1基因突变猴模型。模型动物出现人类患者肾上腺发育不全（AHC）和低促性腺素性功能减退症（HH）的相关表型,经分析发现Wnt/β-catenin信号通路的异常激活导致的血管发生缺陷可能是DAX1基因突变胎儿时期肾上腺发育不良的主要原因。研究同时发现雄性食蟹猴DAX1缺陷导致的肾上腺和性腺发育缺陷在胎儿期性腺决定阶段就已经开始。通过食蟹猴植入前胚胎的干细胞嵌合实验,证明了非人灵长类胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（i PS）和体细胞核移植来源的胚胎干细胞（NT-ESC）都可以实现食蟹猴胚胎和成体水平嵌合,并且具有三胚层及胚外组织分化潜能。通过收集分析嵌合胚胎的单细胞转录组数据发现,食蟹猴多能干细胞的胚胎嵌合效率差异与其自身的多能性状态密切相关,并且受到嵌合胚胎微环境的调控。综上,本论文研究了非人灵长类胚胎早期发育的转录调控,并构建了疾病动物模型以及嵌合体,从而开展疾病机制和干细胞多能性研究。首次绘制了完整的灵长类植入前发育转录图谱,是对灵长类早期发育调控研究领域的重要补充;利用CRISPR/Cas9技术构建的疾病猴模型表现了其它物种不能出现的、与病人高度相似的表型,是人类复杂疾病研究的理想动物模型。
刘翔宇[5]（2020）在《miR-195-5p在卵巢癌中的作用与机制研究》文中研究表明背景:卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,其发病率低于宫颈癌、子宫内膜癌,但卵巢癌的病死率显着高于另外两种肿瘤。在过去十年中卵巢癌的治疗方法虽有所发展,但由于早期阶段卵巢癌患者没有明显的症状,患者就诊时多已发生肿瘤的局部播散及远处转移,故卵巢癌患者的5年总生存率仍然较低,仅为30%-40%。卵巢癌的发生和发展是一个多阶段的过程,近年来,越来越多的研究表明micro RNA（miRNA）在卵巢癌的进展和转移等过程中发挥重要的调节作用,参与了肿瘤细胞增殖、凋亡、血管生成、迁移、侵袭和转移等过程,其中miR-195-5p被证实与多种肿瘤有关,但在卵巢癌中的作用及机制鲜有报道。目的:本研究旨在探究miR-195-5p能否调控卵巢癌的恶性生物学行为,进而深入分析可能的分子机制,即miR-195-5p通过调节下游靶基因影响卵巢癌的增殖、转移,从而为卵巢癌的治疗提供新策略,为卵巢癌提供新的预后预测指标。方法:1、收集天津医科大学附属肿瘤医院2017年10月至2018年12月之间卵巢癌患者行手术切除的上皮性卵巢癌组织标本共50例,同时收集正常卵巢组织标本50例,并培养正常卵巢细胞系（IOSE80）、卵巢癌细胞系（SKOV3、OVCAR3、A2780、ES-2）,通过实时定量PCR（q RT-PCR）技术观察、分别比较miR-195-5p在卵巢癌组织与正常卵巢组织、卵巢癌细胞系与正常卵巢细胞系中的表达情况。2、在miR-195-5p表达水平相对低的SKOV3细胞系中利用慢病毒构建稳定过表达miR-195-5p的细胞株,在miR-195-5p表达水平相对高的A2780细胞系中转染miR-195-5p inhibitor抑制内源性miR-195-5p表达,采用MTT、克隆形成、Ed U等细胞学实验观察miR-195-5p对卵巢癌细胞系增殖能力的影响;采用Transwell、划痕实验等方法观察miR-195-5p对卵巢癌细胞迁移能力的影响;通过流式细胞学技术,分析卵巢癌细胞系中过表达miR-195-5p后细胞周期的分布特点;通过小鼠体内成瘤实验,观察过表达miR-195-5p后小鼠体内移植瘤的生长情况。3、采用生物信息学方法预测miR-195-5p调控的靶基因,采用双荧光素酶报告系统分析miR-195-5p与其潜在靶基因--细胞分裂周期相关蛋白4（Cell Division Cycle-Associated protein 4,CDCA4）的靶向调控关系。q RT-PCR方法检测miR-195-5p和CDCA4在miR-195-5p过表达卵巢癌细胞系及对照组中的表达,同方法对比miR-195-5p和CDCA4在miR-195-5p低表达卵巢癌细胞系及对照组中的表达。Western Blotting方法检测miR-195-5p过表达/低表达卵巢癌细胞系中CDCA4的表达水平。在SKOV3细胞中采用Western Blotting方法检测miR-195-5p过表达组、miR-195-5p及CDCA4均过表达组、control三组中cyclin D1、p16的表达,细胞功能学实验明确三组细胞增殖能力的差异。4、q RT-PCR技术检测上皮性卵巢癌组织中miR-195-5p的表达水平、免疫组化方法检测卵巢癌组织中CDCA4的表达水平,分析miR-195-5p、CDCA4表达水平与卵巢癌临床病理学特征的关系;采用Kaplan-Meier法进行生存分析。结果:1、miR-195-5p在卵巢癌组织及卵巢癌细胞系中的表达下调卵巢癌组织中miR-195-5p的表达显着低于在正常卵巢组织中的表达,差异有统计学意义（P<0.001）,与卵巢正常细胞系（IOSE80）相比,miR-195-5p在卵巢癌细胞系中的表达均降低,差异有统计学意义（P<0.01）。2、miR-195-5p抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移体外实验显示,过表达miR-195-5p可抑制卵巢癌细胞的增殖及迁移;流式细胞学检测结果显示miR-195-5p的过表达可使细胞周期阻滞在G1期,减慢了其细胞周期进程。体内实验表明:过表达miR-195-5p的小鼠种植瘤,其体积及重量较对照组均降低。3、在卵巢中CDCA4是miR-195-5p的靶基因Starbase数据库显示CDCA4是miR-195-5p的潜在靶基因,继而使用双荧光素酶报告系统发现CDCA4 3’-UTR的活性能被miR-195-5p降低,进一步结合使用位点突变技术发现miR-195-5p结合位点突变的CDCA4 3’-UTR活性不能被miR-195-5p降低。卵巢癌细胞系中CDCA4的表达水平与miR-195-5p呈负相关,miR-195-5p通过对CDCA4的调节作用抑制卵巢癌细胞的增殖及迁移,过表达CDCA4后可逆转miR-195-5p对卵巢癌细胞的抑制增殖作用。4、miR-195-5p、CDCA4表达水平与卵巢癌临床病理学特征的关系miR-195-5p在卵巢癌中的表达水平与有无淋巴结转移、组织学分级、FIGO分期有关,CDCA4在卵巢癌中的表达与病灶大小、组织学分级有关,miR-195-5p高表达的卵巢癌患者预后较好,CDCA4高表达的卵巢癌患者预后更差,miR-195-5p、FIGO分期是上皮性卵巢癌患者的独立预后因素。结论:上述研究表明:miR-195-5p在卵巢癌组织及卵巢癌细胞系中呈下调表达,miR-195-5p能够抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移能力,并且证实miR-195-5p可下调其靶基因CDCA4的表达从而抑制卵巢癌细胞的增殖、使细胞周期阻滞在G1期。在卵巢癌组织中miR-195-5p、CDCA4的表达与卵巢癌的组织学分级、生存状况等呈现显着的相关性。综上所述,miR-195-5p/CDCA4轴提供了一种解释卵巢癌疾病进展的机制,可成为卵巢癌诊断、治疗的潜在靶点,为卵巢癌临床治疗提供理论依据。
徐增伟[6]（2020）在《Notch3表达异常影响胎盘滋养细胞分化的检测分析与调控机制研究》文中进行了进一步梳理合体滋养细胞作为母胎屏障的重要组成部分,承担母胎间营养、气体交换和激素分泌等生物学功能,在维持正常妊娠的过程中扮演重要角色。Notch信号在人干细胞生态位的自我更新和分化,决定细胞命运发挥重要作用。Notch3作为Notch信号通路受体蛋白,亦可决定人胎盘滋养细胞命运,但其在人胎盘合体滋养细胞分化中的作用,以及此生物过程调控异常是否参与子痫前期的发生,目前均不明确。本研究利用人早孕绒毛、足月胎盘组织、原代滋养细胞（Primary Human Trophoblast,PHT）及BeWo细胞合体化模型,采用IFC、IHC、Western blot及qRT-PCR等检测技术,验证Notch3在人胎盘滋养细胞中的表达模式,明确Notch3在滋养细胞合体化过程中的作用;采用血清饥饿法阻滞BeWo细胞周期验证细胞周期阻滞对滋养细胞合体化过程的影响;利用缺氧培养BeWo细胞模型验证缺氧对滋养细胞合体化过程的影响;最后利用Ad-N3ICD腺病毒构建体内Notch3过表达孕鼠模型,明确Notch3对孕鼠的影响以及探究Notch3在子痫前期发病中的作用。现研究结果如下:一、Notch3在人胎盘滋养细胞中的表达模式利用人原代滋养细胞体外自发合体化模型、人足月胎盘组织、人早孕绒毛组织及绒毛合体滋养细胞重建组织,采用qRT-PCR、IHC及IFC等检测技术,检测Notch3在人滋养细胞中的表达模式。结果显示:在人原代滋养细胞体外自发合体化模型中,Notch3及其它Notch家族受体及配体mRNA水平均发生下调;Notch3在人早孕绒毛及足月胎盘组织中主要表达于单核的细胞滋养细胞中,在合体滋养细胞中呈低表达;在人早孕绒毛新生合体滋养细胞中,Notch3的表达亦较低。二、Notch3在BeWo细胞合体化过程中的作用利用福斯克林（Forskolin,FSK）体外诱导BeWo细胞合体化,并使用Notch3信号通路抑制剂DAPT直接抑制Notch3胞内结构域（Notch3Intracellular Domain,N3ICD）入核,采用IFC、qRT-PCR及Western blot等检测技术,探究Notch3对BeWo细胞合体化的影响。结果显示:Notch3在BeWo细胞合体化过程中表达下调,并主要表达于单个核的BeWo细胞中,在合体BeWo细胞中表达较低;DAPT处理BeWo细胞后,细胞核内N3ICD水平降低,抑制Notch3信号激活,BeWo细胞合体化能力增强。三、细胞周期阻滞对BeWo细胞合体化过程的影响采用无血清饥饿法培养BeWo细胞诱导细胞周期同步化模型,以阻滞BeWo细胞周期于G1期。利用IFC、qRT-PCR、Western blot及流式细胞术等检测技术,明确BeWo细胞周期阻滞对其合体化过程的影响。结果显示:BeWo细胞经无血清饥饿法培养24 h后,G1期BeWo细胞数量增多,细胞周期成功阻滞于G1期;BeWo细胞周期阻滞后,促进了BeWo细胞合体化进程。四、缺氧对BeWo细胞合体化过程的影响采用缺氧培养BeWo细胞,利用qRT-PCR、Western blot、IFC及ELISA等检测技术探究缺氧经Notch3信号通路对BeWo细胞合体化过程的影响。结果显示:在缺氧条件下（2%O2）培养BeWo细胞并诱导合体化过程中,Notch3表达水平升高,BeWo细胞合体化能力受损;经Western blot检测BeWo细胞核蛋白组分,BeWo细胞核内N3ICD水平在缺氧条件下升高,缺氧增强了N3ICD转移入核的能力;通过ELISA检测BeWo细胞培养基中sFLT1,结果显示:缺氧增加了BeWo细胞合体化过程中sFLT1蛋白的分泌。五、N3ICD过表达小鼠模型呈现人子痫前期特征利用Ad-N3ICD腺病毒构建体内Notch3过表达孕鼠模型,在小鼠怀孕第6天（GD6）通过尾静脉注射腺病毒,通过检测孕鼠孕期血压、尿蛋白、血清中sFLT1水平变化及胎儿体重,明确Notch3对孕鼠妊娠结局的影响及验证Notch3对子痫前期发生的影响。结果显示:于GD6注射Ad-N3ICD后,孕鼠胎盘中N3ICD的mRNA水平升高,成功构建Notch3过表达孕鼠模型;Notch3过表达孕鼠的血压,尿蛋白及血清中sFLT1蛋白水平均于注射Ad-N3ICD后发生上调,GD18天的胎儿体重降低,成功模拟出人子痫前期特征。综合以上结果,本研究发现Notch3在滋养细胞合体化过程中发生表达下调,缺氧通过增加Notch3表达并促进N3ICD入核调控细胞周期,影响滋养细胞自我更新及分化平衡,从而抑制滋养细胞合体化并参与子痫前期发展。
吴燕莉[7]（2020）在《AD少突胶质细胞改变及抗精神病药物对其作用的研究》文中研究指明第一部分APP/PS1转基因AD小鼠海马内少突胶质细胞的改变目的:定量研究APP/PS1转基因AD小鼠海马内少突胶质细胞（OLG）的改变,检测海马内髓鞘形成蛋白、OLG发育相关蛋白以及机制相关蛋白（Lingo1、MAG、MOG、GSK-3β、p-ser9-GSK3β）的表达情况,为后续的研究提供依据,为今后寻找延缓AD的手段提供有效的靶点。方法:随机选取10月龄雄性APP/PS1转基因AD小鼠（AD组）和10月龄雄性同窝生野生型小鼠（WT组）各13只。运用Morris水迷宫测试来评估各组小鼠的空间学习和记忆能力。记录逃避潜伏期作为空间学习记忆能力的评估指标,记录穿台次数和目标象限游泳时间百分比作为空间记忆能力的评估指标。运用免疫组织化学技术及无偏体视学方法定量研究各组小鼠海马CA1、CA2-3和齿状回（DG）内少突胶质细胞系（Olig2+细胞）和成熟OLG（CNPase+细胞）数量的变化。对各组小鼠海马内OLG的总数与其空间学习记忆能力进行相关性分析。运用蛋白质印迹法（Western Blot）检测OLG发育相关蛋白（CNPase、MBP、NG2）以及机制相关蛋白（Lingo1、MAG、MOG、GSK-3β、p-ser9-GSK3β）的蛋白水平。运用免疫组织化学技术定性研究各组小鼠海马内老年斑的含量,运用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量可溶性Aβ的水平。运用免疫荧光结合激光共聚焦技术计数各组小鼠海马CA1、CA2-3和DG内表达衰老蛋白P16的少突胶质细胞系（P16+/Olig2+细胞）的比例。结果:1.Morris水迷宫测试结果显示AD组小鼠逃避潜伏期显着性长于WT组小鼠（P<0.05）,穿台次数显着性少于WT组小鼠（P<0.05）,AD组小鼠的目标象限游泳时间百分比与WT组小鼠相比没有显着性差异（P>0.05）。AD组小鼠海马CA1、CA2-3和DG内Olig2+细胞总数均较WT组小鼠显着性增加（P<0.05）,且与逃避潜伏期呈正相关,与穿台次数呈负相关;AD组小鼠海马各区CNPase+细胞总数均较WT组小鼠显着性减少（P<0.05）,且与逃避潜伏期呈负相关。2.Western Blot结果显示AD组小鼠海马内OLG发育相关蛋白MBP（21k Da）、CNPase的蛋白水平显着性低于WT组小鼠（P<0.05）。WT组小鼠和AD组小鼠海马内MBP（17k Da）、NG2的蛋白水平没有显着性差异（P>0.05）。AD组小鼠海马内OLG机制相关蛋白Lingo1的蛋白水平显着性高于WT组小鼠（P<0.05）。WT组小鼠和AD组小鼠海马内MAG、MOG的蛋白水平没有显着性差异（P>0.05）。与WT组小鼠相比,AD组小鼠海马内GSK-3β的蛋白水平显着性增高（P<0.05）、p-ser9-GSK3β的蛋白水平显着性降低（P<0.05）。3.Aβ老年斑定性观察结果显示在WT组小鼠的海马中未发现淀粉样蛋白斑块,在AD组小鼠的海马中观察到许多大的淀粉样蛋白斑块。ELISA结果显示AD组小鼠海马中Aβ40、Aβ42淀粉样蛋白的浓度显着性高于WT组小鼠（P<0.05,P<0.05）。免疫荧光定性结果显示AD组小鼠海马各区（CA1、CA2-3和DG）内的P16+/Olig2+细胞分布较WT组小鼠密集,定量结果显示AD组小鼠海马CA2-3区和DG区内P16+/Olig2+细胞比例显着性大于WT组小鼠（P<0.05,P<0.05）,WT组小鼠和AD组小鼠海马CA1区P16+/Olig2+细胞比例没有显着性差异（P>0.05）。结论:1.10月龄APP/PS1转基因AD小鼠存在空间学习和记忆能力损害。2.AD小鼠海马内少突胶质细胞系（Olig2+细胞）数量增加,成熟OLG（CNPase+细胞）数量减少,提示AD小鼠海马内OLG的增殖、分化或成熟过程可能存在异常,且可能存在成熟OLG的损伤。3.AD小鼠海马内OLG的数量改变与其空间学习和记忆能力相关,且可能是空间学习记忆能力障碍的重要原因之一。4.AD小鼠海马内OLG成熟相关蛋白MBP、CNPase的蛋白水平减少,而增殖相关蛋白NG2没有显着性改变,提示AD小鼠海马内OLG主要存在成熟障碍。在AD小鼠海马内髓鞘抑制因子MAG和MOG的蛋白表达量没有显着性改变,但是Lingo1却存在高表达,提示Lingo1的高表达可能是AD小鼠海马内OLG成熟障碍的原因之一。GSK-3β的表达水平增高以及活性增强,进一步提示高表达的Lingo1可能导致下游GSK-3β的高表达和高活性,进而对OLG的成熟产生抑制作用。5.AD小鼠海马内表达P16的少突胶质细胞系增多,提示AD小鼠海马内OLG存在过多衰老表型,这可能是OLG无法正常成熟的重要原因之一。6.AD小鼠海马内存在Aβ老年斑的大量沉积以及可溶性Aβ水平大量增加,提示Aβ可能是导致OLG损伤的重要原因。成熟OLG的损伤及OLG的发育异常可能是AD海马内OLG/髓鞘改变的启动因子,同时也是AD认知功能改变的重要结构之一。第二部分AD少突胶质细胞改变的体外研究目的:体外探讨OLG是否在AD的超早期就已经存在改变,以及Aβ对AD少突胶质细胞的影响。方法:APP/PS1转基因或C57小鼠新生乳鼠取脑后进行体外原代少突胶质前体细胞（OPCs）培养,以及小鼠来源OPC细胞株（MOPC）的传代培养。APP/PS1转基因AD小鼠新生乳鼠原代OPCs纯化培养,经鼠尾基因型鉴定后,分为APP/PS1（-）组和APP/PS1（+）组,运用流式细胞术（FCM）检测各组原代OPCs的细胞周期与细胞凋亡变化情况,再通过Western Blot检测各组原代OPCs中OLG发育相关蛋白（CNPase、Olig2、NG2）以及机制相关蛋白（MAG、MOG、GSK-3β、p-ser9-GSK3β、P16、P21）的蛋白水平。传代培养的MOPC分为三组:Control组、0.5μM Aβ组、1μM Aβ组,运用FCM检测各组MOPC的细胞周期与细胞凋亡变化情况,然后运用real time RT-PCR检测Control组和0.5μM Aβ组MOPC中OLG发育相关蛋白NG2的m RNA水平,再通过Western Blot检测Control组和0.5μM Aβ组MOPC中OLG发育相关蛋白（NG2、PDGFRα）以及机制相关蛋白（MAG、MOG、P16、P21）的蛋白水平。纯化后的C57小鼠原代OPCs分为三组:C57+Control组、C57+0.5μM Aβ组、C57+1μM Aβ组,运用FCM检测各组原代OPCs的细胞周期与细胞凋亡变化情况。结果:1.APP/PS1转基因AD小鼠脑内原代OPCs的改变。FCM结果显示:与APP/PS1（-）组相比,APP/PS1（+）组小鼠脑内原代OPCs的G1期细胞比例显着性降低（P<0.05）、S期显着性增高（P<0.05）、G2/M期无显着性差异（P>0.05）,总细胞凋亡率显着性降低（P<0.05）、活细胞比例显着性增高（P<0.05）。Western Blot结果显示:APP/PS1（+）组小鼠脑内原代OPCs中发育相关蛋白CNPase的蛋白水平显着性低于APP/PS1（-）组（P<0.05）,Olig2和NG2的蛋白水平显着性高于APP/PS1（-）组（P<0.05,P<0.05）。APP/PS1（+）组小鼠脑内原代OPCs中机制相关蛋白MAG的蛋白水平显着性高于APP/PS1（-）组（P<0.05）,MOG的蛋白水平与APP/PS1（-）组相比无显着性差异（P>0.05）。与APP/PS1（-）组相比,APP/PS1（+）组GSK-3β的蛋白水平显着性增高（P<0.05）、p-ser9-GSK3β的蛋白水平显着性降低（P<0.05）。APP/PS1（+）组衰老蛋白P16的蛋白水平显着性高于APP/PS1（-）组（P<0.05）,APP/PS1（-）组和APP/PS1（+）组P21的蛋白水平无显着性差异（P>0.05）。2.Aβ对MOPC细胞株的影响。FCM结果显示:与Control组相比,0.5μM Aβ组MOPC的G1期细胞比例显着性减少（P<0.05）、S和G2/M期显着性增多（P<0.05,P<0.05）,1μM Aβ组MOPC的G1期细胞比例显着性减少（P<0.05）、S和G2/M期无显着性差异（P>0.05,P>0.05）。与Control组相比,0.5μM Aβ组MOPC的晚期和总细胞凋亡率显着性增高（P<0.05,P<0.05）、早期凋亡率无显着性差异（P>0.05）,1μM Aβ组MOPC的早期、晚期和总细胞凋亡率均无显着性差异（P>0.05,P>0.05,P>0.05）。real time RT-PCR结果显示:0.5μM Aβ组MOPC中NG2的m RNA水平显着性低于Control组（P<0.05）。Western Blot结果显示:与Control组相比,0.5μM Aβ组MOPC中NG2的蛋白水平显着性增高（P<0.05）,PDGFRα的蛋白水平无显着性差异（P>0.05）。Control组和0.5μM Aβ组MOPC中MAG、MOG、P16和P21的蛋白水平无显着性差异（P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05）。3.Aβ对C57小鼠脑内原代OPCs的影响。FCM结果显示:与C57+Control组相比,C57+0.5μM Aβ组小鼠脑内原代OPCs的G1、S和G2/M期细胞比例均无显着性差异（P>0.05,P>0.05,P>0.05）,C57+1μM Aβ组的G1期细胞比例显着性减少（P<0.05）、S期显着性增多（P<0.05）、G2/M期无显着性差异（P>0.05）。与C57+Control组相比,C57+0.5μM Aβ组小鼠脑内原代OPCs的早期、晚期和总细胞凋亡率均无显着性差异（P>0.05,P>0.05,P>0.05）,C57+1μM Aβ组的早期、晚期和总细胞凋亡率也均无显着性差异（P>0.05,P>0.05,P>0.05）。结论:1.APP/PS1转基因AD小鼠脑内原代OPCs的增殖增加、凋亡减少,提示OPCs的异常增殖和凋亡减少可能是AD小鼠少突胶质细胞系异常增加的原因之一。AD小鼠脑内原代OPCs表达少突胶质细胞成熟标记物CNPase减少,然而少突胶质细胞增殖相关蛋白Olig2和NG2的蛋白水平增高,提示AD小鼠脑内原代OPCs可能存在异常增殖和分化成熟障碍。AD小鼠脑内原代OPCs的MAG表达增多,且GSK-3β表达水平增高以及活性增强,提示AD小鼠脑内原代OPCs的成熟可能受到抑制。AD小鼠脑内原代OPCs表达P16增加,与体内结果一致。2.低浓度的Aβ1-42导致MOPC过度增殖、凋亡增加,而高浓度的Aβ1-42对MOPC的增殖和凋亡没有显着影响,提示不同浓度的Aβ对MOPC的影响不同,而低浓度的Aβ对MOPC的损伤更强,在引起MOPC过度激活、增殖增多的同时,也会对MOPC造成损伤。低浓度的Aβ1-42干预后MOPC中PDGFRα蛋白含量无差异,NG2蛋白含量增加且其m RNA水平反应性降低,提示MOPC增殖可能增加。低浓度的Aβ1-42并不影响MOPC表达MAG、MOG、P16和P21。3.低浓度的Aβ1-42对C57小鼠原代OPCs的增殖和凋亡没有显着影响,而高浓度的Aβ1-42导致C57小鼠原代OPCs过度增殖,提示不同浓度的Aβ对原代OPCs的影响不同,而高浓度的Aβ对原代OPCs的损伤更强,同时也表明与原代OPCs相比MOPC对Aβ的损伤作用更敏感。高浓度的Aβ1-42对C57小鼠原代OPCs的凋亡没有影响,提示Aβ对正常小鼠原代OPCs的影响主要是过度激活,而非引起细胞凋亡。第三部分抗精神病药物对AD少突胶质细胞作用的初步探讨目的:在体外初步探讨抗精神病药物（氟西汀和喹硫平）对AD少突胶质细胞的作用,为寻找预防及治疗AD的可能药物提供有效的体外科学依据。方法:MOPC传代培养,待细胞汇合至50%左右,给予两种浓度的Aβ1-42（0.5μmol/L、1μmol/L）作用24 h后,再对每组细胞分别进行氟西汀（FLX,5μmol/L）和喹硫平（QUE,0.5μmol/L）药物干预,共分为九组:Control组、0.5μM Aβ组、1μM Aβ组、MOPC+FLX组、MOPC+0.5μM Aβ+FLX组、MOPC+1μM Aβ+FLX组、MOPC+QUE组、MOPC+0.5μM Aβ+QUE组、MOPC+1μM Aβ+QUE组,24 h后收集各组细胞,通过FCM检测各组MOPC的细胞周期与细胞凋亡变化情况。C57小鼠原代OPCs培养,待细胞汇合至50%左右,给予1μmol/L Aβ1-42作用24 h后,再对每组细胞分别进行FLX（5μmol/L）和QUE（0.5μmol/L）药物干预,共分为六组:C57+Control组、C57+1μM Aβ组、C57+FLX组、C57+1μM Aβ+FLX组、C57+QUE组、C57+1μM Aβ+QUE组,24 h后收集各组细胞,通过FCM检测各组原代OPCs的细胞周期变化情况。结果:1.与Control组相比,MOPC+FLX组MOPC的G1期细胞比例显着性增多（P<0.05）、S和G2/M期显着性减少（P<0.05,P<0.05）,早期、晚期和总细胞凋亡率均显着性降低（P<0.05,P<0.05,P<0.05）。与0.5μM Aβ组相比,MOPC+0.5μM Aβ+FLX组MOPC的G1期细胞比例显着性增多（P<0.05）、S期显着性减少（P<0.05）,G2/M期无显着性差异（P>0.05）,早期、晚期和总细胞凋亡率均显着性降低（P<0.05,P<0.05,P<0.05）。与1μM Aβ组相比,MOPC+1μM Aβ+FLX组MOPC的G1、S和G2/M期细胞比例均无显着性差异（P>0.05,P>0.05,P>0.05）,早期凋亡率显着性增高（P<0.05）,而晚期和总细胞凋亡率均无显着性差异（P>0.05,P>0.05）。2.与C57+Control组相比,C57+FLX组小鼠脑内原代OPCs的G1期细胞比例显着性增多（P<0.05）、G2/M期显着性减少（P<0.05）、S期无显着性差异（P>0.05）。与C57+1μM Aβ组相比,C57+1μM Aβ+FLX组原代OPCs的S期细胞比例显着性减少（P<0.05）、G1和G2/M期无显着性差异（P>0.05,P>0.05）。3.与Control组相比,MOPC+QUE组MOPC的G1和S期细胞比例无显着性差异（P>0.05,P>0.05）、G2/M期显着性增多（P<0.05）,早期凋亡率显着性增高（P<0.05）、晚期凋亡率显着性降低（P<0.05）、总细胞凋亡率无显着性差异（P>0.05）。与0.5μM Aβ组相比,MOPC+0.5μM Aβ+QUE组MOPC的G1期细胞比例显着性增多（P<0.05）、S期显着性减少（P<0.05）、G2/M期无显着性差异（P>0.05）,早期凋亡率显着性增高（P<0.05）、晚期和总细胞凋亡率均显着性降低（P<0.05,P<0.05）。与1μM Aβ组相比,MOPC+1μM Aβ+QUE组MOPC的S期细胞比例显着性减少（P<0.05）、G1和G2/M期无显着性差异（P>0.05,P>0.05）,早期凋亡率显着性增高（P<0.05）、晚期和总细胞凋亡率均显着性降低（P<0.05,P<0.05）。4.与C57+Control组相比,C57+QUE组小鼠脑内原代OPCs的G1、S和G2/M期细胞比例均无显着性差异（P>0.05,P>0.05,P>0.05）。与C57+1μM Aβ组相比,C57+1μM Aβ+QUE组原代OPCs的G1期细胞比例显着性增多（P<0.05）、S期显着性减少（P<0.05）、G2/M期无显着性差异（P>0.05）。结论:FLX和QUE干预后MOPC的增殖减少、凋亡减少,提示FLX和QUE能够减轻Aβ对MOPC的过度刺激,抑制MOPC的增殖,同时也能够在一定程度上减轻Aβ对MOPC的损伤。2.FLX和QUE干预后C57小鼠原代OPCs的增殖减少,提示FLX和QUE能够在一定程度上减轻Aβ对正常小鼠原代OPCs的过度刺激,抑制OPCs的增殖。3.FLX和QUE对AD脑内少突胶质细胞可能具有保护作用。
牛长敏[8]（2020）在《Stra8在精子发生中的作用及机制研究》文中指出视黄酸（Retinoic Acid,RA）是调节生精细胞发育,进入减数分裂和精子释放的重要信号分子。Stra8（Stimulated by retinoic acid gene 8）为RA诱导反应基因,是精原细胞分化和减数分裂启动的标记因子,与男性少精子症和无精子症相关,其基因敲除（KO）雄性小鼠不育,精子发生阻滞,生精小管中缺乏减数分裂后生精细胞,减数分裂细胞周期S期异常,老年KO小鼠睾丸增大,睾丸中生精小管结构破坏,累积大量的未分化精原细胞。成功的精子发生依赖于基因表达的精确调控,Stra8是稳定持续精子发生所必须的,但其在精子发生中确切的调控机制仍然不清楚。为了探索Stra8在精子发生过程中的作用机制和调控网络,本论文从下述三个部分展开研究。第一部分:Stra8与Setd8相互作用调控精子发生的机制研究目的:探索Stra8与Setd8的相互作用调控精子发生过程中减数分裂的分子机制。方法:运用双荧光素酶报告基因实验分析Stra8与Setd8之间的转录调控关系,CHIP实验明确Setd8对Stra8转录调控结合位点;利用免疫共沉淀技术分析Stra8和Setd8相互作用的关键区域,以及Pcna与Stra8之间的相互作用关系;生精细胞系中,过表达Stra8和Setd8分析两者在生精细胞系中的表达特征;构建Stra8动态表达小鼠模型（维生素A缺乏模型和维生素A恢复模型）,qRT-PCR、Western Blot和免疫组织荧光染色分析Stra8动态变化过程中Setd8,H4K20mel和Pcna的表达模式;qRT-PCR检测Stra8动态变化对细胞周期因子（Cyclin A2和Cyclin E2）和S期泛素化因子（Cu14A、Ddb1、Cdt1和Dtl）表达的影响,应用11dpp Stra8 KO小鼠对差异表达的细胞周期相关因子和泛素化相关因子的进行表达验证。结果:双荧光素酶报告基因实验和CHIP实验显示Setd8负性调节Stra8启动子的转录活性,其直接结合于Stra8基因近端启动子区域（-1364 bp）,特别是包含Ebox1,Ebox2,Ebox3,DMRT1bs,RARE（DR2）,RARE（DR4）结构域的区域,Stra8 作为转录因子,亦可以剂量依赖性的方式增加Setd8启动子活性。免疫共沉淀分析显示Stra8、Setd8和Pcna三者可以相互作用,Stra8截短片段F1R2（1-193 aa）（包含一段富含谷氨酸（GA-rich）无自激活活性的的区域（143-193 aa））可以和Setd8截短片段F1R2（1-213 aa）和F2R1（214-350 aa）相互作用。RA诱导P19细胞表达Stra8后,Setd8表达降低,H4K20me1表达增高;P19细胞过表达Setd8时,不能诱导Stra8表达,而RA诱导P19的同时过表达Setd8时,Stra8表达降低,H4K20me1表达增高。成功构建了 Stra8动态表达模型（维生素A缺乏模型和维生素A恢复模型）,Stra8表达水平随着维生素A缺乏时间的延长表达逐渐降低至消失,恢复正常维生素A饮食后Stra8表达水平逐渐恢复至正常水平。Stra8动态表达模型中,Setd8、H4K20me1、Pcna,细胞周期因子（Cyclin A2、Cyclin E2）和泛素化相关因子（Ddb1、Cu14A、Cdt1 和 Dtl）异常表达。Stra8 KO小鼠睾丸中差异表达基因Setd8、Pcna、Cyclin E2和Ddb1的表达水平与Stra8动态表达模型中趋势一致。结论:Setd8蛋白直接结合于Stra8基因的近端启动子区域,负性调节其转录活性。Stra8和Setd8具有生精细胞细胞周期依赖性表达模式,Stra8在有丝分裂向减数分裂细胞周期的转变过程中起重要作用,其与Setd8、Pcna相互作用,且与Setd8、H4K20me1和Pcna共定位于精原细胞。Stra8动态表达模型中,Setd8、H4K20me1、Pcna、细胞周期相关因子和泛素化相关因子异常表达。Stra8和Setd8可能在细胞周期S期以Pcna依赖的方式经CDL4-Clu4A-Ddb1泛素化降解轴相互作用调节精子发生的细胞周期进程。第二部分:Stra8在雄性小鼠减数分裂Ⅰ早期中的作用研究目的:明确Stra8基因敲除（KO）小鼠精子发生阻滞的时期,观察其缺失所致减数分裂Ⅰ前期异常染色体事件,构建Stra8在精子发生中的调控网络,筛选其可能的下游靶基因。方法:利用HE染色和染色质铺展免疫荧光染色对第一个精子发生波中Stra8 KO小鼠进行睾丸组织和精母细胞染色质形态进行分析;分析11dpp Stra8 KO小鼠睾丸RNA测序筛选的差异表达基因的表达模式和信号通路;筛选出Stra8可能直接作用的基因,双荧光素酶报告基因实验、免疫共沉淀和双重免疫荧光染色验证它们之间的相互作用。结果:12dpp时,Stra8 KO睾丸中首次观察到异常的精子发生,随后,Stra8 KO小鼠生精小管中出现大量提前浓缩核的的细胞,精子发生阻滞于早期减数分裂阶段,缺乏减数分裂后生精细胞。精母细胞染色体铺展显示Stra8基因敲除后,精子发生阻滞于细线期,偶线期中晚期和粗线期精母细胞缺失,虽然有少数生精细胞发育至细线期或偶线期早期。KO睾丸中偶线期精母细胞出现异常联会,常染色体上γ-H2ax信号消退较WT慢,粗线期精母细胞染色体不完全联会、异常联会和异常配对,性染色体形成异常,常染色体转录沉默异常。RNA测序和相关文献分析后筛选并验证出15个精子发生相关的差异表达基因,其中Rhox10具有维持精原干细胞池的功能,Utf1、Pou5F1、Upp1、Inca1调节精原细胞的稳定增殖和自我更新,Nanos3和Egr4作用于精原细胞未分化状态的维持,Sohlh1 和 Rhox10 参与精原细胞分化,Prdm9、Msh5、Egr4、Mt15、Ccdc155、Dmc1、Pxt1和Asb9参与减数分裂进程,构建了 Stra8在精子发生中可能的转录调控网络图。分析Stra8 KO睾丸中差异基因的相关表达模式,提示Stra8可能直接与Rhox10、Prdm9、Msh5和Egr4相互作用。Stra8和Rhox10相互转录调控分析显示,Stra8能增加Rhox10启动子转录活性,Rhox10以剂量依赖性模式增加Stra8启动子转录活性;双重免疫荧光染色分析Stra8与Rhox10表达定位,结果显示,在成年小鼠睾丸中Rhox10高表达于精原细胞,精母细胞也有表达,细线前期精母细胞表达较弱,Stra8主要表达于精原细胞和细线前期精母细胞,两者主要共定位于精原细胞。免疫共沉淀进一步验证了 Stra8和Rhox10能够相互作用。结论:Stra8基因敲除小鼠不育,染色体不完全联会、异常联会和异常配对,性染色体形成异常,常染色体转录沉默异常,精子发生阻滞于细线期,偶线期中晚期和粗线期精母细胞缺失。Stra8参与精子发生的多个阶段,包括精原干细胞池的维持,精原细胞增殖、分化和减数分裂,可能通过Rhox10、Prdm9、Msh5和Egr4直接调控精子发生。第三部分:巴戟天多糖和淫羊藿苷在视黄酸诱导的生精细胞分化中的作用研究目的:探讨巴戟天多糖和淫羊蕾苷（ICA）对视磺酸（RA）诱导P19细胞向生精细胞方向分化的影响。方法:使用终浓度1μM、2μM、3μM、4μM、6μM和8μM的RA分别处理P19细胞24h、48h和72h,观察不同RA浓度及不同作用时间对P19细胞及Stra8表达水平的影响。用终浓度 0.0625 mg/L、0.125 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L的巴戟天多糖和 2.5μM/L、5μM/L、7.5μM/L、10μM/L、20μM/L 的 ICA 分别加入 RA 诱导的 P19细胞中处理24h,MTT法检测它们对细胞增殖的影响。选用合适浓度的巴戟天多糖和ICA分别处理RA诱导的P19细胞,分析两者最佳作用时间。流式细胞仪检测巴戟天多糖和ICA对RA诱导的P19细胞凋亡的影响。qRT-PCR和Western Blot检测巴戟天多糖和ICA对RA诱导P19向生精细胞方向分化过程中Oct4、Plzf和Stra8的表达变化。结果:P19细胞在终浓度4μM RA诱导下24h,细胞状态较好,高表达Stra8,因此选用4μM RA 进行下一步实验。终浓度0.125mg/L、0.25mg/L、0.5mg/L、1 mg/L、2 mg/L的巴戟天多糖均可以促进RA诱导的P19细胞增殖,0.5 mg/L的作用浓度时促进增殖效果最佳。终浓度7.5μM/L和10μM/L的ICA可以显着促进RA诱导的P19细胞增殖,7.5μM/L时促进增殖效果更明显。终浓度0.5 mg/L的巴戟天多糖和7.5μM/L的ICA分别处理RA诱导的P19细胞24-72h,相较于对照组,巴戟天多糖处理24h和48h时显着促进细胞增殖,ICA处理24h和48h时均促进P19细胞增殖,24h作用更明显。流式细胞仪检测细胞凋亡率,发现RA诱导的P19细胞的早期凋亡率为2.31%±0.79,加入终浓度0.5mg/L的巴戟天多糖后,凋亡率为2.27%±0.62,两者之间没有统计学差异;RA诱导的P19细胞加入终浓度7.5μM/L ICA后,细胞早期凋亡率为2.32%±0.40,相较于对照组（RA+DMSO）的早期凋亡率2.15%±0.53两者无统计学差异。RA处理P19细胞后,Plzf和Stra8表达水平随着处理时间的延长表达量显着增加后降低,Oct4表达水平随着处理时间的延长表达量显着降低,提示RA诱导P19细胞向生精细胞方向分化。巴戟天多糖干预时,与仅RA处理组相比,Oct4表达水平显着降低,Stra8和Plzf显着增加;ICA干预时,与仅RA处理组相比,Oct4表达水平显着降低,Stra8和Plzf显着增加。结论:P19细胞系是一种多能胚胎癌干细胞系,4μM RA诱导后,P19向生精细胞方向分化,表达Mvh（生精细胞标志物）,c-Kit（分化中的精原细胞标志物）,和Stra8。4μM RA诱导P19细胞同时加入不同浓度的巴戟天多糖和ICA,发现它们均可促进RA诱导的P19细胞增殖,最佳作用浓度分别为0.5mg/L和7.5μM/L,最佳作用时间为24h。流式细胞术进行细胞凋亡分析表明巴戟天多糖和ICA对RA诱导的P19细胞的凋亡没有明显的影响。RA诱导P19细胞一段时间后,Stra8开始表达,随后显着增加,24h达到表达高峰。巴戟天多糖和ICA作用后促进了 RA诱导P19向生精细胞方向的分化进程,Oct4表达降低,Pzlf和Stra8表达显着增加。巴戟天多糖和淫羊藿苷为RA-Stra8通路相关的中药单体,通过RA-Stra8信号促进P19细胞向生精细胞方向增殖和分化。
刘利艳[9]（2020）在《坡模酸及其吡喃葡萄糖酯抗结肠癌作用及机制研究》文中研究表明目的:本研究采用细胞生物学试验观察、网络药理学分析寻找、细胞蛋白质组学筛选、蛋白印迹法检测和整体动物试验验证,探寻巴西甘菊花中抗结肠癌作用的活性单体成分及其作用机制。方法:①MTT法探寻巴西甘菊花中抗结肠癌活性单体成分:巴西甘菊花经化学提取、分离和纯化研究,获得6个含量较多的单体成分,采用MTT法观察单体成分对结肠癌细胞HT-29增殖情况,获取具有抗结肠癌活性的单体作为研究对象。②细胞生物学试验观察确定坡模酸（PA）及其吡喃葡萄糖酯（PAO）的抗结肠癌作用:采用MTT法检测PA抗HT-29细胞增殖情况,倒置显微镜下观察细胞形态变化,细胞计数仪直接读取HT-29细胞存活率;采用Honest 33342染色、AO/EB染色和AnnexinV-FITC/PI流式细胞术观察细胞凋亡情况,PI单染流式细胞术测定细胞周期变化;采用划痕试验观察HT-29细胞迁移情况。③网络药理学分析寻找PA和PAO的作用靶点:利用大数据平台收集PA和PAO潜在作用的靶点以及筛选结肠癌疾病靶点,并将两者预测靶点进行交集,建立预测靶点蛋白相互作用网络;采用富集分析得到靶点生物学功能以及涉及通路情况,最后将PA和PAO分子与核心靶点进行对接来初步确定寻找到的作用靶点。④细胞蛋白质组学探讨PA和PAO可能作用靶点:通过细胞蛋白提取、烷基化、酶解、脱盐、LC-MS上样和差异蛋白初筛等处理,得到差异蛋白,并对差异蛋白进行生物学功能分析和通路分析,最后筛选出与癌症、细胞凋亡和周期相关的差异蛋白。⑤蛋白印迹法检测验证:综合上述体外细胞实验、网络药理学以及蛋白质组学试验结果,采用蛋白印迹法检测PA和PAO对蛋白Bax、Bc12、Caspase 3、Jak1、Stat3、p-stat3和自噬相关蛋白LC3、Beclin1和p62的蛋白相对表达量。⑥整体动物试验验证:采用结肠癌HT-29细胞混悬液皮下注射裸鼠右前肢成瘤作为瘤源,取第二代瘤源进行瘤块接种从而构建异种异位移植瘤模型,第二代肿块接种后第三天开始灌胃给药,每天一次,连续给药21天后,颈椎脱臼处死动物,测定肿瘤体积和肿瘤重量,取肿瘤组织、肝脏组织HE染色,观察其病理变化情况。结果:①从巴西甘菊花分离出的单体成分坡模酸、1-（2-甲基丁酮）-3-异戊烯-间苯三酚、熊果酸和槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷在实验浓度下对HT-29细胞增殖有抑制作用,其中PA抗结肠癌细胞增殖作用最强。②PA和PAO均能呈时间-剂量依赖性抑制HT-29细胞增殖;与对照组相比,给药组HT-29细胞密度更稀疏,排列不紧凑,细胞体型更细长;PA组细胞存活率显着降低;PA和PAO均能显着促进HT-29细胞凋亡,并使HT-29细胞大量阻滞于G0/G1期;均能显着降低细胞迁移率。③网络药理学分析显示PA和PAO的核心靶点分别为ERBB2、PPARG、PTGS2和TNF;MAPK3、STAT3和MTOR,进一步经对接结果显示,PA能与ERBB2、PTGS2、TNF稳定结合;PAO与MAPK3和STAT3稳定结合。初步说明ERBB2、PPARG、PTGS2和TNF;MAPK3、STAT3分别为上述物质作用靶点。④蛋白质组学研究显示PA和PAO作用HT-29细胞后,PA共得到1 1个差异蛋白,其中上调蛋白6个,下调蛋白5个。PAO组得到13个差异蛋白,其中上调蛋白为1个,下调蛋白为12个。两者表达一致的蛋白共有5个,分别为GSTP1、MCM7、mTOR、TAB2和XPO1。这些靶点分别涉及mTOR、自噬相关、细胞周期等信号通路。⑤蛋白印迹实验显示,PA能升高Bax/Bcl2比值,上调Caspase3、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1和p62蛋白相对表达量;对蛋白Jak1表达量无影响,下调Stat3蛋白表达,但无统计学差异,下调p-stat3蛋白相对表达量。PAO亦能升高Bax/Bcl2比值,上调p62蛋白相对表达量;上调Jak1蛋白表达量,下调Stat3、p-stat3蛋白相对表达量。⑥整体动物实验显示,PA和PAO组能显着抑制移植瘤的体积和重量,但不影响瘤重指数和脾脏指数;HE染色显示PA和PAO组肿瘤组织核分裂更不活跃,且存在较多的坏死、肉芽组织和纤维化等炎性改变,但这些病理学结果均无统计学差异。肝组织病理显示均未见模型组和受试药组发生肿瘤肝转移。结论:PA为巴西甘菊花中抗结肠癌细胞增殖的最强的单体成分之一,其抗结肠癌的作用机制可能与上调Bax/Bcl2、Caspase 3的蛋白相对表达量,导致细胞凋亡;上调自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1和p62蛋白相对表达量,促进自噬的发生从而导致细胞死亡有关;PAO抗结肠癌的作用机制与增加Bax/Bcl2、下调Stat3蛋白相对表达量有关。
吴清楠[10]（2019）在《第一部分：APC/C-CDH1调控的TCA循环代谢酶IDH3β促进细胞生长的机制研究 第二部分：肿瘤抗原在食管鳞癌进展中的作用及分子机制研究》文中研究表明细胞分裂是由一系列精密调控的事件组成,而胞内代谢水平与细胞的生存状态紧密相关,因此细胞分裂的不同阶段会引发不同的代谢变化。E3泛素酶后期促进复合物（Anaphase-promoting Complex,APC/C）作为细胞周期重要的中心调控机制,与其共激活因子CDH1和CDC20共同催化周期相关蛋白及时降解,以保证细胞顺利分裂。然而,APC/C不仅调控细胞周期,还被发现能作用于PFKFB3以及GLS1,进而调控肿瘤细胞的糖酵解途径和谷氨酰胺代谢途径,提示APC/C具有连接细胞周期及肿瘤代谢的作用。本课题在2752个代谢酶和转运体中筛选同时含有APC/C结合序列KEN box和D box且在食管鳞癌测序数据中拷贝数变异频率超过20%的基因,得到17个可能受到APC/C调控的酶和转运体。由于APC/C对TCA循环的调控尚未被发现,而我们在食管鳞癌细胞中观察到三羧酸（Tricarboxylic acid cycle,TCA）循环的代谢产物α-酮戊二酸（α-ketoglutarate,α-KG）、延胡索酸及苹果酸与S期具有正相关关系,暗示了细胞周期与TCA循环的潜在联系。因此我们在17个候选蛋白中挑选TCA循环重要的限速酶异柠檬酸脱氢酶3（Isocitrate Dehydrogenase,IDH3）之一的亚基IDH3β作为对象,研究细胞周期对TCA循环的调控作用。我们首先采用Co-IP验证了 IDH3β能够与APC/C发生结合,然后采用不同的周期同步化方法观察到IDH3β具有周期依赖性表达,即IDH3β的蛋白水平在G1后期逐渐积累,在S早期达到最高。通过该现象,我们又采用Co-IP技术以及PLA原位结合技术确定对IDH3β调控的APC/C共激活因子,发现CDH1在G1早期与IDH3β结合,并在G1期作为IDH3β的主要调控因子。此外,IDH3β在APC/C-CDH1的介导下能够发生泛素化降解,当突变结合序列KEN box和D box之后,APC/C-CDH1则无法对突变体进行调控。我们随即对IDH3β的生物学功能进行了研究,采用流式细胞技术以及EDU染色技术,发现IDH3β具有促进细胞G1/S期转换的功能。进一步实验发现,IDH3β能够促进细胞增殖,增强克隆形成能力以及促进裸鼠皮下成瘤,提示IDH3β能够促进食管鳞癌细胞的恶性表型。由于IDH酶是TCA循环的重要限速酶,我们检测到IDH3β亚基能够提高胞内的α-KG、延胡索酸及苹果酸的水平,并且IDH3α和IDH3y亚基也能够上调胞内的α-KG、延胡索酸及苹果酸的水平并促进G1/S期的转换,说明IDH3β作为IDH3亚基能够促进TCA循环的氧化代谢。既然IDH3β能促进生长并且提高底物α-KG的水平,我们通过回补实验发现IDH3β能部分依赖α-KG促进细胞G1/S期转换以及细胞生长。其次,我们还发现IDH3β能提高细胞对葡萄糖的摄取能力,并且上调PFKFB3的表达促进其入核。最后,我们通过免疫组化方法在含有340对人食管鳞癌组织、对应癌旁组织和淋巴结转移组织的芯片中检测IDH3β的表达情况,发现IDH3β在转移的淋巴结组织和癌组织中的含量均高于癌旁组织（P<0.001）,并且IDH3β的高含量与病人的低生存率（包括总生存和无病生存）显着相关（总生存:P=0.011,无病生存:P=0.038）。多变量Cox回归生存模型分析表明IDH3β在总生存中可以作为独立的生存预后因素（总生存:P=0.029,HR=1.484,95%CI:1.041-2.142）。综上所述,本课题发现受到APC/CDH1调控的IDH3β能够通过其催化产物α-KG加快细胞G1/S转换而促进生长,首次揭示了连接TCA循环和细胞周期的双向调控分子机制。本研究还发现IDH3β能促进TCA循环的氧化代谢且对糖酵解关键酶PFKFB3存在调控。最后,IDH3β在食管鳞癌组织及转移的淋巴结组织中高表达,并且与表达量与患者的生存预后显着相关。食管癌是一种常见的消化道肿瘤,超过一半的食管癌发生在中国且食管鳞状细胞癌（简称食管鳞癌）（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC）是主要病理学亚型。由于食管鳞癌极易转移、复发频率也很高,患者即使接受手术联合放化疗的治疗后,仍无法获得良好的预后效果。为了更好地了解食管鳞癌发生和进展的机制,我国迄今为止进行了多项食管鳞癌的全基因组测序分析,共同描绘了食管鳞癌患者基因组改变的情况。这些分析帮助我们全面了解食管鳞癌的发病机制,为改善诊断和提高疗效提供有效的切入点。本课题组前期通过全基因组测序（Whole Genome Sequencing,WGS）、全外显子测序（Whole Exome Sequencing,WES）和比较基因基因组杂交技术（Comparative Genomic Hybridization,CGH）对食管鳞癌患者基因组进行了深入地分析,发现肿瘤抗原MAGE-C3基因具有8.0%的突变率以及8.6%的拷贝数扩增率,提示我们MAGE-C3可能在食管鳞癌的发生发展中发挥重要作用。此外,我们通过公共数据库发现MAGE-C3在多种癌症具有突变和拷贝数扩增的现象,喑示MAGE-C3可能在多个癌种中发挥功能。因此,我们以MAGE-C3为研究对象,采用免疫组化方法在食管鳞癌组织及其邻近正常组织中检测MAGE-C3的蛋白水平。结果显示:癌组织中的MAGE-C3水平明显高于癌旁组织（P<0.001）,同时,MAGE-C3表达水平高的患者表现出更差的预后情况（P=0.042）。此外,我们在分析MAGE-C3的表达水平与临床指标的关系时,发现MAGE-C3的表达水平越高,肿瘤病理分级也越高（P=0.011）,发生淋巴结转移可能性也越大（P=0.034）,这些结果提示我们MAGE-C3可能具有重要的临床意义。在探讨MAGE-C3对食管鳞癌细胞恶性表型的作用中,我们发现MAGE-C3并不影响肿瘤细胞的生长,但却能够促进肿瘤细胞的侵袭及迁移功能,裸鼠尾静脉注射实验中同时也发现MAGE-C3能够提高肿瘤细胞肺转移的能力。为了更深入地了解MAGE-C3在肿瘤细胞中的功能,我们对稳定高表达MAGE-C3的细胞系及其对照细胞系进行转录组测序,并筛选两个样本之间的差异表达基因。通过GO分析我们观察到,过表达MAGE-C3引起差异表达的基因主富集在干扰素（Interferon，IFN）通路。由于II型IFN即IFN-γ在肿瘤中参与重要的免疫调节过程,因此我们将探究MAGE-C3对肿瘤细胞的IFN-γ通路产生的影响。我们首先在食管鳞癌细胞系中选择了对IFN-y较为敏感的KYSE30细胞系,并且发现KYSE30对IFN-γ具有浓度和时间依赖性。根据上一步结果,我们采用最佳的IFN-γ作用浓度和时间（20ng/ml,24h）在KYSE30中探究MAGE-C3对IFN-y通路的作用。实验结果显示:在IFN-γ诱导的情况下,过表达MAGE-C3能明显增加STAT1的701位点磷酸化水平以及包含IFN-γ特有激活位点（Gamma Activation Site,GAS）元件的荧光素酶报告质粒的荧光活性,与IFN-γ协同地提高了经典的IFN-γ/JAK/STAT1通路的激活水平。此外,MAGE-C3可以上调IFN-γ通路下游蛋白PD-L1的mRNA水平和膜表面水平。在上述结果中MAGE-C3能够影响参与免疫调控的IFN-γ通路,因此我们将活化后的健康人外周血淋巴细胞与稳定敲降MAGE-C3的食管鳞癌细胞共培养,并采用流式检测淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤情况,发现共培养后稳定敲降MAGE-C3的细胞凋亡增多,说明MAGE-C3具有保护肿瘤细胞不被淋巴细胞杀伤的作用。我们还将稳定敲降MAGE-C3的食管鳞癌细胞与活化的Jurkat T细胞共培养,采用ELISA检测培养液上清细胞因子水平,发现具有免疫促进功能的TNF-α,及IFN-γ含量上升,而具有免疫抑制功能的IL-10,IL-1β含量下降,说明MAGE-C3可以影响T细胞因子分泌。为了进一步探究MAGE-C3在具有正常免疫机能环境下的作用,我们在黑色素瘤小鼠细胞系B16F10中稳定高表达MAGE-C3,并对免疫系统完全的C57BL/6J小鼠进行尾静脉注射,发现高表达MAGE-C3 可以提高肿瘤细胞的肺转移能力。接着,我们采用免疫组化的方法以及组织分离单细胞染色流式检测的方法,对小鼠肺转移灶中的肿瘤浸润淋巴细胞进行分析。结果,我们在注射了高表达MAGE-C3细胞的肺部中,观察到CD8+T细胞占总T细胞的比例降低（P=0.038）,PD-1+CD8+T细胞占总CD8+T细胞的比例升高（P=0.025）。此外,我们还在差异表达基因中发现MAGE-C3上调VIM的mRNA水平,探索后发现高表达MAGE-C3能提高STAT3的705位点磷酸化水平,同时上调 EMT（Epithelial-MesenchymalTransition）相关分子 Vimentin 的蛋白水平、下调E-cadherin的蛋白水平,提示我们MAGE-C3可能通过EMT方式促进细胞侵袭及迁移。综上,我们从食管鳞癌病人全基因组测序中挑选了具有突变以及拷贝数扩增的肿瘤抗原MAGE-C3进行深入研究,发现其不仅从内部促进细胞EMT过程提高细胞的侵袭能力,还对外部肿瘤微环境发挥免疫抑制功能,最终共同促进了肿瘤的进展。
二、小鼠2-细胞、4-细胞胚胎G_1期检测及同步化的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小鼠2-细胞、4-细胞胚胎G_1期检测及同步化的研究（论文提纲范文）
（1）OSR2在细胞周期阻滞中的作用 ——肾脏缺血再灌注损伤研究新机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 基于GEO数据库结合测序结果分析急性肾损伤的生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 GEO数据分析 |
| 2.1.2 CCK-8 检测细胞活力: |
| 2.1.3 体外AKI模型RNA-seq分析 |
| 2.1.4 DEGs的功能富集分析 |
| 2.1.5 蛋白质相互作用网络的构建 |
| 2.1.6 转录因子的筛选 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 肾脏缺血再灌注前后DEGs |
| 2.2.2 cck-8 筛选不同体外模型的药物浓度 |
| 2.2.3 体外AKI模型DEGs |
| 2.2.4 GSE126805 数据集与体外AKI模型共同DEGs |
| 2.2.5 DEGs的功能富集分析 |
| 2.2.6 蛋白质相互作用网络 |
| 2.2.7 转录因子评分 |
| 第3章 体内外AKI模型验证差异基因表达以及细胞周期和凋亡的验证 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验所需主要溶液配置 |
| 3.1.2 细胞培养 |
| 3.1.3 荧光定量PCR |
| 3.1.4 FUCCI细胞系的构建 |
| 3.1.5 蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 3.1.6 流式细胞术 |
| 3.1.7 Hoechst 33342 染色 |
| 3.1.8 RIRI小鼠构建 |
| 3.1.9 HE染色 |
| 3.1.10 免疫荧光 |
| 3.1.11 统计学分析 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 检测缺氧处理细胞中OSR2 的表达 |
| 3.2.2 FUCCI工具细胞构建 |
| 3.2.3 细胞周期的检测 |
| 3.2.4 细胞凋亡检测 |
| 3.2.5 IRI 4h小鼠肾脏改变 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 细胞周期变化在急性肾损伤的作用 |
| 参考文献 |
（2）牛蒡子苷元衍生物抗鲤春病毒血症病毒活性及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 SVC简介 |
| 1.1.1 SVC的病症和病理变化 |
| 1.1.2 SVC的流行特点 |
| 1.1.3 SVC病原学 |
| 1.1.4 SVC的诊断与防治 |
| 1.2 中草药在病毒性疾病治疗中的应用 |
| 1.2.1 中草药抗病毒的作用机理及途径 |
| 1.2.2 中草药抗病毒活性成分 |
| 1.3 牛蒡子及其活性成分研究 |
| 1.3.1 ARG的抗病毒作用 |
| 1.3.2 ARG的抗肿瘤作用 |
| 1.3.3 ARG的杀虫作用 |
| 1.3.4 ARG的抗炎作用 |
| 1.3.5 ARG的其他药理作用 |
| 1.4 细胞周期及其调控 |
| 1.4.1 细胞周期概述 |
| 1.4.2 细胞周期与能量代谢 |
| 1.4.3 细胞周期与病毒感染 |
| 1.5 细胞凋亡及其意义 |
| 1.5.1 细胞凋亡概述 |
| 1.5.2 细胞凋亡的调控途径 |
| 1.5.3 细胞凋亡与病毒感染 |
| 1.6 选题的目的及意义 |
| 第二章 中草药及活性成分抗SVCV活性研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 中草药及单体化合物 |
| 2.1.2 细胞、病毒和试验鱼 |
| 2.1.3 试剂和仪器 |
| 2.1.4 中草药粗提物的制备及毒性检测 |
| 2.1.5 中草药粗提物抗SVCV活性测定 |
| 2.1.6 牛蒡子主要成分含量测定 |
| 2.1.7 牛蒡子主要成分活性测定 |
| 2.1.8 ARG离体抗SVCV活性测定 |
| 2.1.9 ARG的内酯环功能测定 |
| 2.1.10 细胞中ARG的代谢检测 |
| 2.1.11 ARG在体抗SVCV活性测定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 中草药粗提物抗SVCV活性检测结果 |
| 2.2.2 牛蒡子主要成分的含量检测结果 |
| 2.2.3 牛蒡子主要成分抗SVCV活性结果 |
| 2.2.4 ARG离体抗SVCV活性测定结果 |
| 2.2.5 ARG的内酯环功能测定结果 |
| 2.2.6 细胞中ARG的代谢检测结果 |
| 2.2.7 ARG在体抗SVCV活性测定结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 中草药的抗病毒作用 |
| 2.3.2 ARG的抗病毒作用 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 牛蒡子苷元衍生物抗SVCV活性研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 细胞、病毒和试验鱼 |
| 3.1.2 试剂和仪器 |
| 3.1.3 ARG衍生物 |
| 3.1.4 ARG衍生物的细胞毒性测定 |
| 3.1.5 ARG衍生物抗SVCV活性初筛 |
| 3.1.6 ARG衍生物抗SVCV活性复筛 |
| 3.1.7 MON离体抗SVCV活性测定 |
| 3.1.8 MON抗 MSRV活性测定 |
| 3.1.9 MON在体抗SVCV活性测定 |
| 3.1.10 MON对 SVCV诱导的脾肾损伤的保护作用 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 ARG衍生物毒性测定结果 |
| 3.2.2 ARG衍生物抗SVCV活性初筛结果 |
| 3.2.3 ARG衍生物抗SVCV活性复筛结果 |
| 3.2.4 MON离体抗SVCV活性测定结果 |
| 3.2.5 MON抗 MSRV活性测定结果 |
| 3.2.6 MON在体抗SVCV活性测定结果 |
| 3.2.7 MON对 SVCV诱导的脾肾损伤的保护作用检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 ARG衍生物抗SVCV构效关系 |
| 3.3.2 MON抗水产弹状病毒的作用 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 衍生物MON对宿主细胞转录组水平的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞和病毒 |
| 4.1.2 药物 |
| 4.1.3 试剂和仪器 |
| 4.1.4 MON对 SVCV感染力的作用 |
| 4.1.5 MON对 SVCV感染过程的作用 |
| 4.1.6 转录组样品的制备 |
| 4.1.7 cDNA文库构建及测序数据组装 |
| 4.1.8 基因差异表达分析 |
| 4.1.9 GO和 KEGG网络富集分析 |
| 4.1.10 RT-qPCR验证 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 MON对 SVCV感染力的作用结果 |
| 4.2.2 MON对 SVCV感染过程的作用结果 |
| 4.2.3 MON对宿主细胞转录组水平的影响结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 MON的间接抗病毒作用 |
| 4.3.2 MON作用的信号通路 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 衍生物MON对细胞周期和ATP合成调控研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞和病毒 |
| 5.1.2 药物 |
| 5.1.3 试剂和仪器 |
| 5.1.4 MON对细胞周期的调控作用测定 |
| 5.1.5 MON对 ATP合成的调控作用测定 |
| 5.1.6 呼吸链复合物抑制剂对SVCV作用测定 |
| 5.1.7 BBE对 SVCV作用测定 |
| 5.1.8 SVCV N蛋白真核表达检测 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 MON对细胞周期的调控作用测定结果 |
| 5.2.2 MON对 ATP合成的调控作用测定结果 |
| 5.2.3 呼吸链复合物抑制剂对SVCV作用测定结果 |
| 5.2.4 BBE抗病毒活性检测结果 |
| 5.2.5 SVCV N蛋白真核表达检测结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 MON对细胞周期的调控作用 |
| 5.3.2 MON对能量代谢的调控作用 |
| 5.3.3 MON对 SVCV N蛋白的作用 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 衍生物MON对 SVCV诱导的细胞凋亡调控研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 细胞和病毒 |
| 6.1.2 药物 |
| 6.1.3 试剂和仪器 |
| 6.1.4 细胞形态学检测 |
| 6.1.5 细胞凋亡检测 |
| 6.1.6 凋亡相关蛋白表达检测 |
| 6.1.7 Caspase酶活性测定 |
| 6.1.8 呼吸链复合物抑制剂对细胞凋亡的影响检测 |
| 6.1.9 凋亡抑制剂对SVCV作用检测 |
| 6.1.10 MON对 SVCV病毒粒子释放的作用检测 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 细胞形态学检测结果 |
| 6.2.2 细胞凋亡检测结果 |
| 6.2.3 凋亡相关蛋白及酶活性检测结果 |
| 6.2.4 呼吸链复合物抑制剂对细胞凋亡的影响检测结果 |
| 6.2.5 凋亡抑制剂对SVCV作用检测结果 |
| 6.2.6 MON对 SVCV病毒粒子释放的作用检测结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 MON的抗凋亡作用 |
| 6.3.2 MON的抗凋亡机制 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 总结 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 本研究创新点 |
| 7.3 今后研究重点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）SOX30基因在雄性生殖发育毒性中的作用及机制初步研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 研究内容 |
| 1.3 研究路线 |
| 第二章 SOX30基因敲除对雄性小鼠脏器发育和生殖功能的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 SOX30在DBP致TM4细胞增殖抑制中的作用及机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 SOX转录因子家族在脏器发育中的功能研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件:构建的过表达载体的测序结果 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 非人灵长类胚胎早期发育 |
| 1.2.1 配子形成 |
| 1.2.2 受精 |
| 1.2.3 卵裂 |
| 1.2.4 囊胚形成 |
| 1.2.5 植入 |
| 1.2.6 早期胚胎发育的分子调控 |
| 1.2.7 早期胚胎发育与环境应激 |
| 1.3 非人灵长类胚胎早期发育调控研究 |
| 1.3.1 单细胞组学技术揭示胚胎早期发育的分子调控 |
| 1.3.2 利用体细胞核移植研究胚胎重编程过程 |
| 1.4 非人灵长类疾病模型研究 |
| 1.4.1 非人灵长类基因组编辑研究现状 |
| 1.4.2 基因编辑技术的安全性问题 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 基于单细胞转录组测序的猕猴胚胎植入前发育研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验材料与方法 |
| 2.3.1 动物来源 |
| 2.3.2 实验主要试剂 |
| 2.3.3 实验主要仪器 |
| 2.3.4 卵母细胞采集 |
| 2.3.5 建立体外受精/体细胞核移植/孤雌激活/孤雄发育胚胎 |
| 2.3.6 胚胎培养 |
| 2.3.7 单细胞样本收集 |
| 2.3.8 单细胞转录组数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 单精子注射、体细胞核移植、单性生殖胚胎的植入前转录图谱 |
| 2.4.2 猕猴胚胎植入前发育的转录阻滞 |
| 2.4.3 猕猴植入前胚胎转录组的母源—合子转化 |
| 2.4.4 表观遗传调控相关基因的异常表达与胚胎阻滞相关 |
| 2.4.5 通过降低核移植胚胎中异常的H3K9me3修饰提高胚胎发育率 |
| 2.5 讨论及小结 |
| 第三章 建立DAX1基因靶向编辑的食蟹猴模型 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 实验材料与方法 |
| 3.3.1 实验主要试剂和仪器 |
| 3.3.2 动物来源、卵采集、体外受精 |
| 3.3.3 建立DAX1基因靶向编辑食蟹猴 |
| 3.3.4 编辑效率检测:T7酶切及测序 |
| 3.3.5 脱靶检测 |
| 3.3.6 H&E染色 |
| 3.3.7 免疫组化和免疫荧光检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 建立DAX1基因靶向修饰的食蟹猴模型 |
| 3.4.2 Cas9介导的模型猴生殖系细胞DAX1基因靶向突变 |
| 3.4.3 DAX1基因突变引起模型猴猴睾丸发育异常 |
| 3.4.4 DAX1基因突变不会导致支持细胞发育异常 |
| 3.4.5 DAX1基因突变导致Wnt/β-catenin信号通路异常上调 |
| 3.4.6 DAX1基因突变引起模型猴肾上腺发育异常 |
| 3.5 讨论及小结 |
| 第四章 食蟹猴胚胎的干细胞嵌合研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 实验材料与方法 |
| 4.3.1 食蟹猴多能干细胞系的建立 |
| 4.3.2 多能干细胞的荧光标记 |
| 4.3.3 干细胞体外分化实验 |
| 4.3.4 构建嵌合体胚胎 |
| 4.3.5 胚胎培养/延迟培养及胚胎移植 |
| 4.3.6 免疫组化染色 |
| 4.3.7 胚胎移植、孕检、胎儿及新生猴组织样本采集 |
| 4.3.8 胎猴/新生猴组织处理 |
| 4.3.9 特异性基因PCR检测 |
| 4.3.10 单细胞RNA-seq |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 建立多能干细胞嵌合猴胚胎 |
| 4.4.2 建立多能干细胞嵌合食蟹猴 |
| 4.4.3 通过基因表达谱分析揭示多能干细胞的嵌合机制 |
| 4.4.4 食蟹猴pESCs在成体猴生殖系的嵌合 |
| 4.4.5 胚胎微环境影响多能干细胞嵌合效率 |
| 4.5 讨论及小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读博士期间发表论文目录 |
| 附录 B 实验动物伦理审批表 |
| 附录 C 其他需要说明的内容 |
（5）miR-195-5p在卵巢癌中的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、miR-195-5p在上皮性卵巢癌组织、细胞系中的表达 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.4 常用实验试剂的配制 |
| 1.1.5 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 miR-195-5p在卵巢癌组织中表达下调 |
| 1.2.2 miR-195-5p在卵巢癌细胞、正常卵巢细胞中的表达情况 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、miR-195-5p对卵巢癌细胞生物学行为的影响 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 常用实验试剂的配制 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 体外细胞学验证miR-195-5p对卵巢癌细胞增殖及迁移能力的影响 |
| 2.2.2 体内动物学实验验证miR-195-5p对卵巢癌增殖的影响 |
| 2.2.3 miR-195-5p对卵巢癌细胞周期的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、miR-195-5p与 CDCA4 作用关系研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 研究对象 |
| 3.1.2 研究物品 |
| 3.1.3 研究方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 CDCA4是miR-195-5p下游调控靶基因 |
| 3.2.2 miR-195-5p通过对CDCA4 的调节作用来抑制卵巢癌细胞的增殖能力 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、miR-195-5p、CDCA4 与卵巢癌临床病理特征、预后的关系 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 研究对象 |
| 4.1.2 临床资料 |
| 4.1.3 随访 |
| 4.1.4 研究物品 |
| 4.1.5 研究方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 miR-195-5p、CDCA4 在上皮性卵巢癌组织中的表达与卵巢癌患者临床病理因素的关系 |
| 4.2.2 miR-195-5p、CDCA4 表达水平与上皮性卵巢癌患者预后的关系 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞周期调控与上皮性卵巢癌 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）Notch3表达异常影响胎盘滋养细胞分化的检测分析与调控机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
（7）AD少突胶质细胞改变及抗精神病药物对其作用的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 APP/PS1 转基因AD小鼠海马内少突胶质细胞的改变 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 AD少突胶质细胞改变的体外研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 抗精神病药物对AD少突胶质细胞作用的初步探讨 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
（8）Stra8在精子发生中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分: Stra8与Setd8相互作用调控精子发生的机制 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、Stra8与Setd8相互作用机制分析 |
| 二、Stra8与Setd8相互作用调控精子发生过程的机制研究 |
| 讨论 |
| 第二部分: Stra8在雄性小鼠减数分裂I早期中的作用研究 6 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、Stra8 KO小鼠的繁殖与基因型鉴定 |
| 二、第一个精子发生波中Stra8 KO睾丸的组织形态学分析 |
| 三、第一个精子发生波中Stra8 KO精母细胞染色体形态学分析 |
| 四、Stra8 KO小鼠睾丸中差异表达基因的筛选和验证 |
| 五、Stra8在精子发生中调控网络的构建 |
| 六、Stra8可能的下游靶基因表达模式分析 |
| 七、Stra8与Rhox10转录调控分析 |
| 八、Stra8与Rhox10相互作用分析 |
| 九、Stra8与Rhox10亚细胞共定位分析 |
| 讨论 |
| 第三部分: 巴戟天多糖和淫羊藿苷在视黄酸诱导生精细胞分化中的作用研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、不同浓度RA,处理不同时间,诱导P19细胞向生精细胞方向分化的作用分析 |
| 二、MTT法分析巴戟天多糖和ICA对RA诱导的P19细胞增殖的影响、最佳作用浓度和作用时间 |
| 三、巴戟天多糖和ICA对RA诱导的P19细胞凋亡的影响 |
| 四、巴戟天多糖和ICA对RA诱导P19向生精细胞方向分化的影响 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 主要学术论文 |
| 主要科研获奖 |
| 致谢 |
（9）坡模酸及其吡喃葡萄糖酯抗结肠癌作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 注释表 |
| 引言 |
| 第1章 坡模酸的获取及抗结肠癌活性探讨 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试剂与耗材 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 细胞系 |
| 1.1.4 受试药 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 巴西甘菊花单体成分的获取 |
| 1.2.2 细胞培养 |
| 1.2.3 巴西甘菊花单体成分(L1-L6)抗结肠癌活性筛选 |
| 1.2.4 坡模酸的获取 |
| 1.2.5 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 巴西甘菊花单体成分的获取 |
| 1.3.2 巴西甘菊花单体成分(L1-L6)抗结肠癌活性筛选 |
| 1.3.3 坡模酸的获取 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 坡模酸及其吡喃葡萄糖酯对结肠癌HT-29细胞的作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试剂与耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 细胞系 |
| 2.1.4 受试药 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 MTT法测定HT-29细胞活力 |
| 2.2.3 细胞存活率测定 |
| 2.2.4 细胞形态的观察 |
| 2.2.5 Hoechst 33342染色测定细胞凋亡 |
| 2.2.6 吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色测定细胞凋亡 |
| 2.2.7 AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞检测细胞凋亡 |
| 2.2.8 PI单染测定对HT-29周期的影响 |
| 2.2.9 细胞迁移(划痕)实验 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 对HT-29细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 细胞存活率的测定 |
| 2.3.3 细胞形态的观察 |
| 2.3.4 Hoechst 33342染色测定细胞凋亡 |
| 2.3.5 吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色测定细胞凋亡 |
| 2.3.6 AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞凋亡分析 |
| 2.3.7 PI单染测定细胞周期的变化 |
| 2.3.8 细胞划痕实验 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 基于网络药理学和分子对接技术探索坡模酸及其吡喃葡萄糖酯抗结肠癌作用机制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 数据库 |
| 3.1.2 软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 坡模酸、坡模酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯潜在作用靶点收集 |
| 3.2.2 疾病靶点的筛选 |
| 3.2.3 药物成分-预测靶点网络的构建 |
| 3.2.4 PPI网络的建立 |
| 3.2.5 结肠癌靶点生物学功能分析和通路分析 |
| 3.2.6 活性成分与关键靶点的分子对接验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 药物和疾病靶点筛选 |
| 3.3.2 药物成分-预测靶点网络的构建 |
| 3.3.3 PPI网络的建立 |
| 3.3.4 结肠癌靶点生物学功能分析和通路分析 |
| 3.3.5 活性成分与关键靶点的分子对接验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 基于蛋白组学测定坡模酸及其吡喃葡萄糖酯抗结肠癌作用的分子机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试剂与耗材 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 细胞系 |
| 4.1.4 受试药 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 蛋白收集 |
| 4.2.3 蛋白处理 |
| 4.2.4 上样 |
| 4.2.5 蛋白质组数据分析 |
| 4.2.6 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 标准曲线的绘制 |
| 4.3.2 蛋白质LC-MS图 |
| 4.3.3 差异蛋白筛选 |
| 4.3.4 GO富集功能分析 |
| 4.3.5 差异蛋白所参与的通路 |
| 4.3.6 筛选出目的差异蛋白 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 网络药理学和蛋白质组学的整合分析和实验验证 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试剂与耗材 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 细胞系 |
| 5.1.4 受试药 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 细胞培养 |
| 5.2.2 蛋白印迹实验 |
| 5.2.3 统计学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 蛋白标准曲线的绘制 |
| 5.3.2 坡模酸、坡模酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯对HT-29细胞凋亡蛋白Bax、Bcl2和Caspase 3表达的影响 |
| 5.3.3 坡模酸、坡模酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯对HT-29细胞自噬相关蛋白表达的影响 |
| 5.3.4 坡模酸、坡模酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯对HT-29细胞Jak/Stat3通路的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 坡模酸及其吡喃葡萄糖酯对小鼠异种移植瘤的影响 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 试剂与耗材 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.1.3 细胞系和实验动物 |
| 6.1.4 受试药 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 动物喂养 |
| 6.2.2 细胞培养及肿瘤模型制备 |
| 6.2.3 肿瘤模型的制备 |
| 6.2.4 动物分组与处理 |
| 6.2.5 组织病理学观察 |
| 6.2.6 统计学分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 移植瘤小鼠体重和瘤体积生长曲线图 |
| 6.3.2 肿瘤体积大小、瘤重指数和脾脏指数的变化情况 |
| 6.3.3 结肠癌裸鼠皮下移植瘤大体标本观察 |
| 6.3.4 肿瘤组织病理切片观察(HE染色) |
| 6.3.5 肝脏组织病理切片观察(HE染色) |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文总结 |
| 结论 |
| 本研究创新点 |
| 尚待深入内容 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（10）第一部分：APC/C-CDH1调控的TCA循环代谢酶IDH3β促进细胞生长的机制研究 第二部分：肿瘤抗原在食管鳞癌进展中的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 第一部分 APC/C-CDH1调控的TCA循环代谢酶IDH3β促进细胞生长的机制研究 |
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 菌种、质粒和细胞株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 引物合成与设计 |
| 1.5 siRNA的合成 |
| 1.6 主要仪器设备 |
| 1.7 常用试剂的配置 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞处理方法 |
| 2.2 细胞瞬时转染 |
| 2.3 细胞增殖实验 |
| 2.4 细胞周期检测 |
| 2.5 细胞克隆形成实验 |
| 2.6 细胞周期同步化 |
| 2.7 细胞药物处理 |
| 2.8 细胞总蛋白和总RNA的提取 |
| 2.9 细胞和RNA浓度测定 |
| 2.10 Western blot |
| 2.11 胞膜-胞浆-胞核蛋白制备(参见说明书要求) |
| 2.12 逆转录与Real-time PCR |
| 2.13 细胞免疫荧光 |
| 2.14 EDU增殖检测 |
| 2.15 原位PLA检测 |
| 2.16 质粒大量提取(按照说明书要求操作) |
| 2.18 免疫共沉淀实验 |
| 2.19 裸鼠移植瘤实验 |
| 2.20 TCA代谢产物检测 |
| 2.21 稳定细胞系的筛选 |
| 2.22 统计分析 |
| 实验结果 |
| 1. 筛选APC/C的潜在底物 |
| 2. IDH3β是APC/C-CDH1的特异性结合底物 |
| 3. APC/C-CDH1参与调控IDH3β的周期依赖性表达 |
| 4. IDH3β调控食管鳞癌细胞G1/S期转换 |
| 5. IDH3β促进管鳞癌细胞细胞增殖 |
| 6. IDH3β作为IDH3的亚基之一能促进TCA循环的氧化代谢 |
| 7. IDH3β依赖其催化产物α-KG来加快G1/S期转换并促进细胞增殖 |
| 8. 过表达IDH3β上调PFKFB3的总蛋白以及在细胞核内的水平 |
| 9. IDH3β在食管鳞癌组织中高表达并且与预后相关 |
| 10. IDH3β在本研究中的主要功能模式图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肿瘤抗原在食管鳞癌进展中的作用及分子机制研究 |
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 菌种、质粒和细胞株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 引物合成与设计 |
| 1.5 siRNA的合成 |
| 1.6 主要仪器设备 |
| 1.7 常用试剂的配置 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞处理方法 |
| 2.2 细胞瞬时转染 |
| 2.3 细胞增殖实验 |
| 2.4 细胞总蛋白和总RNA的提取 |
| 2.5 细胞和RNA浓度测定 |
| 2.6 逆转录与Real-time PCR |
| 2.7 胞膜-胞浆-胞核蛋白制备 |
| 2.8 Western blot |
| 2.9 原位PLA检测 |
| 2.10 细菌转化 |
| 2.11 质粒大量提取 |
| 2.12 免疫共沉淀实验 |
| 2.13 裸鼠移植瘤实验 |
| 2.14 小鼠尾静脉注射实验 |
| 2.15 免疫组织化学实验 |
| 2.16 稳定细胞系的筛选 |
| 2.17 ELISA实验 |
| 2.18 组织单个细胞分离 |
| 2.19 人外周血淋巴细胞分离实验 |
| 2.20 细胞杀伤实验 |
| 2.21 T细胞活化及共培养(以单孔为例) |
| 2.22 细胞膜表面染色实验 |
| 2.23 统计分析 |
| 实验结果 |
| 1. MAGE-C3在食管鳞癌中具有突变和拷贝数扩增现象 |
| 2. MAGE-C3在食管鳞癌组织中高表达并且与预后负相关 |
| 3. MAGE-C3促进食管鳞癌细胞的侵袭迁移但不影响肿瘤细胞生长 |
| 4. 转录组测序分析 |
| 5. MAGE-C3作用于IFN-γ受体激活IFN-γ通路 |
| 6. MAGE-C3可上调PD-L1的mRNA水平和膜表面水平 |
| 7. MAGE-C3抑制淋巴细胞杀伤以及T细胞的因子分泌功能 |
| 8. MAGE-C3在免疫完全小鼠中促进黑色素瘤小鼠细胞生长和转移 |
| 9. MAGE-C3影响黑色素瘤肺转移灶中肿瘤浸润T细胞的类型 |
| 10. MAGE-C3可能通过STAT3诱导食管鳞癌EMT |
| 11. MAGE-C3在本研究中的主要功能模式图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 基金资助 |
| 在读期间已发表或待发表的文章 |
| 肿瘤抗原MAGE的研究进展(文献综述） |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、小鼠2-细胞、4-细胞胚胎G_1期检测及同步化的研究（论文参考文献）
- [1]OSR2在细胞周期阻滞中的作用 ——肾脏缺血再灌注损伤研究新机制[D]. 黄浩文. 南昌大学, 2021(01)
- [2]牛蒡子苷元衍生物抗鲤春病毒血症病毒活性及机制研究[D]. 沈毓峰. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [3]SOX30基因在雄性生殖发育毒性中的作用及机制初步研究[D]. 王平. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020
- [4]非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究[D]. 康宇. 昆明理工大学, 2020(04)
- [5]miR-195-5p在卵巢癌中的作用与机制研究[D]. 刘翔宇. 天津医科大学, 2020(06)
- [6]Notch3表达异常影响胎盘滋养细胞分化的检测分析与调控机制研究[D]. 徐增伟. 重庆医科大学, 2020(12)
- [7]AD少突胶质细胞改变及抗精神病药物对其作用的研究[D]. 吴燕莉. 重庆医科大学, 2020(12)
- [8]Stra8在精子发生中的作用及机制研究[D]. 牛长敏. 扬州大学, 2020
- [9]坡模酸及其吡喃葡萄糖酯抗结肠癌作用及机制研究[D]. 刘利艳. 江西中医药大学, 2020(01)
- [10]第一部分：APC/C-CDH1调控的TCA循环代谢酶IDH3β促进细胞生长的机制研究 第二部分：肿瘤抗原在食管鳞癌进展中的作用及分子机制研究[D]. 吴清楠. 北京协和医学院, 2019