一、胰岛素样生长因子系统与哺乳动物生殖（论文文献综述）
赵云[1]（2021）在《视黄醇结合蛋白4对猪卵泡颗粒细胞功能的影响及其机制研究》文中提出卵泡发育不但受“下丘脑-垂体-卵巢轴”分泌的激素调节,而且受旁分泌和自分泌因子调控。卵泡颗粒细胞是卵泡内体细胞的主要类型,主要功能为合成分泌激素和细胞因子,为卵母细胞成熟和卵泡发育提供营养物质。颗粒细胞分泌的细胞因子通过复杂的信号转导,参与优势卵泡选择和卵泡闭锁的调控。研究证实,颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的潜在机制。因此,阐明颗粒细胞凋亡机制,为提高雌性动物繁殖能力和治疗卵巢疾病具有重要的科学意义。视黄醇结合蛋白4（RBP4）属于载脂蛋白家族成员之一,是视黄醇的特异性转运蛋白,负责将视黄醇从肝脏转运至外周组织。研究表明,RBP4在许多哺乳动物卵巢中表达,血液中RBP4含量与人的胰岛素抵抗和多囊卵巢综合症相关,猪囊肿卵泡液中有高浓度的RBP4蛋白,推测RBP4可能参与调控颗粒细胞功能。但目前有关RBP4对卵泡颗粒细胞的调控研究相对较少。为了探讨RBP4的功能,通过构建RBP4过表达载体包装慢病毒和设计干扰RNA,改变猪卵泡颗粒细胞RBP4的表达量,采用流式细胞术、RT-qPCR和Western blotting等分子生物学技术,从基因和蛋白表达水平检测RBP4对猪卵泡颗粒细胞凋亡和孕酮合成分泌的影响。通过高通量测序分析,发现RBP4处理组差异表达基因富集在胰岛素通路中,结合胰岛素下游通路ERK1/2位点的抑制剂（U0126）处理,阐明RBP4通过ERK1/2信号通路影响颗粒细胞凋亡和孕酮分泌的分子机制。本研究主要结果如下:1.构建猪RBP4基因慢病毒表达载体并成功包装pLVX-RBP4重组慢病毒,病毒滴度达到3×108TU/m L;重组慢病毒成功感染原代培养的猪卵泡颗粒细胞,并且细胞中RBP4基因的表达水平显着升高。过表达RBP4能显着降低BCL2和XIAP的表达水平,增加BAX的表达量,促进猪卵泡颗粒细胞凋亡,抑制孕酮分泌。2.设计合成RBP4干扰序列,确定siRBP4＿01干扰片段转染颗粒细胞72 h,能显着降低RBP4的表达水平。干扰RBP4能增加细胞活力,显着降低CASPASE和BAX表达量,抑制颗粒细胞凋亡。3.使用慢病毒处理猪卵泡颗粒细胞72 h,利用高通量测序检测mRNA表达图谱的变化。结果显示,与对照组相比,检测到113个差异基因,71个基因上调,42个基因下调;差异基因主要富集在氧化磷酸化通路、胰岛素通路、AMPK等16个信号通路。4.干扰RBP4能激活ERK1/2通路,siRBP4＿01能减弱U0126对ERK1/2通路的抑制作用,siRBP4＿01组与siRBP4＿01+U0126组相比,细胞活力增加,凋亡基因的表达量显着下降,抑制颗粒细胞凋亡。因此,RBP4主要通过抑制ERK1/2通路激活,调控颗粒细胞凋亡,抑制孕酮合成分泌。综上所述,本研究通过慢病毒过表达和干扰RNA处理猪卵泡颗粒细胞,利用RT-qPCR、Western blotting以及分子网络分析等研究手段,证明了RBP4可通过抑制ERK1/2信号通路,促进颗粒细胞凋亡基因的表达,降低颗粒细胞活力,促进颗粒细胞凋亡;同时,抑制颗粒细胞中孕酮合成基因的表达,降低孕酮分泌。本研究的结果为RBP4在卵泡发育及颗粒细胞发育过程中所涉及的调控机制提供了新的见解。
赵畅[2]（2021）在《能量负平衡奶牛产后乏情的关键蛋白筛选及作用机制研究》文中研究说明奶牛产后能量负平衡（NEB）会抑制卵泡发育,使得乏情率升高。尽管集约化牛场应用同期发情定时输精技术（TAI）来提高奶牛发情率,但仍有部分NEB奶牛产后经TAI处理后无优势卵泡供机体选择排卵,出现乏情表现。目前,高产奶牛产后NEB所致的乏情率升高已成为制约奶牛繁殖效率的一大瓶颈。为此,本研究针对这一问题,通过NEB乏情奶牛血清、卵泡液和卵巢皮质组织的蛋白质组学分析的体内实验,结合ADPN对低糖培养奶牛体外颗粒细胞（GCs）生长发育和类固醇激素合成的影响的体外实验,阐明NEB奶牛产后乏情蛋白质组学变化特征,明确所筛选的差异蛋白如脂联素（ADPN）与奶牛产后乏情的关系及其对奶牛乏情发生的风险预警作用,以及ADPN影响奶牛产后乏情和体外GCs生长发育的分子机制,为今后研究奶牛产后NEB导致乏情的机制提供理论依据。1.体内实验。为了明确奶牛产后乏情蛋白组学特征谱以及差异蛋白的作用,本实验在奶牛产后14-21 d根据血清中β-羟丁酸（BHBA）浓度高于1.20 mmol/L,同时葡萄糖（Glu）浓度低于2.80 mmol/L,被分成能量负平衡组（NEB,n=30）和能量平衡组（PEB,n=30）,跟踪至产后55-60 d;在产后50-55d根据是否发情及卵泡直径大小选择NEB组乏情奶牛（NEB-A,n=6,卵泡直径<8 mm）和PEB组发情奶牛（PEB-E,n=6,优势卵泡直径在15-20 mm之间）进行屠宰采集样品,开展了系列实验,结果如下:（1）应用TMT/LC-MS/MS蛋白组学技术筛选NEB-A和PEB-E奶牛血清、卵泡液和卵巢皮质组织的差异表达蛋白（DEP）,分析DEP功能和富集通路等。与PEB-E组相比,NEB-A组奶牛血清中DEP有82个下调,78个上调,主要富集通路包括:补体和凝血系统、P13K-AKT通路、胰高血糖素信号通路、MAPK通路等;NEB-A组奶牛卵泡液中DEP有135种下调,37种上调,主要富集通路包括:脂质代谢、IGF调节系统、免疫系统等;NEB-A组奶牛卵巢皮质组织中DEP有88个下调,70个上调,主要富集通路包括:类固醇激素代谢、脂肪酸代谢、免疫系统等。（2）应用Western blot验证筛选的5种DEP,即超氧化物歧化酶（SOD）、视黄醇结合蛋白4（RBP4）、胰岛素样生长因子2（IGF2）、ADPN、和C反应蛋白（CRP）在卵泡液和血液中的表达水平,与组学结果一致。同时,验证试验奶牛卵巢皮质组织中AKT和ERK1/2磷酸化水平,与PEB-E组相比,AKT和ERK1/2在NEB-A组奶牛卵巢皮质组织的磷酸化水平显着下调（p<0.05）。（3）应用免疫组化对ADPN在卵巢组织中进行定位,与PEB-E组相比,NEB-A组奶牛ADPN在卵巢髓质下调,与血液、卵泡液和脂肪组织中的下调一致（p<0.05）,证实ADPN主要分布于卵巢髓质。（4）NEB和PEB奶牛血清中肝功指标、胰岛素调控相关指标及血清和卵泡液中ADPN和Glu,经生化分析、聚类分析、二元逻辑回归分析、风险指数分析和受试者工作特征曲线（ROC）分析发现,血清中ADPN与胰岛素调控和肝功指标呈强相关,卵泡液中Glu与ADPN呈正相关。并且,奶牛产后14-21 d血清中ADPN<2.365μg/m L可以用于奶牛产后乏情发生的风险预警。体内实验结果表明,奶牛产后经历NEB后血液、卵泡液及卵巢皮质组织中DEP主要通过富集通路影响奶牛产后发情,其中AKT和ERK1/2在奶牛卵巢皮质组织的磷酸化水平下调,以及血液、卵泡液和卵巢组织中ADPN的下调在奶牛产后乏情发生中起了重要的作用。2.体外实验。为了阐明低糖/ADPN在奶牛卵泡发育或GCs生长发育的作用,本实验在建立低糖培养体外牛GCs模型基础上,开展了系列实验,结果如下:（1）用Western blot检测低糖培养和正常培养下牛GCs细胞周期蛋白（CCNA1、CCND1、CCNE2、CDK1）、类固醇激素合成蛋白（St AR、HSD3B1）、ADPN蛋白受体（Adipo R2）的表达水平,与正常培养相比,低糖培养GCs细胞周期蛋白、类固醇激素合成蛋白、Adipo R2的表达水平都显着下调（p<0.05）。（2）在低糖培养下,添加低（0.1μg/m L）、中（0.5μg/m L）和高剂量（1μg/m L）的牛重组ADPN蛋白,仅添加蛋白包被溶剂为对照组。在处理12 h、24 h、48 h后,用CCK8、Western blot检测细胞活性、ADPN受体R2、细胞周期蛋白、类固醇激素合成蛋白的蛋白表达水平,用放射免疫方法检测培养基中E2和P4含量。与其他组相比,高剂量组48 h后细胞活性最高;与对照组相比,高剂量组St AR蛋白水平极显着升高（p<0.05）,三组HSD3B1蛋白水平极显着升高（p<0.01）;低剂量组GCs分泌E2能力无显着变化,高浓度ADPN显着增加E2合成能力;与对照组相比,不同剂量ADPN对GCs分泌P4无明显影响。（3）在低糖培养下,外源性添加LY294002（PI3K/AKT抑制剂）和高剂量ADPN,在处理12 h、24 h、48 h后,用Western blot检测AKT磷酸化水平以及CDK2、St AR、HSD3B1、Adipo R2的蛋白水平,用q-PCR检测CYP19A1、3β-HSD的基因表达水平,用放免法检测不同组中E2、P4含量。与对照组相比,添加ADPN+PI3K抑制剂组细胞活性显着下降（p<0.01）,CDK2蛋白水平极显着下降（p<0.01）,St AR和HSD3B1蛋白水平极显着下降（p<0.01）,培养基中P4含量无明显变化,但E2含量显着下降（p<0.05）。体外实验结果表明,高剂量ADPN经Adipo R2激活PI3K-AKT-CDK2通路刺激低糖环境下GCs类固醇激素E2的分泌,增强细胞活性,促进细胞生长发育。综上所述,本研究获得了奶牛产后乏情蛋白组谱,发现NEB通过补体和凝血系统、P13K-AKT通路、胰高血糖素信号通路、MAPK通路、脂肪酸代谢、免疫系统调控以及IGF调节系统等主要富集通路影响奶牛产后卵泡发育,确立了ADPN对NEB奶牛产后乏情发生的风险预警作用,证实了ADPN可以经Adipo R2-PI3K-AKT通路影响低糖培养下牛GCs活性和类固醇激素合成,进而调控卵泡生长发育。
胡琼瑶[3]（2021）在《胰岛素样生长因子与表皮生长因子在草鱼垂体中的功能研究》文中指出胰岛素样生长因子（IGF）和表皮生长因子（EGF）广泛分布于机体各个部位,是生长因子家族中的重要成员,在生物体内发挥着重要功能。IGF通过结合胰岛素样生长因子绑定蛋白（IGFBP）发挥生理功能,体内大多数IGF呈IGF/IGFBP复合物的形式,只有少数以游离形式存在。目前,关于IGF和EGF在鱼类中的功能主要聚焦在肝脏和性腺组织中,而其在垂体中的具体功能尚不清楚。基于此,本论文以草鱼为研究对象,系统阐释IGF1/IGFBP1a和EGF在硬骨鱼类垂体中的功能。具体结果如下:1、IGF1/IGFBP1a参与调控草鱼垂体LH和FSH表达。首先,通过克隆得到草鱼IGFs（IGF1、IGF2a、IGF2b、IGF3）和IGFBP1（IGFBP1a、IGFBP1b）基因。序列比对结果显示草鱼IGFs家族序列高度保守,哺乳动物和草鱼IGFBP1a在C末端和N末端区域高度保守,但在连接域中均不保守。组织表达分析结果显示IGFBP1a主要在草鱼垂体、肾脏、脾脏中高表达。利用免疫组化对IGFBP1a在草鱼垂体中的具体分布位置进行进一步定位,结果显示IGFBP1a广泛分布于后腺垂体区中的神经垂体区,预示IGFBP1a可能在垂体中发挥重要功能。基于此,利用IGF1和IGFBP1a分别处理草鱼垂体原代培养细胞,转录组分析结果显示IGF1和IGFBP1a能够分别诱导草鱼垂体中786个和616个差异基因表达,这些差异基因主要参与了细胞生长、发育过程、免疫反应等重要生理功能。接着,以草鱼垂体原代培养细胞为研究对象,进一步检测发现IGF1能够以时间和剂量依赖性方式促进LHβ和FSHβ的表达,而IGFBP1a则以时间和剂量依赖性方式抑制LHβ和FSHβ的表达。此外,IGF1和IGFBP1a共同处理草鱼垂体细胞后,发现IGFBP1a能够阻断IGF1对LHβ和FSHβ的诱导作用,并且IGFBP1a能够显着抑制IGF1对ERK和AKT的磷酸化激活水平。综上结果表明IGFBP1a对垂体LHβ和FSHβ表达的抑制作用是通过阻断内源性IGF1的作用实现的。2、EGF能够直接诱导草鱼垂体中UTS1、EGR1和MMP13的表达。EGF是一种6k Da的小分子蛋白,含有53个氨基酸,通过与其受体ErbBs结合在细胞增殖、分化和卵泡形成过程中发挥重要作用。在哺乳动物和鱼类中,关于EGF的功能研究主要集中在乳腺和性腺组织,而其在垂体中的功能研究较少。基于此,以草鱼垂体细胞为研究模型,首先,转录组分析结果显示EGF诱导垂体差异表达基因主要富集在金属离子绑定、癌症相关通路和代谢等相关通路上。其次,离体实验进一步证实EGF能够以时间和剂量依赖性的方式显着诱导草鱼垂体细胞中UTS1、EGR1和MMP13的表达。接着,受体后信号通路研究显示EGF通过结合ErbB1和ErbB2受体,并激活其受体后MEK/ERK和PI3K/AKT/m TOR通路促进UTS1和EGR1的表达,而EGF对MMP13的调节作用则是通过结合ErbB1受体并激活其受体后MEK/ERK通路完成的。
杨娇[4]（2021）在《IGFBP-3和GalNAc-T14对脑胶质瘤细胞增殖和周期的影响及其信号机制研究》文中研究指明目的:观察IGFBP-3和Ga1NAc-T14对脑胶质瘤细胞增殖和周期的影响并对其信号机制进行探讨。方法:1.收集河北医科大学附属第二医院神经外科脑胶质瘤组织和配对癌旁组织各108例。免疫组织化学染色检测脑胶质瘤组织与癌旁组织IGFB P-3蛋白表达,以及脑胶质瘤组织CyclinE蛋白表达;分析IGFBP-3与C yclinE蛋白表达的关系;分析IGFBP-3和CyclinE蛋白与脑胶质瘤患者生存率的关系。2.以脑胶质瘤U87MG和U251MG细胞作为研究对象,重组人IGFB P-3（rhIGFBP-3）处理细胞;转染IGFBP-3质粒,或共转染IGFBP-3和G alNAc-T14质粒,荧光显微镜观察荧光表达情况;MTT法检测检测各细胞增殖活力;平板克隆实验检测细胞克隆形成能力;流式细胞术检测细胞周期变化;蛋白印记实验检测IGFBP-3、GalNAc-T14、CyclinE、CDK2、p-ERK1/2蛋白表达变化。结果:1.相较于癌旁组织,IGFBP-3在脑胶质瘤组织中表达升高（P<0.01）。与IGFBP-3表达未升高的脑胶质瘤组织相比,CyclinE在IGFBP-3表达升高的脑胶质瘤组织中表达上调（P<0.01）。脑胶质瘤组织中IGFBP-3与CyclinE 蛋白表达呈强正相关性（r=0.7353,P<0.01）。IGFBP-3或Cycl inE蛋白表达升高与较低的生存率有关（P<0.05）。2.rhIGFBP-3处理明显时间依赖性增加U87MG和U251MG细胞的增殖率（P<0.05）。rhIGFBP-3明显增强U87MG和U251MG细胞的克隆形成能力（P<0.05）。rhIGFBP-3处理48h明显降低U87MG和U251MG细胞G1期细胞比例,并同时明显增加S期细胞比例（P<0.01）。rhIGFBP-3处理可时间依赖性上调U87MG和U251MG细胞p-ERK1/2、CyclinE和CDK2蛋白表达（P<0.01）。转染IGFBP-3质粒的U87MG和U251MG细胞显示较强绿色荧光,IGFBP-3蛋白表达显着上调（P<0.05）。IGFBP-3过表达显着增强U87MG和U251MG细胞克隆形成能力。IGFBP-3过表达显着增强U87MG和U251MG细胞p-ERK1/2、CyclinE及CDK2蛋白表达。IGFBP-3过表达显着降低U87MG和U251MG细胞G1期细胞比例,增加S期细胞比例。3.共转染IGFBP-3和CalNAc-T14质粒的U87MG和U251MG细胞显示较强绿色和红色荧光,IGFBP-3和CalNAc-T14蛋白表达均显着上调。与过表达IGFBP-3相比,共同过表达IGFBP-3和CalNAc-T14后U87MG和U251MG细胞克隆形成能力显着降低;G1期细胞比例显着增加（P<0.01）,S期细胞比例明显降低;p-ERK1/2、CyclinE和CDK2蛋白表达显着下调。结论:1.IGFBP-3在脑胶质瘤组织中表达上调,与患者不良预后相关;CyclinE在IGFBP-3表达升高的脑胶质瘤组织中表达上调,与患者不良预后相关,且与IGFBP-3表达正相关。2.IGFBP-3能磷酸化激活ERK1/2并上调CyclinE和CDK2蛋白表达,从而促进脑胶质瘤U87MG和U251细胞G1/S期转化和增殖。3.GalNAc-T14 可抑制 IGFBP-3 诱导的 U87MG 和 U251 细胞p-ERK1/2、CyclinE和CDK2蛋白表达变化,从而抑制细胞G1/S期转化和增殖。
刘洁[5]（2020）在《促黄体素与雌激素在小鼠和山羊卵丘扩展中的作用及其机制研究》文中研究说明哺乳动物的卵母细胞在个体出生前后,就进入第一次减数分裂,并被阻滞在第一次减数分裂前期的双线期,这种阻滞可能长达数月、数年甚至数十年之久,直到在排卵前促黄体素（LH）峰的刺激下,成熟卵泡中的卵母细胞才会恢复并完成减数分裂,成为具备受精和后续发育能力的成熟卵母细胞。在雌性哺乳动物的每个发情周期中,雌激素分泌波总是伴随着LH峰的出现,并在雌激素分泌波和LH峰出现之后发生成熟卵母细胞的排卵。而关于雌激素分泌波和LH峰调控卵母细胞减数分裂的具体机制及其二者之间的调控关系尚不十分明确。雌激素通过激活其核受体（ERs）和其膜受体（GPR30）,进而通过受体发挥不同的生物学效应。不同的雌激素受体与雌激素的亲和力不同,ERs与雌激素的亲和力较高,较低浓度雌激素即可激活ERs;而GPR30与雌激素亲和力较低,激活GPR30需要更高的雌激素浓度。本论文作者所在研究团队的前期研究显示,低浓度雌激素能够通过激活ERs信号通路增强CNP维持卵母细胞减数分裂的作用,而高浓度雌激素却能通过激活GPR30信号通路促进减数分裂恢复。因此,本研究主要聚焦于排卵前雌激素分泌波和LH峰调控卵丘-卵母细胞复合体卵丘细胞扩展的具体机制及雌激素分泌波与LH峰之间的调控关系。主要研究内容及其取得的研究结果如下:（1）LH信号提高了卵丘-卵母细胞复合体中的GPR30蛋白水平以小鼠和山羊卵丘-卵母细胞复合体（COCs）为研究对象,利用RT-q PCR、Western blot和免疫荧光技术检测了小鼠和山羊COCs在接收到LH/EGF（表皮生长因子）或EGF-like factors（类表皮样生长因子）信号刺激后GPR30的m RNA和蛋白水平变化,利用EGF受体（EGFR）抑制剂验证了LH/EGF（或EGF-like factors）调控GPR30表达的信号通路,并分别分析了卵丘细胞和卵母细胞中GPR30蛋白水平的变化情况。结果显示,LH和EGF或EGF-like factors长因子通过激活卵丘细胞上的EGFR信号通路,通过非基因组调控途径上调了卵丘细胞中的GPR30蛋白水平,但没有引起卵母细胞中GPR30蛋白水平的变化。（2）LH信号通过激活EGFR信号通路抑制颗粒细胞中GPR30蛋白的降解以小鼠卵泡颗粒细胞为研究对象,利用RT-q PCR、Western blot、溶酶体探针和免疫荧光技术检测了EGFR信号通路激活后GPR30蛋白半衰期的变化,利用蛋白酶体活性抑制剂MG132和溶酶体活性抑制剂bafilomycin A1探索了颗粒细胞中GPR30蛋白的降解途径,并对颗粒细胞内溶酶体进行细胞定位并检测其活力。结果显示,在颗粒细胞内GPR30蛋白主要通过自噬-溶酶体途径降解,在EGFR信号通路激活时通过非基因组调控途径降低了溶酶体的数量与活性,使GPR30降解受阻、半衰期延长,最终导致GPR30蛋白在细胞中累积。（3）雌激素通过激活GPR30信号通路提高卵丘细胞中的EGFR蛋白水平利用Western blot技术分别检测了体内成熟的小鼠COCs和山羊卵泡内的COCs中EGFR的蛋白水平,并将其变化趋势与体外培养的COCs进行比较;使用17β-雌二醇（17β-E2）、GPR30特异性激活剂G1、GPR30特异性抑制剂G15和雌激素核受体抑制剂ICI 182780处理体外培养的COCs,检测各处理组COCs中EGFR蛋白水平变化规律。结果发现,小鼠体内发育的COCs和体外培养山羊卵泡中的COCs,在成熟发育过程中EGFR蛋白水平升高,并维持在较高水平的激活状态;而体外培养的小鼠和山羊COCs,在成熟过程中EGFR蛋白水平降低,而且活化水平较低,激活后的维持时间也较短。在体外成熟培养液中加入17β-E2或G1能够提高EGFR蛋白水平,并发现G15能逆转17β-E2的作用,而ICI 182780则不能逆转17β-E2的作用。这些研究结果说明,雌激素能通过激活GPR30信号通路提高卵丘细胞中的EGFR蛋白水平。（4）雌激素-GPR30信号通路增强COCs对EGF的响应能力促进卵丘扩展分别使用添加17β-E2、G1、EGF、EGF+17β-E2、EGF+G1、EGF+17β-E2+G15和EGF+17β-E2+ICI 182780的培养液对小鼠和山羊COCs进行体外成熟培养,统计成熟后COCs的卵丘扩展指数和处于不同扩展等级的COCs比例;对各处理组小鼠和山羊卵丘扩展相关基因的表达水平进行检测,探讨雌激素促进卵丘扩展的作用及机制。结果显示,在EGF存在的情况下,17β-E2和G1能显着促进COCs的卵丘扩展,并提高扩展相关基因的表达水平;G15能逆转17β-E2的作用,而ICI 182780则不能逆转17β-E2促进卵丘扩展的作用。在无EGF的情况下,17β-E2和G1均无法单独促进卵丘扩展的发生。提示17β-E2无法直接促进卵丘扩展,但能通过激活GPR30信号通路提高COCs对EGF信号的响应能力,进而发挥促进卵丘扩展的作用。以上研究结果证明,卵母细胞成熟过程中LH和雌激素协同促进卵丘扩展。LH信号通过激活EGFR信号通路,抑制了卵丘细胞中的溶酶体途径,导致GPR30蛋白在细胞中累积;同时雌激素通过激活GPR30信号通路上调了卵丘细胞中EGFR的蛋白水平,从而通过提高COCs对EGF信号的响应能力,进而发挥促进卵丘扩展的作用。研究工作拓展了人们对哺乳动物卵母细胞成熟机制的认知,为进一步改良卵母细胞体外成熟培养体系、助推相关动物胚胎工程技术的研究与应用提供了理论基础。
王晨[6]（2020）在《磷酸三（1,3-二氯-2-丙基）酯诱导秀丽隐杆线虫衰老效应及健康风险分子机制》文中研究表明磷酸三（1,3-二氯-2-丙基）酯（Tris（1,3-dichloro-2-propyl）phosphate,TDCPP）是一种含卤素有机磷化合物,一般作为添加型阻燃剂应用于多类消费品中,是多溴联苯醚（poly brominated diphenylethers,PBDEs）的重要替代品之一。目前,TDCPP 及其主要二酯代谢物磷酸二（1,3-二氯-2-丙基）酯（bis（1,3-dichloro-2-propyl）phosphate,BDCPP）已在多种环境介质、生物体甚至人类母乳、血浆、胎盘、精液和尿液样品中广泛检出,对生态环境和人类健康构成严重威胁。研究证实,TDCPP污染暴露能够诱导生物体神经损伤、发育迟缓和生殖能力衰退等严重退行性病变,极有可能诱导生物体衰老效应、降低寿命。但迄今为止,关于TDCPP暴露诱导生物体衰老效应规律及分子机制的研究尚很有限,无法完整解释其诱导生物体多种退行性病变的原因,亟需深入研究TDCPP暴露诱导生物体衰老效应规律及作用机制,为揭示TDCPP生态毒理和人体健康损害分子机制提供科学依据。在此背景下,本研究选取秀丽隐杆线虫为衰老研究模型,凝练TDCPP诱导衰老毒性效应及作用机制的科学问题,系统研究TDCPP对线虫衰老效应规律及作用机制。采用多学科交叉的方法分析生理、生化变化特征和基因、蛋白表达差异;综合运用转录组学、生物信息学、转基因品系和突变体验证等技术,识别TDCPP诱导衰老显着相关靶标基因、蛋白及生物标志物,探究TDCPP诱导衰老的关键信号通路;结合人类体外细胞实验、同源建模及分子对接等分析,探究TDCPP对包括人类、斑马鱼和线虫在内的不同物种关键同源蛋白及信号通路的影响机制,揭示氯化有机磷酸酯TDCPP暴露诱导衰老的物种间同源性及潜在健康危害。取得的主要成果如下:（1）TDCPP暴露能够诱导秀丽隐杆线虫运动行为损伤、寿命降低等衰老毒性效应。多场景（急性、亚急性）不同浓度TDCPP暴露（control、0.1、1、100、1000 μg/L）对线虫生理、生化毒性效应评估结果显示,相同浓度下,亚急性（L1-72h）暴露比急性暴露（L4-24h）更加敏感,毒性效应更显着。环境浓度TDCPP暴露能够降低线虫体长、子代数目、运动行为和存活寿命,增加线虫肠道通透性、氧化应激水平、细胞凋亡水平和脂褐素累积水平。其中,运动行为与寿命呈正相关,亚急性暴露后,头部摆动和身体弯曲频率10%效应浓度（EC10）分别为11.5μg/L和39.4 μg/L,属于环境浓度范围。最高浓度组1000μg/L TDCPP亚急性暴露能够诱导线虫平均寿命降低17%,衰老生物标志物脂褐素水平显着提高32%、氧化应激水平显着提高34%,表明TDCPP能够以剂量依赖方式加速线虫衰老进程,降低寿命。（2）TDCPP通过诱导氧化自由基损伤机制加速秀丽隐杆线虫衰老、降低寿命。TDCPP暴露诱导线虫产生过量活性氧（reactive oxide species,ROS）,并进一步与脂质发生链式反应放大最初氧化损伤,导致脂褐素水平升高、4-羟基壬烯醛（4-hydroxynon-2-enal,4-HNE）等脂质过氧化关键产物累积,最终诱导线虫衰老、降低寿命。同时,通过mRNA转录组测序技术（mRNA-seq）及生物信息学分析评估TDCPP暴露后线虫整体mRNA表达特征及信号通路富集情况后发现,谷胱甘肽代谢及谷胱甘肽S-转移酶基因（gst-5、gst-6、gst-9、gst-10、gst-19、gst-24、gst-26、gst-29、gst-33、gst-38）在抗氧化过程中发挥重要功能,进一步表明脂质过氧化累积和氧化自由基损伤机制在加速线虫衰老过程中的关键作用。（3）TDCPP通过触发非常规胰岛素/胰岛素样生长因子-1信号通路（Insulin/Insulin-like Growth Factor-1 Signaling pathway,Insulin/IGF-1 信号通路）降低秀丽隐杆线虫寿命。该途径并非常规性破坏胰岛素样生长因子1受体DAF-2/IGF1R,而是直接通过抑制下游肿瘤抑制因子DAF-18/PTEN进行激活,这种抑制能够降低第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸PI（3,4,5）P3的去磷酸化水平,激活下游丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt/PKB,进一步提高Insulin/IGF-1信号通路中寿命中心因子DAF-16/FoxO蛋白磷酸化水平,抑制DAF-16/FoxO表达,阻止DAF-16/FoxO进入细胞核发挥功能,最终降低寿命。（4）TDCPP暴露诱导特定microRNA（miRNA）抑制寿命中心因子DAF-16/FoxO降低线虫寿命。通过Small RNA测序（Small RNA-seq）和生物信息学分析评估TDCPP暴露后线虫整体miRNA表达特征及信号通路富集情况后发现,TDCPP暴露同样能够触发非常规Insulin/IGF-1信号通路,这与mRNA研究结果高度吻合。因此,本研究建立了 TDCPP诱导衰老及寿命降低的miRNA-mRNA小型互作网络关系,其中miRNA突变体品系研究表明let-7家族miR-48和miR-84能够抑制DAF-16/FoxO转录、调节衰老相关运动行为和寿命。此外,计算机建模及分子对接结果从三维结构角度深入表明TDCPP与miR-48和miR-84的作用靶点和结合亲和力,证明TDCPP能够通过干扰线虫关键miRNA（miR-48 和 miR-84）表达抑制非常规 Insulin/IGF-1 通路中 DAF-16/FoxO 的功能,最终影响寿命。（5）TDCPP暴露激活非常规Insulin/IGF-1通路具有高度的物种间同源性。首先,非常规Insulin/IGF-1信号通路在人体正常肝细胞L02中得到验证,通路中关键同源基因及同源蛋白表达与线虫中结果相一致,证实该信号通路在人体细胞具有高度同源性。此外,利用同源建模技术分别提取和构建人类、斑马鱼、秀丽隐杆线虫IGF1R和PTEN蛋白三维结构,分别进行TDCPP与多物种IGF1R和PTEN蛋白分子对接研究,具体对接位点及结合亲和力分析揭示了 TDCPP暴露诱导衰老分子机制的物种间同源性及潜在健康危害,并再次证明抑癌因子PTEN在TDCPP降低寿命过程中的关键作用。综上所述,环境浓度氯代有机磷酸酯TDCPP能够诱导秀丽隐杆线虫运动行为损伤、寿命降低等多种衰老毒性效应,主要通过诱导自由基损伤、干扰非常规Insulin/IGF-1信号通路、诱导特定miRNA（miR-48/84）抑制寿命中心因子这三种分子机制发挥作用,其中,非常规Insulin/IGF-1信号通路具有高度的物种间同源性。该研究结果有助于更深层次了解典型氯代有机磷酸酯TDCPP的毒性效应和作用分子机制,为构建环境氯代有机磷酸酯污染的健康风险预警及防控体系提供科学依据。
郭长权[7]（2020）在《细胞因子bFGF和LIF对雏鸡原始卵泡发育的调节作用及其机理的研究》文中提出家禽卵巢中早期卵泡的发育与卵母细胞及颗粒细胞之间的物质传递和信息通讯密切相关,而细胞因子在其中扮演了重要的媒介作用。细胞因子能促进细胞的增殖和生长,而且还可以调节细胞的迁移、分化和有丝分裂。细胞因子包含很多种类,各种细胞因子经由旁分泌或自分泌以及卵母细胞和颗粒细胞间的物质运输、信号通讯对卵泡形成发育产生作用:调控颗粒细胞的增殖分化、激素分泌和其他细胞因子生成等。而细胞因子参与家禽早期卵泡生长发育相关的研究很少。同时家禽的繁殖性能是畜牧业上比较关注的问题,而早期卵泡发育对于最终的繁殖性能是有决定性影响的。所以对细胞因子在早期卵泡发育中的调控作用开展深入研究是有意义的。本实验以雏鸡为研究对象,检测雏鸡卵泡发育中基因的表达量变化以及利用已经建立的体外培养的卵巢模型来研究两种细胞因子,即碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor,bFGF）和白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）在雏鸡早期卵泡发育中的调控作用和其中的机理,为家禽产蛋性能的后续研究提供理论依据。1.雏鸡卵巢早期卵泡发育中miRNA表达的变化雏鸡早期卵泡的形成和发育涉及许多基因表达的变化。本实验以不同日龄的雏鸡卵巢作为实验样品,利用RNA-seq的实验技术来研究早期雏鸡卵巢中miRNA的表达。取D0、D4、D7的雏鸡卵巢各三个,用于RNA-seq分析。在RNA-seq建库结果中对miRNA进行质检,筛选出有显着差异表达的基因来进行RT-qPCR的验证,验证结果是趋势一致,RNA-seq结果可信。结果显示,与D0卵巢组织相比较,D4卵巢组织共有10种表达显着差异的miRNA,包括8条上调基因,2条下调基因;与D0卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有50种表达显着差异的miRNA,包括35条上调基因,15条下调基因;与D4卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有18种表达显着差异的miRNA,包括12条上调基因,6条下调基因。对差异表达miRNA的靶基因做汇总,结果显示,D4vs D0中,靶基因与细胞的抗凋亡和细胞因子作用相关;D7vs D0中,靶基因与细胞抗凋亡、细胞因子作用和激素合成相关;D7vs D4中,靶基因与缝隙连接、细胞因子作用、MAPK信号通路相关,其中涉及的靶基因有GJA5、HLF、MAP3K14等。上述结果表明,miRNA可通过缝隙连接、细胞抗凋亡、卵巢发育信号相关通路和细胞因子作用等方面来影响雏鸡卵泡的发育。2.雏鸡卵巢早期卵泡发育中lncRNA表达的变化本实验以不同日龄的雏鸡卵巢作为实验材料,用RNA-seq来分析雏鸡卵巢中lncRNA水平随时间的变化。并像上一章一样筛选出有显着差异表达的基因并用RT-qPCR来进行验证,使用GO数据库把有表达差异的lncRNA靶基因做富集处理分析,使用KEGG数据库给表达差异的lncRNA靶基因做通路注释。结果显示,与D0卵巢组织相比较,D4卵巢组织共有106种表达显着差异的基因,包括65条上调基因,41条下调基因;与D0卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有305种表达显着差异的基因,包括214条上调基因,91条下调基因;与D4卵巢组织相比较,D7卵巢组织共有109种表达显着差异的基因,包括52条上调基因,57条下调基因。RT-qPCR的验证实验证实了 RNA-seq结果的可靠性。GO数据库的结果表明差异表达的lncRNA靶基因大多富集于抗原受体介导的信号通路、细胞因子的合成和非膜跨蛋白酪氨酸激酶活性等生理活动,KEGG数据库结果显示差异的表达lncRNA靶基因大多与细胞因子-细胞因子受体间的相互作用、细胞黏附分子和卵泡发育相关的信号通路有关。其中D7 vs D4结果显示,不少靶基因为细胞因子或细胞因子受体的lncRNA表达明显增加,其中包括了FGF2,IL6R以及GDF9等。上述结果表明,lncRNA可通过细胞因子、细胞连接以及卵泡生长相关的信号通路等方面促进早期雏鸡卵泡的形成和发育,其中相关的细胞因子有FGF2,LIF和GDF9等。3.bFGF对雏鸡原始卵泡发育的调控作用许多细胞因子在雌性原始卵泡激活的过程中发挥重要的促进作用。而RNA-seq结果显示,D4雏鸡卵巢发育到D7的过程中表达明显增加的lncRNA的靶基因中有FGF2。同时先前也有研究报道,FGF2在大鼠中可以促进原始卵泡的激活。FGF2在禽类调节原始卵泡激活的作用研究很少。本实验检测了细胞因子bFGF和FSH对原始卵泡发育的相互刺激作用及其可能的信号机制,包括蛋白激酶B（AKT）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）通路。对4日龄雏鸡卵巢进行3天的bFGF和FSH处理,观察bFGF和FSH对卵泡发育的影响。本研究采用HE染色、免疫组化、实时定量PCR（qRT-PCR）、Western blot、免疫荧光等方法。在鸡早期卵巢中发现,bFGF受体（FGFR1）mRNA表达和原始卵泡激活的时间进程之间有变化的相关性。bFGF与FSH的相互刺激作用在原始卵泡的激活过程中表现为促进颗粒细胞的增殖、减少细胞的凋亡。FGFR1的抑制剂SU5402减弱了 bFGF的促进作用,降低了生长卵泡的比例。AKT和ERK信号通路介导了 bFGF和FSH促进原始卵泡激活的作用。上述研究结果表明,细胞因子bFGF和FSH通过PI3K-AKT和ERK信号通路对鸡早期卵巢颗粒细胞的增殖和抗凋亡产生相互刺激作用,促进原始卵泡激活。4.LIF对雏鸡原始卵泡发育的调控作用RNA-seq结果显示,D4雏鸡卵巢发育到D7的过程中表达明显增加的lncRNA的靶基因也有IL6R,IL6R与LIF的受体组成有关。LIF对雏鸡原始卵泡激活的作用研究较少。本实验检测了细胞因子LIF和bFGF在原始卵泡发育过程中的作用和相互之间的关联,以及涉及到的信号通路,包括了 AKT、ERK和Wnt/β-catenin信号通路。对出雏后4天的雏鸡进行卵巢组织的取材,并用LIF和bFGF单独或者联合处理3天,观察卵泡发育情况的变化。本研究采用HE染色、免疫组化、Western blot、透射电镜、免疫荧光等实验方法。结果显示,LIF以及其受体（LIFR）蛋白表达的变化与早期卵泡的发育过程之间有一定的时间相关性。LIF和bFGF的对于促进原始卵泡的激活有一定的协同作用,而具体的表现是促进卵泡细胞的增殖、同时减少卵泡细胞的凋亡。而LIFR的抑制剂SC144能够抑制LIF的这种促进原始卵泡激活的作用。同时AKT和ERK信号通路也参与了 LIF和bFGF这两者促增殖抑凋亡的过程,而Wnt/β-catenin信号通路在其中也有一定的介导作用。上述研究结果表明,LIF和bFGF可通过促进雏鸡卵泡细胞的增殖和抑制其凋亡,并产生协同作用从而促进原始卵泡的激活,这一过程中会涉及到AKT,ERK和Wnt/β-catenin信号通路。本实验利用RNA-seq来检测雏鸡卵巢卵泡发育过程中基因表达量的变化,将有显着表达差异的lncRNA与miRNA汇总并进行对比补充,发现在雏鸡原始卵泡激活阶段,靶基因与FGF2和LIF有关的lncRNA表达显着增加;利用已建立的卵巢组织体外培养模型,研究bFGF和LIF在雏鸡卵巢中原始卵泡激活的调控作用,发现FSH与bFGF发挥协同作用,可通过PI3K-AKT和ERK信号通路对雏鸡早期卵巢中颗粒细胞的增殖和抗凋亡的刺激作用从而促进卵泡激活;而LIF和bFGF可通过协同作用促进卵泡细胞增殖并抑制其凋亡,再通过AKT、ERK和Wnt/β-catenin信号通路促进卵泡激活。这些结果将为后续深入研究家禽卵泡发育的调控机制以及提高家禽产蛋性能奠定一定的理论基础。
陈燕霞[8]（2020）在《补肾促卵方调控PI3K和Nrf2信号通路保护卵巢储备功能低下的机制研究》文中提出研究背景随着人们生活方式和生育观念的改变,女性生育年龄不断后移,全球生育率呈逐年下降的趋势,而不孕不育的发病率呈逐年攀升的趋势。流行病学调查结果显示,在我国育龄人群中不孕不育的发病率高达15%～20%,患者累计超过6000万,尤其是在我国二孩政策开放后,高龄妇女成为不孕不育的主要就诊人群。其中,卵巢储备功能低下（Diminished Ovarian Reserve,DOR）是造成育龄女性发生不孕不育的重要致病因素,若未能及时干预则可在1～6年内进一步恶化并发展成为卵巢早衰。DOR不仅影响患者的生殖和心理健康,远期还可增加骨折、骨质疏松、心血管事件的发生风险。现代医学主要采用激素替代疗法改善患者临床症状和预防远期并发症,并通过辅助生殖技术进行人工助孕,但由于许多患者无法获得成熟的卵子进行体外受精,因此最终不能获得成功妊娠。中医药在防治不孕不育方面具有悠久的历史并积累了丰富的经验。前期通过查阅相关文献发现,肾虚血瘀是贯穿DOR发生发展全过程的基本病机,补肾活血是治疗DOR的重要治法。导师马堃研究员三十余年来一直致力于补肾活血中药治疗排卵障碍性不孕不育的临床及基础研究,根据多年临床诊疗经验,以补肾活血法为组方原则拟定补肾促卵方,长期应用于临床以治疗DOR,效果颇佳。现代药理研究显示,补肾促卵方可以通过抑制卵泡颗粒细胞凋亡,减少卵泡闭锁,增加原始卵泡,从而起到保护卵巢储备功能的作用。对于大多数雌性哺乳动物而言,卵巢中原始卵泡的数量是相对固定且不可再生的,因此不论何种因素诱导DOR的发生,最终都可将其归咎于卵巢中原始卵泡库提前耗竭,导致卵巢储备衰减,因而不能提供充足数量的原始卵泡以被募集进入生长卵泡池,卵泡发育障碍,最终无法形成具有受精能力的成熟卵子。因此,寻求有效治疗药物,积极改善卵巢储备功能、保护原始卵泡库是防治DOR的关键策略之一,而这正是中医“治未病”思想的体现。随着研究的不断深入,越来越多的证据支持原始卵泡过度激活是诱导卵巢储备提前耗竭的重要病理机制。为了维持生殖寿命,卵巢中绝大部分原始卵泡都处于静息休眠状态,每个周期中只有极少一部分原始卵泡会被激活进入生长卵泡池。其中,PI3K/AKT/mTOR信号通路在维持原始卵泡静息状态和启动募集过程中发挥着至关重要的作用,对于维持原始卵泡激活与休眠、存活与凋亡之间的动态平衡具有重要的意义。一旦原始卵泡过度激活进入生长卵泡池,将伴随着大量生长卵泡发生异常闭锁,而颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的中心环节,其中Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路在细胞凋亡途径中起着关键的调控作用,而氧化应激又是启动细胞凋亡程序的重要刺激因素。细胞凋亡的实质就是细胞内氧化系统与抗氧化系统之间动态平衡被打破的结果,其中,Nrf2/ARE信号通路是体内最为重要的抗氧化应激防御体系,在维持细胞稳定、抑制细胞凋亡等方面具有重要的作用。因此,本研究拟从PI3K/AKT/mTOR信号通路、Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路以及Nrf2/ARE信号通路探讨补肾促卵方保护雷公藤多苷诱导DOR的作用机制。在此基础上,并对补肾促卵方进行了急性毒性实验研究,以评价其用药安全性,以期为临床应用提供科学依据。研究目的本研究通过雷公藤多苷构建DOR小鼠模型,筛选出最适补肾促卵方给药浓度后,观察其对模型小鼠卵巢储备功能的保护作用,进而从分子角度深入探讨补肾促卵方通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路逆转雷公藤多苷诱导卵巢原始卵泡过度激活的作用机制,以及补肾促卵方通过激活Nrf2/ARE信号通路,抑制雷公藤多苷所致氧化应激对卵巢Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路的激活,减少颗粒细胞凋亡,防止生长卵泡过度闭锁,从而起到保护卵巢储备功能的作用机制。与此同时,本研究开展了补肾促卵方急性毒性实验研究,以期为临床用药安全性提供客观依据。研究方法一、补肾促卵方急毒实验为了验证补肾促卵方的安全性,以小鼠为研究对象,进行急性毒性实验研究。在预实验中将20只小鼠随机分为给药组和对照组,灌胃前12h每组小鼠均禁食不禁水,给药组予最高给药浓度和小鼠可承受的最大给药体积的补肾促卵方溶液,1日灌胃3次,每次间隔约4h,对照组予等体积生理盐水灌胃,连续观察7天,测定LD50值。根据预实验结果,正式急毒实验采用药物最大耐受量实验的方法进行研究,将40只小鼠随机分为给药组和对照组,给药组灌胃当日予小鼠可承受最大给药体积和最高给药浓度的补肾促卵方浓溶液3次,对照组灌胃给予等体积生理盐水,每次间隔约4h,连续观察14天,密切观察小鼠的死亡情况、反应症状、体重变化、饲料消耗量,以及主要脏器大体形态改变和脏器指数情况。二、补肾促卵方浓度筛选实验雌性Balb/c小鼠随机分为:空白组、模型组、补肾促卵方低剂量组、补肾促卵方中剂量组、补肾促卵方高剂量组和戊酸雌二醇组。除空白组外,其余各组每日均予40mg/kg雷公藤多苷混悬液灌胃,同时补肾促卵方低剂量、中剂量和高剂量组分别予浓度为0.13g/mL、0.27g/mL和0.53g/mL补肾促卵方混悬液0.2mL灌胃;戊酸雌二醇组予0.015mg/mL戊酸雌二醇混悬液0.2mL灌胃;空白组和模型组予0.2mL生理盐水灌胃。每组均连续干预30天,观察各组小鼠一般情况、动情周期变化,计算性腺指数,测定血清性激素（FSH、LH、E2）含量,并通过HE染色观察卵巢组织形态及卵泡计数情况。三、补肾促卵方调控PI3K/AKT/mTOR信号通路保护原始卵泡池的作用机制雌性Balb/c小鼠随机分为:空白组、模型组、补肾促卵方组和激素序贯组。除空白组外,其余各组每日均予40mg/kg雷公藤多苷混悬液灌胃,同时补肾促卵方组予0.27g/mL补肾促卵方混悬液灌胃;激素序贯组予戊酸雌二醇联合醋酸甲羟孕酮进行序贯治疗;空白组和模型组予等体积生理盐水灌胃。每组均连续干预30天,观察各组小鼠一般情况、动情周期变化,测量并计算各个脏器指数情况,检测血清性激素（AMH、INHB、FSH、LH、E2）水平,并通过HE染色观察子宫、卵巢形态学改变以及卵泡计数情况。为了进一步明确补肾促卵方保护雷公藤多苷诱导DOR小鼠原始卵泡池的作用机制,采用Western blot法检测卵巢组织PI3K/AKT/mTOR 信号通路关键蛋白 PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR表达水平,并采用RT-PCT分别检测PI3K、AKT、mTOR mRNA表达水平。四、补肾促卵方调控Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路保护生长卵泡的作用机制在实验三的基础上,研究发现雷公藤多苷除了诱导原始卵泡发生过度激活外,还可引起卵泡发生过度闭锁。为了深入探讨雷公藤多苷诱导DOR是通过使原始卵泡过度激活、致使生长卵泡闭锁增加,还是直接诱导原始卵泡发生闭锁。在此基础上本实验对小鼠卵巢组织进行了 TUNEL荧光染色,并通过免疫组化法观察卵巢组织Cyt C、Caspase-3表达情况。为了进一步明确补肾促卵方抑制雷公藤多苷引起卵泡过度闭锁的作用机制,本实验采用Western blot法检测卵巢组织凋亡相关蛋白CytC、Caspase-3、Bax、Bcl-2表达水平,同时采用RT-PCT检测Bax、Bcl-2mRNA表达水平。五、补肾促卵方调控Nrf2/ARE信号通路抑制卵巢氧化损伤的作用机制在上述实验基础上,研究发现雷公藤多苷可通过诱导原始卵泡过度激活,并使进入生长卵泡池的颗粒细胞发生过度凋亡,促使卵泡异常闭锁,从而造成DOR。基于氧化应激是启动细胞凋亡程序的重要调控因素,为了进一步探索雷公藤多苷诱导卵泡颗粒细胞凋亡的作用机制以及补肾促卵方对其保护作用,本实验对卵巢组织8-OHdG、MDA、CAT、GSH-Px、SOD的水平进行了测定,同时采用Western blot和RT-PCT对卵巢组织Nrf2/ARE信号通路关键蛋白和基因Bach 1、Nrf2、Keap 1、HO-1的表达水平进行了检测。研究结果一、补肾促卵方急毒实验预实验结果提示补肾促卵方测不出LD50,故正式急毒实验采用最大耐受量实验的方法进行研究,结果显示补肾促卵方灌胃给药后,所有动物均未见死亡并且存活至实验结束。除给药组小鼠在灌胃后2h内出现静伏、活动减少、D0粪便色黑以及D1摄食量减少外,各组小鼠在其他时间点的一般状况良好。实验过程中两组小鼠日均饲料消耗量无明显差异,小鼠体重呈稳定上升趋势。两组小鼠主要脏器大体解剖均未见异常现象,主要脏器指数也无明显差异。二、补肾促卵方浓度筛选实验各组小鼠在实验期间进食、活动和大小便均无明显异常,补肾促卵方干预后小鼠体毛致密有光泽:除空白组外,各组小鼠予雷公藤多苷灌胃后,体重先呈下降趋势,随后逐渐增加至正常水平,至实验结束,各组小鼠体重无明显差异。补肾促卵方中、高剂量组能有效地改善小鼠动情周期,升高子宫和卵巢指数（P<0.05）,下调血清FSH、LH水平（P<0.01）,并增加原始卵泡、窦状卵泡和黄体计数（P<0.01）,减少闭锁卵泡计数（P<0.01）。三、补肾促卵方调控PI3K/AKT/mTOR信号通路保护原始卵泡池的作用机制各组小鼠一般情况、体重及动情周期变化趋势与实验二结果一致。补肾促卵方干预后小鼠卵巢指数升高（P<0.01）,血清AMH和INHB水平上升（P<0.01）,FSH、FSH/LH值下降（P<0.01,P<0.05）;补肾促卵方能增加卵巢原始卵泡、窦状卵泡和黄体计数（P<0.01,P<0.05,P<0.01）,减少次级卵泡和闭锁卵泡数目（P<0.01）,同时下调早期生长卵泡与原始卵泡比值（P<0.01）。补肾促卵方能增加小鼠子宫内膜厚度并使子宫内膜腺体数目增多。进一步研究发现补肾促卵方能下调卵巢组织 P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT、P-mTOR/mTOR 值（P<0.01）,同时减少 AKT和mTOR mRNA表达水平（P<0.01）,并使PI3K mRNA表达呈下降趋势。四、补肾促卵方调控Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路保护生长卵泡的作用机制卵巢组织TUNEL荧光染色主要出现在各级生长卵泡周围的颗粒细胞中,而位于皮质区的原始卵泡未见明显荧光着色,补肾促卵方干预后卵巢荧光面积和数量明显减少。免疫组化结果显示Cyt C和Caspase-3蛋白也主要表达于各级生长卵泡周围的颗粒细胞中,而原始卵泡表达较少,补肾促卵方能减少卵巢组织Cyt C和Caspase-3阳性表达面积比（P<0.01）。Western blot结果显示补肾促卵方能减少卵巢组织Cyt C、Caspase-3和Bax蛋白表达水平（P<0.05）,增加Bcl-2和Bcl-2/Bax值（P<0.05,P<0.01）,同时补肾促卵方能使Bax mRNA表达水平呈下调趋势,增加Bcl-2mRNA和Bcl-2/Bax值（P<0.01）。五、补肾促卵方调控Nrf2/ARE信号通路抑制卵巢氧化损伤的作用机制补肾促卵方能减少卵巢8-OHdG、MDA含量（P<0.05,P<0.01）,增加CAT、GSH-Px和SOD活力（P<0.01）。Western blot结果显示,补肾促卵方能下调Bach 1核蛋白和Keap1蛋白表达水平（P<0.01,P<0.05）,上调Nrf2核蛋白和HO-1蛋白表达水平（P<0.05）,同时补肾促卵方能下调Bach 1核易位率并上调Nrf2核易位率（P<0.01）。RT-PCT结果显示,模型组和补肾促卵方组Bach 1和Nrf2 mRNA水平均升高（P<0.01）,但补肾促卵方能下调Keap 1 mRNA并上调HO-1 mRNA表达水平（P<0.05,P<0.01）。研究结论1.补肾促卵方最大耐受量为660.00g生药/kg/d,相当于临床用药量的240倍,该方临床用量安全无毒。2.补肾促卵方中、高剂量能够有效地保护雷公藤多苷诱导DOR小鼠的卵巢储备功能,且两者疗效相当,故在后续实验中选择中剂量进行研究。3.补肾促卵方能通过抑制卵巢PI3K/AKT/mTOR信号通路,逆转雷公藤多苷诱导DOR小鼠原始卵泡过度激活,减少卵泡异常闭锁,从而起到保护卵巢储备功能的作用。4.补肾促卵方能通过抑制卵巢Bax/Cyt C/Caspases-3信号通路,上调Bcl-2表达,减少生长卵泡颗粒细胞过度凋亡,从而防止雷公藤多苷诱导DOR小鼠出现生长卵泡异常闭锁。5.补肾促卵方能通过调控卵巢Nrf2/ARE信号通路,抑制Keap1过表达,促进Nrf2核易位,激活下游抗氧化酶活性,从而减轻雷公藤多苷诱导DOR小鼠卵巢出现氧化应激,防止卵泡颗粒细胞过度凋亡。
马睿[9]（2020）在《EGF与IGF-1对牦牛卵丘细胞自噬及胞吞相关蛋白表达的影响》文中研究表明细胞自噬和胞吞是细胞进行正常生命活动所必须的生理程序,其活性受到诸多因素的影响。生长因子作为哺乳动物体内的重要调节因子,可通过多种作用方式参与动物的卵泡发育、卵母细胞成熟及早期胚胎发育,但其对哺乳动物生殖相关细胞自噬及胞吞程序调控的相关研究目前仍十分少见。牦牛（Bos grunniens）作为高原地区重要经济畜种,其季节性发情、繁殖力低下的特征是牧区经济发展困难的主要原因之一,卵丘细胞紧紧围绕卵母细胞生长,它自身的自噬和胞吞活动对卵泡发育及卵母细胞成熟具有重要作用。本研究选取牦牛卵丘细胞为研究对象,探究表皮生长因子（Epidermal gr owth factor,EGF）和胰岛素样生长因子-1（Insulin-like growth factor,IGF-1）对其自噬和胞吞活动的影响。使用浓度为0（对照组）、50、100、150、200 ng/mL的EGF和适宜浓度（10μmol/L）表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）抑制剂Gefitinib以及浓度为0（对照组）、50、100、150、200 ng/mL的IGF-1作用于牦牛卵丘细胞,提取细胞总RNA和总蛋白。利用qRT-PCR及Western-blot等技术分别测定各浓度下自噬相关基因5（Autophagy related gene 5,Atg5）、Bcl-2同源结构域蛋白（Bcl-2homologous domain protein,Beclin1）、微管相关蛋白轻链3（Microtubule-associated protein light chain 3,LC3）以及胞吞相关蛋白小窝蛋白1（Caveolin1,Cav1）、小窝蛋白2（Caveolin2,Cav2）的相对表达量,并结合免疫荧光技术对5种蛋白在细胞的表达定位进行比较分析。结果如下:1)成功体外培养牦牛卵丘细胞,经鉴定,自噬相关蛋白Atg5、Beclin1、LC3及胞吞相关蛋白Cav1、Cav2在牦牛卵丘细胞均有表达,且主要分布在胞质中。2)经不同浓度EGF处理的牦牛卵丘细胞,自噬基因Atg5表达量较对照组（0 ng/mL）下降,且Atg5蛋白和Atg5-Atg12复合物表达量与EGF浓度负相关,各处理组表达量均显着低于对照组（0 ng/mL）（P<0.05）,自噬基因Beclin1、LC3及蛋白Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达先下降后回升,均在100 ng/mL处达到最低（P<0.05）;Cav1、Cav2 mRNA与蛋白的相对表达均与EGF浓度正相关,在200 ng/mL处最高（P<0.05）。3)抑制EGFR后,LC3 mRNA和蛋白相对表达量均显着增高（P<0.05）,其他自噬基因及蛋白表达无显着变化（P>0.05）;Cav1、Cav2 mRNA和蛋白相对表达量均显着升高（P<0.05）。4)经不同浓度IGF-1处理的牦牛卵丘细胞,自噬相关基因Atg5、Beclin1、LC3及蛋白Atg5、Atg5-Atg12、Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相对表达量均先下降而后上升,在100 ng/mL处理组均达到最低,与其他处理组差异显着（P<0.05）;Cav1和Cav2 mRNA和蛋白相对表达量均与IGF-1呈浓度依赖,随IGF-1浓度增大,表达量先下降后回升。综上,体外培养牦牛卵丘细胞时添加EGF和IGF-1均可影响自噬及胞吞相关基因和蛋白的表达,且作用效果与EGF和IGF-1浓度相关;两种生长因子均可抑制牦牛卵丘细胞自噬,100 ng/mL为最佳作用浓度;胞吞相关小窝蛋白Cav1、Cav2表达量与EGF和IGF-1浓度呈现一定的正相关关系,两种生长因子均在作用浓度为150 ng/mL时对Cav1、Cav2表达均有很好的促进作用。EGF和IGF-1参与牦牛卵丘细胞自噬及胞吞的生物学功能调控,以上研究结果为进一步研究生长因子参与动物生殖相关细胞自噬与胞吞作用,及其对卵母细胞成熟和胚胎发育的作用机制提供理论依据。
叶城[10]（2020）在《草鱼大脑和垂体中神经肽挖掘及速激肽功能鉴定》文中进行了进一步梳理在脊椎动物中,大脑和垂体是机体内极其重要的器官。大脑可以通过合成与释放神经肽调节垂体激素的合成与分泌,进而参与机体生长、生殖、应激和免疫等生理过程的调控。与哺乳动物不同,鱼类的下丘脑-垂体轴缺失了门脉系统,因此调控垂体激素合成与分泌的上游神经肽变得更为庞大和复杂。基于此,本研究以草鱼（Ctenopharyngodon idellus）为研究对象,首先,通过组织切片技术分析草鱼不同大脑亚区及垂体的形态和显微结构,并结合生物信息学方法初步探究草鱼各脑区和垂体的功能及各脑区间的相互关系。接着,基于草鱼基因组数据库和草鱼大脑各亚区和垂体的转录组数据,挖掘草鱼大脑和垂体中的神经肽编码基因及其相关受体信息,并对它们在草鱼大脑不同亚区和垂体内的分布进行分析。最后,以挖掘出的速激肽家族的神经肽为切入点,分别研究了TAC3编码产物NKB和NKBRP以及TAC4编码产物HK1和HK2在草鱼垂体内的功能及其作用机制。主要研究结果如下:1、草鱼大脑和垂体的形态学和组织学H.E染色切片结果显示,草鱼大脑主要由6个亚区构成,包括嗅球、端脑、视顶盖、下丘脑、小脑和延脑。与软骨鱼类和哺乳类不同,草鱼大脑和垂体间无下丘脑-垂体门脉系统,下丘脑的神经元直接伸入并终止于前腺垂体内。通过分析草鱼不同脑区和垂体的转录组测序数据,本研究发现嗅球可能与生殖和免疫有关;端脑可能参与食欲和生殖的调控;视顶盖不仅在视觉系统中发挥重要功能,并可能涉及摄食行为的调控;下丘脑在摄食和生殖过程中扮演重要角色;延脑与听觉系统有关;垂体在能量代谢、器官发育和生殖过程中起关键作用。相关性分析结果显示,下丘脑和端脑不仅在结构上高度相关,其功能也存在重叠性,表明端脑和下丘脑可能是硬骨鱼类摄食和生殖的调控中心。2、结合草鱼基因组数据库和草鱼大脑各亚区及垂体的转录组数据,本研究系统地挖掘了来自23个家族共计91个神经肽前体编码基因,以及上述神经肽相对应的112个受体基因。基于RNA-seq数据,对上述基因在草鱼6个不同大脑亚区和垂体内的转录本表达水平进行分析。最后,结合已有研究和本研究的结果,对神经肽及其受体在草鱼大脑和垂体的主要合成区域和功能行使位置进行了预测。3、以草鱼垂体细胞为研究对象,转录组分析表明NKB能够诱导垂体内729个基因的差异表达,这些基因涉及了激素活性、食物摄入、信号转导和代谢等。体外细胞培养和RT-q PCR结果显示,NKB在草鱼垂体细胞中可以以时间和剂量依赖的方式诱导四种厌食肽（UTS1、CART、POMCb和NMB）m RNA的表达。受体选择性和受体后信号通路实验结果显示,NKB对草鱼垂体中UTS1、CART、POMCb和NMB表达的刺激作用均能由NK3R介导。这些反应激活了腺苷酸环化酶/蛋白激酶A（c AMP/PKA）通路、磷脂酶C/肌醇1,3,5-三磷酸/蛋白激酶C（PLC/IP3/PKC）通路和Ca2+/钙调蛋白/Ca M-依赖性蛋白激酶II(Ca2+/Ca M/Ca MK-II)通路。此外,腹腔注射NKBa能够显着诱导草鱼垂体内这四种厌食肽m RNA表达。此外,摄食实验结果显示,草鱼进食后下丘脑内的TAC3a和TAC3b m RNA表达显着提高。这些结果表明,NKB是一个饱感因子,它能够通过调节垂体中厌食肽的表达参与硬骨鱼类摄食调节。4、以草鱼为研究对象,本研究从草鱼大脑和垂体中克隆得到TAC4基因及其受体NK1Rb和NK3Ra1。序列分析显示草鱼TAC4能够编码HK1和HK2成熟肽。组织表达分析表明TAC4在下丘脑、嗅球和延脑中高表达,受体NK1Rb、NK3Ra2和NK3Rb等均在垂体中有较高的表达,预示TAC4在草鱼垂体中可能发挥重要功能。通过在HEK293T细胞膜上表达NKRs,HK2对6个NKRs均有较高的激活效率,其中对NK2R应是HK2的特异性受体;而HK1仅能微弱激活NK2R、NK3Ra2和NK3Rb。转录组测序和生物信息学分析结果显示,HK2能够诱导垂体细胞内1051个基因差异表达,这些基因主要涉及食欲的负调节、激素活性、受体配体结合和G蛋白偶联受体信号通路等。在草鱼垂体原代细胞中,HK2能够以时间依赖性和剂量依赖性的方式促进PRL、SLα、UTS1、NMB1、CART2和SN2 m RNA表达,而HK1对上述基因均无显着反应。为了解析HK1在草鱼垂体内的失活原因,本研究将含VFGLM基序的HK1修改为FFGLM基序的HK1突变体（HK1-M）。受体-配体反应表明,不同于HK1,HK1-M对6个NKRs展现了很高的激活效率。同时,HK1-M能够显着诱导草鱼垂体细胞内UTS1、PRL和SLαm RNA表达。此外,HK1和HK2共处理垂体细胞实验显示,HK1不能有效阻断HK2在垂体中的功能,表明HK1不是HK2的内源性拮抗剂。综上结果表明,HK2可以直接作用于草鱼垂体细胞,通过受体NKRs的介导,促进垂体内PRL、SLα、UTS1、CART2、NMB1和SN2的m RNA表达;而HK1因其FXGLM序列突变致使其功能丢失。综上所述,本研究建立了草鱼不同大脑亚区和垂体的解剖学和转录组数据库,对草鱼不同脑区以及垂体的结构和功能做出了初步分析,深入挖掘了草鱼大脑和垂体内的神经肽前体及其受体基因,并以速激肽家族为切入点,研究了TAC3编码产物和TAC4编码产物在垂体中的功能及作用机制。本研究有助于丰富我们对鱼类大脑不同亚区显微结构和功能的认识,为进一步深入研究鱼类神经肽的功能提供了基础。
二、胰岛素样生长因子系统与哺乳动物生殖（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胰岛素样生长因子系统与哺乳动物生殖（论文提纲范文）
（1）视黄醇结合蛋白4对猪卵泡颗粒细胞功能的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 哺乳动物卵泡发育调控的研究进展 |
| 1.1 哺乳动物卵泡发育的特点 |
| 1.2 哺乳动物卵泡发育和闭锁的调控 |
| 1.3 颗粒细胞对哺乳动物卵泡发育和闭锁的影响 |
| 第2章 RBP4的研究进展 |
| 2.1 RBP蛋白简介 |
| 2.2 RBP基因简介 |
| 2.3 RBP4生物学功能 |
| 第3章 RBP4在动物繁殖中的研究进展 |
| 3.1 RBP4的基因多态性与母猪繁殖性能 |
| 3.2 RBP4在生殖系统中的表达和定位 |
| 3.3 RBP4与卵巢颗粒细胞 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 pLVX-RBP4慢病毒过表达载体的构建、包装和鉴定与si RNA干扰效果研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 RBP4对猪卵泡颗粒细胞凋亡和孕酮分泌的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 RBP4调控猪卵泡颗粒细胞功能的分子机制解析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 RBP4通过ERK1/2通路调控猪卵泡颗粒细胞凋亡和孕酮分泌的机制研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读博士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）能量负平衡奶牛产后乏情的关键蛋白筛选及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 奶牛能量负平衡与繁殖的关系 |
| 1.1.1 奶牛能量负平衡的概述 |
| 1.1.2 能量负平衡对奶牛发情周期和繁殖的影响 |
| 1.2 奶牛卵泡生长发育的研究进展 |
| 1.2.1 卵泡发育的生理过程 |
| 1.2.2 奶牛产后腔前卵泡发育 |
| 1.2.3 排卵前卵泡的发育 |
| 1.3 能量负平衡对奶牛卵泡发育的影响 |
| 1.3.1 卵泡液中能量代谢对卵泡发育的影响 |
| 1.3.2 卵泡内细胞对葡萄糖的摄取 |
| 1.3.3 卵泡内细胞对脂肪酸的摄取 |
| 1.3.4 葡萄糖和脂肪酸代谢之间的稳态对卵泡内细胞的影响 |
| 1.3.5 能量负平衡对奶牛产后发情的影响 |
| 1.4 奶牛蛋白质组学的研究进展 |
| 1.4.1 蛋白组学技术在奶牛临床上的作用 |
| 1.4.2 奶牛血液蛋白质组学 |
| 1.4.3 奶牛组织蛋白质组学 |
| 1.5 奶牛脂联素的研究进展 |
| 1.5.1 脂联素与能量代谢的关系 |
| 1.5.2 脂联素与生殖机能的关系 |
| 1.5.3 脂联素在奶牛繁殖中的作用 |
| 1.6 PI3K-AKT信号通路与奶牛卵泡生长发育的关系 |
| 1.6.1 PI3K-AKT信号通路 |
| 1.6.2 PI3K-AKT信号通路在卵泡发育中的作用 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要试验仪器 |
| 2.1.3 实验耗材和试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 试验动物分组 |
| 2.2.2 试验样品采集 |
| 2.2.3 样品处理 |
| 2.2.4 生化指标的检测 |
| 2.2.5 Western blot 检测方法 |
| 2.2.6 免疫组化检测方法 |
| 2.2.7 ELISA 检测方法 |
| 2.2.8 统计学分析方法 |
| 2.2.9 血清、卵泡液和卵巢皮质组织的蛋白组学分析 |
| 2.2.10 差异表达蛋白 ADPN 与 NEB 奶牛乏情的关系及其风险预警作用 |
| 2.2.11 ADPN 对低糖环境下奶牛体外 GCs 增殖和类固醇激素合成的影响 |
| 2.2.12 ADPN 经 PI3K-AKT 信号通路对低糖环境下 GCs 增殖和类固醇激素合成的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 两组试验奶牛临床病理学变化 |
| 3.1.1 试验奶牛临床信息的比较 |
| 3.1.2 试验奶牛血液生化指标水平的比较 |
| 3.2 两组试验奶牛蛋白组学分析结果的比较 |
| 3.2.1 试验奶牛血清、卵泡液和卵泡腔组织匀浆液中蛋白浓度 |
| 3.2.2 蛋白质鉴定结果和质谱总体分析 |
| 3.2.3 血清差异蛋白及其生物信息学分析结果 |
| 3.2.4 卵泡液差异蛋白及其生物信息学分析结果 |
| 3.2.5 卵巢组织差异蛋白及其生物信息学分析结果 |
| 3.3 两组试验奶牛DEP的免疫印迹验证结果 |
| 3.3.1 血清中DEP疫印迹验证 |
| 3.3.2 卵泡液中DEP疫印迹验证 |
| 3.3.3 卵巢皮质组织差异蛋白免疫印迹验证 |
| 3.4 能量负平衡所致的乏情奶牛DEP的韦恩分析结果 |
| 3.5 ADPN与NEB奶牛乏情的关系及其风险预警作用 |
| 3.5.1 试验牛产后生化指标的水平 |
| 3.5.2 试验奶牛产后血液和卵泡液生化指标相关性分析 |
| 3.5.3 试验奶牛卵巢组织中ADPN及其受体的基因表达水平 |
| 3.5.4 试验奶牛组织中ADPN及其受体的蛋白表达水平 |
| 3.5.5 奶牛产后NEB与血清ADPN的关系 |
| 3.5.6 奶牛产后14-21d血清ADPN对产后55-60d卵泡发育的风险预警作用 |
| 3.6 ADPN对低糖环境下奶牛颗粒细胞增殖和激素分泌的影响 |
| 3.6.1 奶牛体外培养的颗粒细胞(GCs)模型的鉴定 |
| 3.6.2 低糖培养对GCs类固醇激素分泌的影响 |
| 3.6.3 低糖培养对GCs增殖的影响 |
| 3.6.4 低糖培养GCs对ADPN受体的影响 |
| 3.6.5 低糖培养模型中ADPN最佳添加剂量和时间 |
| 3.6.6 低糖培养模型下不同浓度ADPN对GCs激素分泌的影响 |
| 3.6.7 低糖培养模型中添加不同浓度ADPN对GCs增殖的影响 |
| 3.7 ADPN经PI3K-AKT信号通路对低糖环境下GCs增殖和激素分泌的影响 |
| 3.7.1 ADPN对低糖培养GCs模型中AKT磷酸化的影响 |
| 3.7.2 ADPN 经 PI3K/AKT 通路对低糖培养 GCs 模型细胞活性的影响 |
| 3.7.3 ADPN 通过 PI3K-AKT-CDK2 对低糖培养 GCs 模型 CDK2 的影响 |
| 3.7.4 ADPN 经 PI3K/AKT 对低糖培养 GCs 模型类固醇激素合成的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 能量负平衡奶牛产后乏情蛋白组学分析及其差异蛋白的潜在作用 |
| 4.2 ADPN与NEB奶牛卵泡发育的关系及其风险预警作用 |
| 4.3 ADPN对低糖环境下奶牛颗粒细胞增殖和类固醇激素合成的影响 |
| 4.4 ADPN 经 PI3K-AKT 对低糖环境下 GCs 增殖和类固醇激素合成的影响 |
| 5 结论 |
| 6 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）胰岛素样生长因子与表皮生长因子在草鱼垂体中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 垂体与垂体激素 |
| 2 IGFS/IGFBPS家族研究进展 |
| 2.1 IGFs/IGFBPs家族简介 |
| 2.2 IGFs/IGFBPs系统在哺乳动物中的研究现状 |
| 2.3 IGFs/IGFBPs系统在硬骨鱼类中的研究现状 |
| 3 表皮生长因子家族研究现状 |
| 3.1 表皮生长因子家族受体配体简介 |
| 3.2 表皮生长因子家族研究进展 |
| 4 研究的主要目的及意义 |
| 第二章 IGF1/IGFBP1A调控草鱼垂体LH、FSH的作用机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂及仪器设备 |
| 2.3 草鱼垂体组织样品获得与石蜡切片制作 |
| 2.4 草鱼IGFBP1a分子克隆与组织表达分析 |
| 2.5 草鱼垂体细胞培养 |
| 2.6 转录组测序与生物信息学分析 |
| 2.7 实时定量PCR检测 |
| 2.8 IGF1和IGFBP1a对垂体细胞中LHβ和FSHβ的调控作用 |
| 2.9 Western Blot检测信号通路 |
| 2.10 免疫组化定位IGFBP1a、LH、FSH在垂体组织中的表达情况 |
| 2.11 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 草鱼IGFs、IGFBP1a、IGFBP1b序列分析及三维结构预测 |
| 3.2 组织表达分析 |
| 3.3 转录组结果分析 |
| 3.4 LH、FSH位于中腺垂体区,IGFBP1a位于神经垂体区 |
| 3.5 IGF1与IGFBP1a差异调控LHβ、FSHβ的表达 |
| 3.6 IGF1和IGFBP1a互作对FSHβ和LHβ的影响 |
| 3.7 IGF1和IGFBP1a互作的信号通路机制 |
| 4 讨论 |
| 第三章 表皮生长因子对UTS1、EGR1和MMP13的调控机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器设备与试剂 |
| 2.3 细胞培养、RNA提取与cDNA文库构建 |
| 2.4 转录组差异基因分析与功能富集分析 |
| 2.5 实时定量PCR检测 |
| 2.6 EGF对垂体细胞中UTS1、EGR1、MMP13和TIMP3的调控作用 |
| 2.7 EGF调控差异基因的受体选择性与受体后信号通路 |
| 2.8 Western Blot检测信号通路 |
| 2.9 数据分析 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 转录组分析 |
| 3.2 EGF诱导草鱼垂体细胞中关键基因的表达 |
| 3.3 EGF诱导UTS1与EGR1基因表达受体选择性以及受体后信号通路 |
| 3.4 EGF诱导MMP13表达的受体选择性与受体后信号转导 |
| 3.5 MMP13参与EGF诱导UTS1和EGR1的表达 |
| 4 讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）IGFBP-3和GalNAc-T14对脑胶质瘤细胞增殖和周期的影响及其信号机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 胰岛素样生长因子系统与肿瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）促黄体素与雌激素在小鼠和山羊卵丘扩展中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物卵母细胞生长发育与成熟研究进展 |
| 1.1 卵子发生与卵泡发育 |
| 1.1.1 卵子发生 |
| 1.1.2 卵泡发育 |
| 1.2 减数分裂阻滞的维持与相关分子机制 |
| 1.2.1 哺乳动物第一次减数分裂阻滞 |
| 1.2.2 维持卵母细胞减数分裂阻滞的分子机制 |
| 1.3 卵母细胞减数分裂恢复与后续发育潜能的获得 |
| 1.3.1 卵母细胞减数分裂恢复 |
| 1.3.2 卵母细胞的后续发育潜能 |
| 1.4 卵丘扩展 |
| 1.4.1 卵丘细胞 |
| 1.4.2 卵丘细胞与卵母细胞的互作调控 |
| 1.4.3 卵丘细胞扩展 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 雌激素及其受体在卵巢中的功能研究进展 |
| 2.1 雌激素 |
| 2.1.1 雌激素的定义、生物合成与代谢 |
| 2.1.2 雌激素的生理功能 |
| 2.2 雌激素核受体与雌激素的基因组效应 |
| 2.2.1 雌激素核受体的分子结构 |
| 2.2.2 雌激素核受体信号的调控机制 |
| 2.3 雌激素膜受体与雌激素的非基因组效应 |
| 2.3.1 雌激素膜受体的分子结构 |
| 2.3.2 雌激素膜受体的定位与表达 |
| 2.3.3 雌激素膜受体功能预测 |
| 2.4 雌激素对卵丘扩展的调控作用 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 表皮生长因子信号通路参与调控卵母细胞成熟过程的机制研究进展 |
| 3.1 表皮生长因子与受体概述 |
| 3.1.1 表皮生长因子与受体 |
| 3.1.2 表皮生长因子信号通路的功能 |
| 3.2 表皮因子受体信号通路在卵母细胞成熟过程中的作用 |
| 3.2.1 LH上调颗粒细胞中类表皮样生长因子表达 |
| 3.2.2 EGFR信号通路在卵母细胞成熟过程中的作用 |
| 3.3 小结 |
| 3.4 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 第四章 促黄体素对卵丘卵母细胞复合体中GPR30水平的调控作用及其作用机制研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 研究对象 |
| 4.1.2 试验材料 |
| 4.1.3 液体配制 |
| 4.1.4 小鼠COCs的回收与体外培养 |
| 4.1.5 表皮生长因子受体抑制小鼠模型的制备与超数排卵处理 |
| 4.1.6 山羊卵泡与COCs的回收与体外培养 |
| 4.1.7 实时荧光定量聚合酶链式反应 |
| 4.1.8 蛋白免疫印迹试验(Western blot) |
| 4.1.9 免疫荧光染色 |
| 4.1.10 数据统计 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 LH/h CG对小鼠COC中 GPR30 基因表达的调控作用 |
| 4.2.2 LH/h CG对小鼠COC中 GPR30 蛋白水平的调控作用 |
| 4.2.3 LH/h CG诱导类表皮样生长因子表达调控小鼠COCs中 GPR30 水平 |
| 4.2.4 EGF下调体外培养的小鼠COCs中 GPR30 基因表达水平 |
| 4.2.5 EGF上调体外培养的小鼠COCs中 GPR30 蛋白水平 |
| 4.2.6 EGF通过激活小鼠卵丘细胞上的EGF受体上调GPR30 蛋白水平 |
| 4.2.7 LH对山羊卵泡COC中GPR30基因表达的调控作用 |
| 4.2.8 LH对山羊卵泡COC中GPR30蛋白水平的调控作用研究 |
| 4.2.9 LH诱导山羊卵泡壁颗粒细胞表达类表皮样生长因子,进而上调山羊COCs中 GPR30 的水平 |
| 4.2.10 山羊COCs体外成熟培养过程中GPR30 基因表达变化趋势检测 |
| 4.2.11 EGF上调体外培养的山羊COCs中 GPR30 蛋白水平 |
| 4.2.12 EGF通过激活山羊COCs的 EGF受体上调GPR30 蛋白水平 |
| 4.2.13 EGF通过非基因组途径调控山羊COCs中的GPR30 蛋白水平变化 |
| 4.2.14 EGF激活EGFR上调GPR30 蛋白水平的作用发生在卵丘细胞上 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 EGFR信号通路介导了LH上调COCs中 GPR30 蛋白水平的作用 |
| 4.3.2 LH/EGF通过非基因组途径调控COCs中 GPR30 的蛋白水平 |
| 4.3.3 LH信号上调COCs中 GPR30 蛋白水平的作用发生在卵丘细胞上 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 表皮生长因子受体信号通路调控颗粒细胞中GPR30蛋白降解的机制研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 研究对象 |
| 5.1.2 试验材料 |
| 5.1.3 液体配制 |
| 5.1.4 小鼠原代卵泡颗粒细胞的收集与培养 |
| 5.1.5 实时荧光定量聚合酶链式反应 |
| 5.1.6 蛋白免疫印迹试验(Western blot) |
| 5.1.7 免疫荧光染色 |
| 5.1.8 细胞溶酶体活性检测 |
| 5.1.9 数据统计 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 EGF通过激活EGFR上调原代卵泡颗粒细胞中GPR30 蛋白水平 |
| 5.2.2 EGFR激活延长了卵泡颗粒细胞中GPR30 蛋白的半衰期 |
| 5.2.3 卵泡颗粒细胞中GPR30蛋白降解途径检测 |
| 5.2.4 EGFR激活降低了卵泡颗粒细胞中的溶酶体活性 |
| 5.2.5 EGFR激活减少了卵泡颗粒细胞中溶酶体的数量 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 雌激素通过GPR30信号通路调节卵丘细胞中表皮生长因子受体水平的机制研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 研究对象 |
| 6.1.2 试验材料 |
| 6.1.3 液体配制 |
| 6.1.4 小鼠COCs的回收与体外培养 |
| 6.1.5 山羊卵泡与COCs的回收与体外培养 |
| 6.1.6 蛋白免疫印迹试验 |
| 6.1.7 数据统计 |
| 6.2 试验结果 |
| 6.2.1 体内成熟过程中小鼠COCs中 EGFR蛋白水平检测 |
| 6.2.2 体外成熟培养过程中小鼠COCs中 EGFR蛋白水平检测 |
| 6.2.3 17β-E_2 激活GPR30 信号通路上调小鼠COCs中 EGFR蛋白水平 |
| 6.2.4 在卵泡中成熟的山羊COCs中 EGFR蛋白水平检测 |
| 6.2.5 体外成熟培养的山羊COCs中 EGFR蛋白水平检测 |
| 6.2.6 17β-E_2 激活GPR30 信号通路上调山羊COCs中 EGFR蛋白水平 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 17β-E_2 激活GPR30 信号通路上调COCs中 EGFR蛋白水平 |
| 6.3.2 较高的EGFR蛋白水平有助于维持EGFR的持续激活 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 雌激素通过激活GPR30 通路增强LH/EGF信号促进卵丘扩展的研究 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 研究对象 |
| 7.1.2 试验材料 |
| 7.1.3 液体配制 |
| 7.1.4 小鼠COCs的回收与体外培养 |
| 7.1.5 山羊COCs的回收与体外培养 |
| 7.1.6 实时荧光定量聚合酶链式反应 |
| 7.1.7 卵丘扩展分级与扩展指数统计 |
| 7.1.8 数据统计 |
| 7.2 试验结果 |
| 7.2.1 GPR30信号通路激活加强了EGF促进小鼠卵丘扩展的作用 |
| 7.2.2 17β-E_2通过GPR30信号通路促进小鼠卵丘扩展相关基因表达 |
| 7.2.3 GPR30信号通路激活加强了EGF促进山羊卵丘扩展的作用 |
| 7.2.4 17β-E_2通过GPR30信号通路促进山羊卵丘扩展相关基因表达 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 E_2/GPR30信号通路激活加强了EGF促进卵丘扩展的作用 |
| 7.3.2 E_2/GPR30信号通路激活加强了EGF上调卵丘扩展相关基因的作用 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 缩略词 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）磷酸三（1,3-二氯-2-丙基）酯诱导秀丽隐杆线虫衰老效应及健康风险分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 TDCPP概述 |
| 1.2.1 TDCPP的理化性质 |
| 1.2.2 TDCPP的生产及应用 |
| 1.2.3 TDCPP的立法及监管措施 |
| 1.3 TDCPP的环境赋存及生物暴露 |
| 1.3.1 TDCPP在灰尘中赋存现状 |
| 1.3.2 TDCPP在空气中赋存现状 |
| 1.3.3 TDCPP在水环境中赋存现状 |
| 1.3.4 TDCPP在土壤中赋存现状 |
| 1.3.5 TDCPP在沉积物中赋存现状 |
| 1.3.6 TDCPP在生物体赋存现状 |
| 1.3.7 TDCPP人体暴露情况 |
| 1.4 TDCPP的毒理学效应及分子机制 |
| 1.4.1 急性毒性 |
| 1.4.2 神经毒性 |
| 1.4.3 内分泌干扰效应 |
| 1.4.4 发育毒性 |
| 1.4.5 生殖毒性 |
| 1.4.6 肝肾毒性 |
| 1.5 TDCPP对人体健康风险 |
| 1.5.1 TDCPP对人体细胞的毒性效应及作用机制 |
| 1.5.2 TDCPP人群暴露健康风险 |
| 1.6 环境污染物暴露的衰老效应及分子作用机制 |
| 1.6.1 氧化自由基损伤机制 |
| 1.6.2 胰岛素/胰岛素样生长因子-1信号通路机制 |
| 1.6.3 进食限制延缓衰老机制 |
| 1.7 研究目的和意义 |
| 1.8 研究内容 |
| 1.9 技术路线 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 秀丽隐杆线虫品系及菌株 |
| 2.1.2 人体正常肝细胞 |
| 2.2 实验药品 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 主要培养基及溶液配制 |
| 2.4.1 主要溶液配制 |
| 2.4.2 培养基配制 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 TDCPP溶液配制 |
| 2.5.2 E.coli OP50的培养和冻存 |
| 2.5.3 线虫冻存、复苏、培养及同步化 |
| 2.5.4 线虫暴毒 |
| 2.5.5 细胞复苏、冻存及传代 |
| 2.5.6 细胞暴毒 |
| 2.6 测试方法 |
| 2.6.1 秀丽隐杆线虫TDCPP外暴露和内暴露定量检测 |
| 2.6.2 秀丽隐杆线虫生理指标测定 |
| 2.6.3 秀丽隐杆线虫生化指标测定 |
| 2.6.4 秀丽隐杆线虫有参转录组mRNA测序 |
| 2.6.5 秀丽隐杆线虫有参转录组Small RNA测序及数据分析 |
| 2.6.6 mRNA基因表达测定 |
| 2.6.7 miRNA基因表达的测定 |
| 2.6.8 人体肝细胞L02蛋白表达测定 |
| 2.6.9 同源建模及分子对接 |
| 2.7 数据分析 |
| 第3章 多场景TDCPP暴露对秀丽隐杆线虫的毒性效应 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 多场景TDCPP暴露对秀丽隐杆线虫发育行为的影响 |
| 3.2.2 多场景TDCPP暴露对秀丽隐杆线虫繁殖行为的影响 |
| 3.2.3 多场景TDCPP暴露对秀丽隐杆线虫运动行为的影响 |
| 3.2.4 多场景TDCPP暴露对秀丽隐杆线虫寿命的影响 |
| 3.2.5 多场景TDCPP暴露对秀丽隐杆线虫肠道通透性的影响 |
| 3.2.6 多场景TDCPP暴露对秀丽隐杆线虫氧化应激水平的影响 |
| 3.2.7 多场景TDCPP暴露对秀丽隐杆线虫细胞凋亡水平的影响 |
| 3.2.8 多场景TDCPP暴露对秀丽隐杆线虫脂褐素水平的影响 |
| 3.2.9 秀丽隐杆线虫内暴露水平分析 |
| 3.3 本章小结 |
| 第4章 TDCPP暴露诱导氧化自由基损伤机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 TDCPP暴露对秀丽隐杆线虫脂质过氧化水平的影响 |
| 4.2.2 氧化应激水平对脂质过氧化累积的影响 |
| 4.2.3 TDCPP暴露对秀丽隐杆线虫整体基因表达的影响 |
| 4.2.4 差异表达基因功能富集分析—GO分析 |
| 4.2.5 差异表达基因功能富集分析—KEGG分析 |
| 4.2.6 谷胱甘肽S-转移酶差异基因表达验证 |
| 4.2.7 谷胱甘肽S-转移酶在衰老过程中的作用 |
| 4.3 本章小结 |
| 第5章 TDCPP暴露干扰非常规Insulin/IGF-1信号通路 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 Insulin/IGF-1信号通路关键基因转录情况 |
| 5.2.2 DAF-18对秀丽隐杆线虫运动行为的影响 |
| 5.2.3 DAF-18对秀丽隐杆线虫寿命的影响 |
| 5.2.4 TDCPP暴露对秀丽隐杆线虫磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸的影响 |
| 5.2.5 TDCPP暴露对秀丽隐杆线虫DAF-16::GFP核质定位水平的影响 |
| 5.2.6 DAF-16/FoxO对秀丽隐杆线虫运动行为的影响 |
| 5.2.7 DAF-16/FoxO对秀丽隐杆线虫寿命的影响 |
| 5.2.8 非常规Insulin/IGF-1信号通路中关键指标相关性分析 |
| 5.3 本章小结 |
| 第6章 TDCPP暴露诱导miR-48/84抑制寿命中心因子 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 结果与讨论 |
| 6.2.1 秀丽隐杆线虫Small RNA测序分析 |
| 6.2.2 TDCPP暴露对秀丽隐杆线虫整体miRNA差异表达分析 |
| 6.2.3 差异表达miRNA靶基因注释及富集分析 |
| 6.2.4 Small RNA测序中寿命相关显着富集通路 |
| 6.2.5 寿命调节关键miRNA确认及表达验证 |
| 6.2.6 TDCPP与cel-miR-48-5p/cel-miR-84-5p三维建模及分子对接 |
| 6.2.7 miR-48和miR-84对寿命调节的关键作用 |
| 6.3 本章小结 |
| 第7章 TDCPP暴露诱导衰老分子机制的物种间同源性 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 结果与讨论 |
| 7.2.1 非常规Insulin/IGF-1信号通路同源基因在L02细胞中的表达 |
| 7.2.2 L02细胞中非常规Insulin/IGF-1信号通路蛋白表达 |
| 7.2.3 多物种IGF1R蛋白同源建模 |
| 7.2.4 TDCPP与多物种IGF1R蛋白分子对接分析 |
| 7.2.5 多物种PTEN蛋白同源建模 |
| 7.2.6 TDCPP和多物种PTEN蛋白分子对接分析 |
| 7.3 本章小结 |
| 第8章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
| 攻读博士学位期间获奖情况 |
| 攻读博士学位期间参加学术会议情况 |
（7）细胞因子bFGF和LIF对雏鸡原始卵泡发育的调节作用及其机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽类卵泡生长情况和概述 |
| 1.1.1 鸡胚卵巢发育概述 |
| 1.1.2 鸡原始卵泡发生概述 |
| 1.1.3 鸡原始卵泡发育激活概述 |
| 1.1.3.1 PTEN/PI3K/AKT/FOXO3信号通路 |
| 1.1.3.2 抗缪勒氏管激素 |
| 1.2 细胞因子对早期卵泡发育的调控 |
| 1.2.1 成纤维细胞生长因子家族 |
| 1.2.2 白血病抑制因子 |
| 1.2.3 血管内皮生长因子 |
| 1.2.4 骨形态发生蛋白家族 |
| 1.2.4.1 BMPs |
| 1.2.4.2 GDF9 |
| 1.2.5 胰岛素样生长因子家族 |
| 1.2.6 神经生长因子 |
| 1.2.7 激活素、抑制素和卵泡抑素 |
| 1.3 激素对早期卵泡发育的调控 |
| 1.3.1 性腺激素 |
| 1.3.2 促性腺激素 |
| 1.3.3 生长激素 |
| 1.4 miRNA在早期卵巢发育中的作用 |
| 1.4.1 miRNA的作用方式 |
| 1.4.2 miRNA对雌性生殖的作用 |
| 1.5 lncRNA在早期卵巢发育中的作用 |
| 1.5.1 lncRNA的作用方式 |
| 1.5.2 lncRNA对雌性生殖的作用 |
| 1.6 本研究的目的和内容 |
| 1.6.1 研究目的和意义 |
| 1.6.2 研究目标和内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第二章 雏鸡卵巢早期卵泡发育中miRNA表达的变化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要器材 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 卵巢的获取 |
| 2.2.5 RNA的提取 |
| 2.2.6 RNA质量及浓度的检测 |
| 2.2.7 文库的构建及质量的检测 |
| 2.2.8 cDNA的合成 |
| 2.2.9 qRT-PCR |
| 2.2.10 测序数据的处理分析 |
| 2.2.11 差异表达基因的筛选 |
| 2.2.12 差异表达基因的聚类分析及富集分析 |
| 2.2.13 差异表达基因的靶基因预测 |
| 2.2.14 数据的处理分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 检测结果总表 |
| 2.3.2 RNA质量的鉴定 |
| 2.3.3 测序数据的质量评估及过滤 |
| 2.3.4 sRNA长度的筛选 |
| 2.3.5 与参考序列的比较 |
| 2.3.6 差异表达miRNA的筛选 |
| 2.3.7 RNA-seq结果的验证 |
| 2.3.8 不同发育阶段卵巢中差异表达miRNA的比较 |
| 2.3.9 miRNA及其主要靶基因的时间表达变化 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 雏鸡卵巢早期卵泡发育中lncRNA表达的变化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要器材 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 卵巢的获取 |
| 3.2.5 RNA的提取 |
| 3.2.6 RNA质量及浓度的检测 |
| 3.2.7 文库的构建及质量的检测 |
| 3.2.8 cDNA的合成 |
| 3.2.9 qRT-PCR |
| 3.2.10 测序数据的处理分析 |
| 3.2.11 差异表达基因的筛选 |
| 3.2.12 差异表达基因的聚类分析及富集分析 |
| 3.2.13 差异表达基因的靶基因预测 |
| 3.2.14 数据的处理分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 测序数据的质量评估与比较 |
| 3.3.2 差异表达lncRNA的筛选 |
| 3.3.3 RNA-seq结果的验证 |
| 3.3.4 lncRNA共定位基因的富集分析 |
| 3.3.5 lncRNA共表达基因的富集分析 |
| 3.3.6 不同发育阶段卵巢中差异表达lncRNA的比较 |
| 3.3.7 相关mRNA的差异表达 |
| 3.3.8 lncRNA及其主要靶基因的时间表达变化 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 bFGF对雏鸡原始卵泡发育的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 主要器材 |
| 4.2.3 主要试剂及配制 |
| 4.2.4 卵巢的获取 |
| 4.2.5 卵巢组织的培养和药物处理 |
| 4.2.6 制片及HE染色 |
| 4.2.7 免疫组化 |
| 4.2.8 RNA的提取 |
| 4.2.9 cDNA的合成 |
| 4.2.10 普通PCR及qPCR |
| 4.2.11 BrdU实验 |
| 4.2.12 TUNEL染色 |
| 4.2.13 Westen blot分析 |
| 4.2.14 数据的处理分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 FGFR1在雏鸡卵巢中定位及其表达的变化 |
| 4.3.2 bFGF在雏鸡卵巢中的定位 |
| 4.3.3 bFGF体外处理剂量的筛选 |
| 4.3.4 bFGF对卵泡细胞增殖的影响 |
| 4.3.5 bFGF对卵泡细胞凋亡的影响 |
| 4.3.6 bFGF对原始卵泡激活相关基因表达的影响 |
| 4.3.7 bFGF对原始卵泡激活的影响 |
| 4.3.8 FSHR在雏鸡卵巢中的定位 |
| 4.3.9 bFGF和FSH联合处理对卵泡细胞增殖和凋亡的影响 |
| 4.3.10 FSHR特异性证明 |
| 4.3.11 bFGF和FSH联合处理对细胞增殖相关信号转导蛋白表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 LIF对雏鸡原始卵泡发育的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 主要器材 |
| 5.2.3 主要试剂及配制 |
| 5.2.4 卵巢的获取 |
| 5.2.5 卵巢组织的培养和药物处理 |
| 5.2.6 制片及HE染色 |
| 5.2.7 免疫组化 |
| 5.2.8 BrdU实验 |
| 5.2.9 TUNEL染色 |
| 5.2.10 Western blot分析 |
| 5.2.11 透射电镜和细胞超微结构的观察 |
| 5.2.12 数据的处理分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 LIF在雏鸡卵巢中定位及其表达的变化 |
| 5.3.2 LIFR在雏鸡卵巢中定位及其表达的变化 |
| 5.3.3 LIF体外处理剂量的筛选 |
| 5.3.4 LIF对卵泡细胞增殖的影响 |
| 5.3.5 LIF对卵泡细胞凋亡的影响 |
| 5.3.6 LIF对体外培养雏鸡卵巢的缝隙连接的影响 |
| 5.3.7 LIF对原始卵泡激活的影响 |
| 5.3.8 LIF和bFGF联合处理对卵泡细胞发育以及相关信号蛋白表达的影响 |
| 5.3.9 卵泡发育中LIF和Wnt/β-catenin信号通路的交互作用 |
| 5.3.10 卵泡发育中bFGF和Wnt/β-catenin信号通路的交互作用 |
| 5.3.11 LIF体内处理剂量的筛选及其对雏鸡卵巢中增殖相关蛋白表达的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 提示和创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）补肾促卵方调控PI3K和Nrf2信号通路保护卵巢储备功能低下的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 文献研究 |
| 综述一 原始卵泡激活与卵巢储备功能低下的研究进展 |
| 1 原始生殖细胞形成、迁移和增殖 |
| 2 性腺发育与性别决定 |
| 3 原始卵泡形成 |
| 4 原始卵泡激活 |
| 5 原始卵泡激活与卵巢储备功能低下 |
| 综述二 卵巢储备功能低下中医研究进展 |
| 1 病名的阐释 |
| 2 病因 |
| 3 病机 |
| 4 治疗 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 补肾促卵方安全性评价的研究 |
| 实验一 补肾促卵方急毒实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 补肾促卵方保护雷公藤多普诱导DOR小鼠卵巢储备功能的机制研究 |
| 实验二 补肾促卵方浓度筛选实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 补肾促卵方调控PI3K/AKT/mTOR通路保护原始卵泡池的作用机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 实验四 补肾促卵方调控Bax/Cyt C/Caspase-3通路保护生长卵泡的作用机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 实验五 补肾促卵方调控Nrf2/ARE通路抑制卵巢氧化损伤的作用机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（9）EGF与IGF-1对牦牛卵丘细胞自噬及胞吞相关蛋白表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略词 |
| 主要仪器 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 卵丘细胞在雌性哺乳动物早期生殖事件中的作用 |
| 1.1 卵泡发生发育及卵泡闭锁 |
| 1.2 卵丘细胞的发生及分化 |
| 1.3 卵丘细胞对卵母细胞发育及成熟的影响 |
| 1.4 卵丘细胞在卵母细胞受精和早期胚胎发育中的作用 |
| 1.5 牦牛卵丘细胞的研究意义 |
| 2 细胞自噬的研究进展 |
| 2.1 细胞自噬概念及相关信号通路 |
| 2.2 细胞自噬与哺乳动物生殖的关系 |
| 3 小窝蛋白介导的胞吞研究进展 |
| 3.1 小窝蛋白和胞吞简介 |
| 3.1.1 胞吞的结构基础——小窝 |
| 3.1.2 胞吞的功能使者——小窝蛋白 |
| 3.2 小窝蛋白在哺乳动物生殖中的相关研究 |
| 3.3 胞吞与自噬的联系 |
| 4 EGF和 IGF-1 的研究进展 |
| 4.1 EGF简介及相关研究进展 |
| 4.2 IGF-1简介及相关研究进展 |
| 5 本研究的目的及意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 实验一 自噬及胞吞相关蛋白表达在牦牛卵丘细胞中的表达定位 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 牦牛卵巢样品的采集 |
| 1.1.2 主要试剂及配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 牦牛卵丘细胞的分离培养及冻存 |
| 1.2.2 间接免疫荧光检测自噬及胞吞相关蛋白在牦牛卵丘细胞中的分布 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 牦牛卵丘细胞培养 |
| 2.2 自噬相关蛋白Atg5、Beclin1、LC3 在牦牛卵丘细胞中的分布 |
| 2.3 胞吞相关蛋白Cav1、Cav2 在牦牛卵丘细胞中的分布 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验二 EGF 对牦牛卵丘细胞自噬及胞吞相关蛋白表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 PCR检测牦牛卵丘细胞自噬及胞吞相关基因mRNA的表达 |
| 1.3 Western-blot检测牦牛卵丘细胞自噬及胞吞相关蛋白的表达 |
| 1.4 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 普通PCR验证引物及模板 |
| 2.2 EGF对牦牛卵丘细胞自噬相关基因Atg5、Beclin1、LC3 表达的影响 |
| 2.3 EGF对牦牛卵丘细胞胞吞相关基因Cav1、Cav2 表达的影响 |
| 2.4 EGF对牦牛卵丘细胞自噬相关蛋白Atg5、Atg5-Atg12、Beclin1、LC3 表达的影响 |
| 2.5 EGF对牦牛卵丘细胞胞吞相关蛋白Cav1、Cav2 表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验三 IGF-1对牦牛卵丘细胞自噬及胞吞相关蛋白表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 PCR检测牦牛卵丘细胞自噬及胞吞相关基因mRNA的表达 |
| 1.3 Western-blot检测牦牛卵丘细胞自噬及胞吞相关蛋白的表达 |
| 1.4 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 普通PCR验证引物及模板 |
| 2.2 IGF-1 对牦牛卵丘细胞自噬相关基因Atg5、Beclin1、LC3 表达的影响 |
| 2.3 IGF-1 对牦牛卵丘细胞胞吞相关基因Cav1、Cav2 表达的影响 |
| 2.4 IGF-1 对牦牛卵丘细胞自噬相关蛋白Atg5、Atg5-Atg12、Beclin1、LC3 表达的影响 |
| 2.5 IGF-1 对牦牛卵丘细胞自噬相关蛋白Cav1、Cav2 表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者介绍 |
（10）草鱼大脑和垂体中神经肽挖掘及速激肽功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 脊椎动物大脑和垂体研究概况 |
| 2 大脑和垂体中调节机体功能的重要调控因子 |
| 3 速激肽家族研究进展 |
| 4 研究主要目的及意义 |
| 第二章 草鱼大脑与垂体的结构和功能的初步研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 草鱼脑和垂体组织样品获得 |
| 2.4 石蜡组织切片的制作 |
| 2.4.1 常规石蜡切片制作过程 |
| 2.4.2 H.E染色 |
| 2.5 总RNA提取 |
| 2.6 RNA-seq测序、质控、参考序列比对和基因注释 |
| 2.7 差异表达基因的富集分析和组织间关系分析 |
| 2.8 RT-q PCR验证及数据统计分析 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 草鱼大脑和垂体的整体结构 |
| 3.2 草鱼大脑各亚区和垂体的转录组数据总览 |
| 3.3 草鱼嗅球的显微结构和转录组分析 |
| 3.4 草鱼端脑的显微结构和转录组分析 |
| 3.5 草鱼视顶盖的显微结构和转录组分析 |
| 3.6 草鱼下丘脑的显微结构和转录组分析 |
| 3.7 草鱼小脑的显微结构和转录组分析 |
| 3.8 草鱼延脑的显微结构和转录组分析 |
| 3.9 草鱼垂体的显微结构和转录组分析 |
| 3.10 草鱼各脑区和垂体的关联分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 嗅球可能在免疫响应中起重要作用 |
| 4.2 端脑参与食欲和生殖调节 |
| 4.3 视顶盖在视觉系统和摄食中的重要性 |
| 4.4 下丘脑作为潜在的摄食和生殖的调节中枢 |
| 4.5 草鱼小脑未解之谜 |
| 4.6 延脑在听觉系统中的潜在作用 |
| 4.7 垂体在机体生长、生殖、能量代谢以及器官发育中的重要功能 |
| 4.8 端脑和下丘脑—可能的摄食和生殖调控中枢 |
| 第三章 草鱼大脑和垂体内神经肽及其受体的挖掘和分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.3 草鱼各脑亚区及垂体总RNA提取 |
| 2.4 转录组测序 |
| 2.5 草鱼大脑和垂体内神经肽及其受体的挖掘和转录本表达分布 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 Apelin家族 |
| 3.2 NMB/GRP家族 |
| 3.3 Calcitonin家族 |
| 3.4 CART家族 |
| 3.5 CRH家族 |
| 3.6 CCK/Gastrin家族 |
| 3.7 GRL/MLN家族 |
| 3.8 Glucagon家族 |
| 3.9 GnRH家族 |
| 3.10 INS/IGF家族 |
| 3.11 MCH家族 |
| 3.12 NPP家族 |
| 3.13 NPB/NPW家族 |
| 3.14 NTS家族 |
| 3.15 Neuromedin家族 |
| 3.16 NPY家族 |
| 3.17 Opioid家族 |
| 3.18 HCRT家族 |
| 3.19 PTH家族 |
| 3.20 RFamide家族 |
| 3.21 SST家族 |
| 3.22 TAC家族 |
| 3.23 TRH家族 |
| 第四章 TAC3编码产物在草鱼垂体中的功能及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 转录组测序与生物信息学分析 |
| 2.4 NKBa在草鱼垂体细胞中的功能分析 |
| 2.5 NKBa促进垂体摄食因子表达的受体选择性和信号通路分析 |
| 2.6 草鱼NKBa在体功能验证 |
| 2.6.1 草鱼腹腔注射NKBa |
| 2.6.2 草鱼摄食实验 |
| 2.7 数据分析 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 NKBa诱导草鱼垂体细胞的转录组分析 |
| 3.2 NKBa对草鱼垂体细胞中CART、UTS1、NMB和 POMCb的调节 |
| 3.3 NKBa诱导草鱼垂体细胞中CART、UTS1、NMB和 POMCb合成的受体选择性实验 |
| 3.4 NKBa诱导CART、UTS1、NMB和 POMCb m RNA表达的受体后信号通路. |
| 3.5 在体实验验证NKBa对草鱼垂体内CART、UTS1、NMB和 POMCb合成的调控作用 |
| 3.6 摄食实验验证NKB与摄食调控的关系 |
| 4 讨论 |
| 第五章 TAC4编码产物对草鱼垂体中摄食肽的调控研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 草鱼TAC4和NKRs的分子克隆和组织表达分析 |
| 2.3.1 总RNA提取与逆转录 |
| 2.3.2 引物设计与PCR扩增 |
| 2.3.3 草鱼TAC4和NKRs序列分析及系统进化树构建 |
| 2.3.4 草鱼TAC4和NKRs的组织表达分布 |
| 2.4 转录组测序与生物信息学分析 |
| 2.5 HKs在草鱼垂体细胞中的功能分析 |
| 2.6 草鱼NKRs在 HEK293T细胞中的功能表达 |
| 2.7 HK1在草鱼垂体中的功能失活分析 |
| 2.8 数据分析 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 草鱼TAC4和NKRs的基因克隆及序列分析 |
| 3.2 草鱼TAC4和NKRs的组织表达分析 |
| 3.3 草鱼HKs和 NKRs的受体配体选择性实验 |
| 3.4 HK2诱导草鱼垂体细胞的转录组分析 |
| 3.5 HK1和HK2 对草鱼垂体细胞中关键DEGs mRNA表达的调节 |
| 3.6 HK1突变体在草鱼垂体中的功能分析及受体配体验证 |
| 4 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 1 研究总结 |
| 2 创新性 |
| 3 存在问题 |
| 4 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、胰岛素样生长因子系统与哺乳动物生殖（论文参考文献）
- [1]视黄醇结合蛋白4对猪卵泡颗粒细胞功能的影响及其机制研究[D]. 赵云. 吉林大学, 2021(01)
- [2]能量负平衡奶牛产后乏情的关键蛋白筛选及作用机制研究[D]. 赵畅. 黑龙江八一农垦大学, 2021(01)
- [3]胰岛素样生长因子与表皮生长因子在草鱼垂体中的功能研究[D]. 胡琼瑶. 华中农业大学, 2021
- [4]IGFBP-3和GalNAc-T14对脑胶质瘤细胞增殖和周期的影响及其信号机制研究[D]. 杨娇. 河北医科大学, 2021(02)
- [5]促黄体素与雌激素在小鼠和山羊卵丘扩展中的作用及其机制研究[D]. 刘洁. 西北农林科技大学, 2020
- [6]磷酸三（1,3-二氯-2-丙基）酯诱导秀丽隐杆线虫衰老效应及健康风险分子机制[D]. 王晨. 华东理工大学, 2020(08)
- [7]细胞因子bFGF和LIF对雏鸡原始卵泡发育的调节作用及其机理的研究[D]. 郭长权. 浙江大学, 2020
- [8]补肾促卵方调控PI3K和Nrf2信号通路保护卵巢储备功能低下的机制研究[D]. 陈燕霞. 中国中医科学院, 2020(01)
- [9]EGF与IGF-1对牦牛卵丘细胞自噬及胞吞相关蛋白表达的影响[D]. 马睿. 甘肃农业大学, 2020
- [10]草鱼大脑和垂体中神经肽挖掘及速激肽功能鉴定[D]. 叶城. 华中农业大学, 2020(02)