一、NITRIC OXIDE INHIBITS A RISE OF ATP-INTRODUCED CYTOSOLIC FREE Ca~(2+) CONCENTRATION AND RELEASE FROM INTRACELLULAR STORED Ca~(2+)（论文文献综述）
周玉荣[1]（2021）在《桃叶珊瑚苷对胰岛素抵抗的改善作用机制研究》文中研究表明胰岛素抵抗（IR）可引起胰岛素靶组织如脂肪、肝脏和骨骼肌等对葡萄糖摄取和利用的效率降低,易导致2型糖尿病（type 2diabetes mellitus,T2DM）的发生,因此,改善IR有助于T2DM的防治。研究发现,一些环烯醚萜类化合物能够改善IR,桃叶珊瑚苷（aucubin,AU）作为环稀醚萜苷类化合物中的一种,存在于杜仲、地黄等中药中,其有降血糖,改善IR的作用,但其具体作用机制尚不明确。基于此,本课题拟以肝脏细胞（HepG 2）为研究对象,探究AU对IR的改善作用及作用机制。首先,基于网络药理学探究AU改善IR的作用机制。结果发现,AU可能是通过多靶点多通路协同发挥改善IR作用。AU改善IR的靶点可能为蛋白激酶B（protein kinase B,Akt1）、白介素-6（interleukin,IL-6）、类胰岛素增长因子1（Insulin-like growth factor-1,IGF-1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators-activated receptors,PPARγ）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）等。其次,MTT法检测AU对HepG 2细胞毒性,AU浓度达到320μmol/L时,与对照组相比细胞活力大于80%,本实验选择AU处理HepG 2细胞IR模型组（IR-HepG 2）的药物浓度为40、80、160μmol/L。葡萄糖氧化酶法测定AU对IR-HepG 2细胞葡萄糖消耗量的影响,发现AU能够提高IR-HepG 2细胞的葡萄糖消耗量。再次,Western blotting检测胰岛素受体底物（insulin receptor substrate,IRS）/Akt胰岛素信号通路以及糖原合成关键蛋白糖原合成激酶3β（Glycogen Synthase Kinase-3β,GS3Kβ）磷酸化的表达和糖异生关键蛋白叉形头转录因子1（Forkhead transcription factor1,Fox O1）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase,G6Pase）的表达,发现AU激活IR-HepG 2细胞IRS/Akt信号通路,增加GS3Kβ磷酸化的表达;增强了Fox O1磷酸化,减弱了PEPCK和G6Pase蛋白表达量,证明AU是通过提高糖原合成和减弱糖异生来改善IR。最后,利用ELISA检测AU对IR-HepG 2细胞IL-6和TNF-α的影响。发现AU对IR-HepG 2细胞IL-6和TNF-α有抑制作用。利用荧光染色检测IR-HepG 2细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量,发现AU降低IR-HepG 2细胞内ROS的含量。综上,AU对IR具有一定的改善作用,这种作用可能是激活IRS/Akt信号通路,增加糖原合成,减缓糖异生,调控IR-HepG 2细胞炎症因子及ROS的量来实现的。为AU改善IR作用的进一步研究提供理论依据。
陈佳妮[2]（2021）在《小鼠神经细胞中CBS催化生成的H2S对脑微血管内皮细胞增殖、迁移和形成血管的影响及与VEGFR2的关系》文中研究指明血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）,是一种重要的血管生成调节因子,可增强内皮细胞有丝分裂、增殖和迁移及侧支血管的形成,在生理和病理性的血管生成中发挥着基本作用。VEGF作用是通过其特异的受体血管内皮生长因子受体（Vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR）来发挥的。VEGFR分为VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3三个亚型,其中,血管内皮生长因子受体2（Vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR2）主要参与内皮细胞有丝分裂的发生,介导了VEGF在内皮细胞中的大部分生物学效应。缺血后神经损伤修复过程中,脑血管再生直接关系到神经组织损伤的发展和修复。在血管再生过程中,血管内皮细胞的迁移与增殖是十分关键的环节。内源性硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）是一种气态信号分子,在机体的生理和病理过程中发挥着重要的作用,主要由胱硫醚β合成酶（Cystathionine-β-synthetase,CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（Cystathionine-γ-lyase,CSE）催化L-半胱氨酸（L-cysteine,L-Cys）来生成。CBS和CSE有组织分布特异性,CBS分布在神经细胞中,而CSE分布在血管组织中。因此,神经细胞主要通过CBS催化产生H2S。内源性H2S也是一种重要的血管活性物质,参与血管的生理和病理过程。有研究表明H2S可促进人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移,并有研究显示H2S可激活VEGFR2,si RNA介导的VEGFR2基因敲低可抑制H2S诱导的人血管内皮细胞的迁移。但是由脑细胞产生的神经源性H2S是否对脑血管内皮细胞的迁移与增殖产生一定的影响呢?尚未见这方面的研究报道。因此,本课题在体外观察了神经元CBS催化产生的H2S对小鼠脑微血管内皮细胞的增殖、迁移和形成血管的影响,并初步探讨了其作用与VEGFR2的关系。目的:1.观察H2S对内皮细胞增殖迁移的作用。2.探讨VEGFR2与H2S促进内皮细胞增殖迁移作用的关系。3.探讨细胞内游离Ca2+浓度与H2S促进内皮细胞增殖迁移作用的关系。4.观察H2S对内皮细胞血管生成的影响。方法:1.进行三种细胞株的传代培养,利用Transwell系统将小鼠海马神经细胞（HT22细胞）与小鼠脑微血管内皮细胞（b End.3细胞）进行共培养。2.采用siRNA小干扰技术,建立细胞转染模型。3.CCK-8法检测内皮细胞的增殖。4.细胞划痕法和Transwell法检测内皮细胞的迁移。5.甲基蓝法检测共培养体系内H2S的含量。6.钙荧光成像法检测内皮细胞胞内游离Ca2+浓度。7.血管生成实验检测H2S对内皮细胞成管能力的影响。实验结果:1.CCK-8实验结果表明与溶媒对照组比较,加入H2S供体Na HS(1×10-8～1×10-3.5 M)培养24 h时,小鼠脑微血管内皮细胞b End.3细胞和人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞增殖有明显的增强（P<0.01）。VEGF164（10 ng/m L）有类似的增强作用（P<0.01）。结果表明外源性H2S对小鼠脑微血管和人脐静脉内皮细胞的增殖有明显的促进作用。与溶媒对照组相比,加入1×10-3.5 M Na HS 1 h时,b End.3细胞和HUVEC细胞的增殖作用不明显,但在6 h时的增殖作用开始增强（P<0.01）,并且在48 h时,Na HS增殖作用进一步增加（P<0.01）。在b End.3细胞和HUVEC细胞中分别加入VEGFR2阻断剂SU5416 10μM培养24 h对这两种细胞的增殖均无明显的影响,但可显着地抑制1×10-3.5 M Na HS引起的b End.3细胞和HUVEC细胞的增殖（P<0.01）,提示外源性H2S促进小鼠脑微血管和人脐静脉内皮细胞增殖作用可能与VEGFR2有关。2.细胞划痕实验中,与溶媒对照组相比,Na HS(1×10-6～1×10-3.5 M)加入24 h可明显并呈浓度依赖性地增加b End.3细胞和HUVEC细胞的迁移面积（P<0.01）;Transwell实验结果表明与溶媒对照组相比,加入Na HS 1×10-3.5 M 24 h可明显地增加b End.3细胞和HUVEC细胞从Transwell上室膜内迁移到膜外的细胞数（P<0.01）。10 ng/m L VEGF164对b End.3细胞和HUVEC细胞的迁移面积和迁移细胞数有类似的作用（P<0.01）。结果表明外源性H2S可明显地促进小鼠脑微血管及人脐静脉内皮细胞的迁移。SU5416单独加入24 h对b End.3细胞和HUVEC细胞的迁移细胞数无明显的影响,但可显着地减少1×10-3.5 M Na HS或10 ng/m L VEGF164引起的b End.3细胞和HUVEC细胞的迁移细胞数的增加（P<0.01）,提示外源性H2S促进小鼠脑微血管及人脐静脉内皮细胞的迁移可能与VEGFR2有关。3.在细胞转染实验中,使用Western bolt法检测b End.3细胞中VEGFR2蛋白的表达。与溶媒对照组相比,转染试剂组和阴性对照组对VEGFR2蛋白的表达并无影响,而使用VEGFR2-si RNA1、VEGFR2-si RNA2、VEGFR2-si RNA3都可以下调VEGFR2蛋白的表达（P<0.05）,但其中VEGFR2-si RNA3下调VEGFR2蛋白的表达尤为显着（P<0.01）。因此,选择VEGFR2-si RNA3作为b End.3细胞中的有效干扰序列,以用于后续实验的研究。4.在小鼠海马神经元HT22细胞与脑微血管b End.3内皮细胞的共培养体系中,H2S合酶CBS底物L-cys（100μM）可明显地增加b End.3细胞增殖和迁移细胞数（P<0.01）;CBS抑制剂AOAA（1 m M）单独使用对b End.3细胞增殖和迁移细胞数无明显的影响,但可显着地减弱L-cys引起的b End.3细胞增殖和迁移细胞数的增加（P<0.01）。结果提示神经元CBS催化生成H2S可促进小鼠脑微血管内皮细胞的增殖和迁移。VEGFR2阻断剂SU5416或VEGFR2-si RNA单用对b End.3细胞增殖和迁移无明显的影响,但可显着地减弱L-Cys促进b End.3细胞增殖和迁移作用,提示HT22神经元CBS催化产生的H2S促小鼠脑微血管b End.3内皮细胞的增殖和迁移作用可能与VEGFR2有关。5.CBS底物L-Cys可显着提高小鼠海马神经元HT22细胞与脑微血管内皮细胞b End.3细胞共培养中的H2S含量（P<0.01）;CBS抑制剂AOAA和VEGFR2阻断剂SU5416或VEGFR2-si RNA单用对共培养中的H2S含量均无明显影响,但AOAA可明显地降低L-Cys引起的H2S含量的提高（P<0.01）,而SU5416或VEGFR2-si RNA3却无明显的影响。结果提示L-Cys可通过小鼠海马神经元CBS催化生成H2S来提高共培养中的H2S含量。6.在小鼠海马神经元HT22细胞与脑微血管内皮细胞b End.3细胞共培养中,加入CBS底物L-Cys可显着提高内皮细胞内Ca2+荧光强度（P<0.01）;加入CBS抑制剂AOAA和VEGFR2阻断剂SU5416或VEGFR2-si RNA单用对内皮细胞内Ca2+荧光强度均无明显影响,但AOAA和SU5416以及VEGFR2-si RNA能够降低L-Cys引起的内皮细胞内Ca2+荧光强度的提高（P<0.05）。结果提示L-Cys可通过小鼠海马神经元CBS催化生成H2S来提高共培养中的内皮细胞内游离Ca2+浓度,并可能与VEGFR2有关。7.在内皮细胞血管生成实验中,加入CBS底物L-Cys可显着提高内皮细胞管生成能力（P<0.01）;单用CBS抑制剂AOAA对内皮细胞管生成能力无明显影响,但AOAA能够降低L-Cys引起的内皮细胞管生成能力的提高（P<0.01）。结果提示L-Cys可通过小鼠海马神经元CBS催化生成H2S来提高共培养中的内皮细胞血管生成的能力。进行VEGFR2-si RNA转染后,与Vehicle组相比,VEGFR2-si RNA本身可以抑制内皮细胞的血管生成能力（P<0.01）,而VEGF164可以促进b End.3细胞的血管生成能力（P<0.01）,Na HS有着相似的作用（P<0.01）。但VEGF164不能促进VEGFR2-si RNA引起的内皮细胞血管生成能力的降低,而Na HS同样不能发挥促进作用,结果提示外源性H2S促进小鼠脑微血管的血管生成可能与VEGF164作用机制相似,可能与VEGFR2有关。结论:1.本研究首次表明小鼠海马神经元CBS可催化L-Cys生成H2S来促进小鼠脑微血管内皮细胞的增殖和迁移,并且神经元CBS催化生成的H2S可能通过激活VEGFR2,导致脑血管内皮细胞内游离Ca2+浓度升高来促进细胞增殖和迁移,至于H2S激活VEGFR2的其它途径及其详细机制有待于今后的进一步研究。2.神经元CBS催化生成的H2S可以促进脑血管内皮细胞的血管生成能力,并且H2S的促血管生成作用可能与VEGF作用相似。
鲜靖苹[3]（2020）在《草地早熟禾对Cd胁迫的分子响应及外源NO的缓解效应研究》文中进行了进一步梳理近年来由于人类活动导致“工矿三废”过度排放,造成严重的土壤重金属污染,严重危害人类身体健康,重金属污染土壤的修复治理已刻不容缓。植物修复是一种节能环保、环境友好型重金属清除技术,因其具有安全、环保、美观等优势而成为具有极大潜力的治理重金属污染土壤的方法。草地早熟禾（Poa pratensis）是我国广泛种植的多年生冷季型草坪草,根系发达,对重金属镉（Cadmium,Cd）有良好的吸收和积累能力,是修复Cd污染土壤的潜在植物。本研究通过对抗逆性生理指标的测定分析并利用分子生物学技术,系统评价不同草地早熟禾种质材料对Cd的耐受能力和响应机理,研究重金属Cd对草地早熟禾在转录层面的影响,同时探讨施加外源一氧化氮（Nitric Oxide,NO）对草地早熟禾Cd耐受性的调节机理。本研究中,具体研究结果如下:1.测定不同浓度Cd处理(0、200、400和600μmol·L-1)下10个草地早熟禾种质材料幼苗叶片干物质含量、叶片相对含水量、光合色素含量、丙二醛（MDA）和脯氨酸（Pro）含量、抗氧化酶等指标,运用隶属函数法对10份材料的耐Cd性进行综合评价,最终筛选出‘午夜’（Poa pratensis cv.Midnight）为耐Cd材料,‘橄榄球2号’（Poa pratensis cv.Rugby2）为Cd敏感材料。2.根施1000μmol·L-1氯化Cd（Cadmium chloride,CdCl2·2.5H2O）,草地早熟禾内源NO含量增加,添加一氧化氮清除剂（4-羧基苯-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物（cPTIO））、一氧化氮合酶抑制剂（L-硝基精氨酸甲酯（L-NAME））、硝酸还原酶抑制剂（钨酸钠（Tungstate））可增加SOD、CAT和APX（抗坏血酸过氧化物酶）活性,降低POD活性,增加叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、丙二醛含量,降低脯氨酸含量、叶片相对含水量（Relative Water Content,RWC）和干物质量（Dry matter content）。结果表明,一氧化氮合酶途径可能是早熟禾合成NO的主要途径,内源NO可通过调节抗氧化酶活性、光合色素含量、MDA和游离脯氨酸含量等途径缓解Cd胁迫。3.与1000μmol·L-11 Cd处理14 d的草地早熟禾相比,施加低浓度(即25、50、75μmol·L-1)的NO可以不同程度地缓解Cd对植物造成的伤害,而高浓度NO(即250、500μmol·L-1)对Cd胁迫的缓解效果不明显,即外源NO对Cd胁迫的缓解具有浓度效应,本试验中50μmol·L-1的NO效果最显着。进一步研究表明,1000μmol·L-1的Cd处理可降低草地早熟禾相对含水量,抗氧化酶活性,增加MDA和脯氨酸的积累,抑制根系生长;施加50μmol·L-1的NO能有效缓解Cd对幼苗的胁迫,可增加相对含水量,提高抗氧化酶活性,减少MDA和游离脯氨酸的累积,增加总根长、总根表面积、根尖数、分支数、交叉数,降低植株地上部和根系的Cd积累量。表明Cd胁迫可加重草地早熟禾氧化损伤程度,抑制草地早熟禾幼苗生长,外源NO可通过提高抗氧化酶活性、降低游离脯氨酸的累积、促进根系生长等途径缓解Cd胁迫对草地早熟禾的生长抑制。4.Cd胁迫下,选取耐Cd型（M）和Cd敏感型（R）草地早熟禾材料,对其幼苗进行了比较转录组（transcriptome）分析。M型材料共检测到7022个上调转录本和1033个下调转录本,而R型材料仅检测到850个上调转录本和846个下调转录本。进一步对M型材料的转录调控分析发现,Dof、MADS25、BBR-BPC、B3、bZIP23、MYB30可能是其应对Cd胁迫的枢纽转录因子,它们与碳水化合物、脂质和次级代谢以及信号转导相关的多功能基因协同作用。参与生长素、乙烯、油菜素甾体和ABA信号转导的差异表达基因与枢纽转录因子相互作用,形成信号转导级联,从而最终协调了与细胞壁和细胞膜稳定性、细胞伸长和Cd耐受性相关的多个基因的表达,包括IAAs,ARFs,SnRK2,PP2C,PIFs,BES1/BZR1,CCR,CAD,FATB,fabF and HACD。此外,还发现了CIPKs、MAPKs、WAXs、UBCs和E3泛素连接酶的转录后修饰,并参与了植物信号通路和非生物抗性相关的代谢过程,这有助于我们了解草地早熟禾与Cd耐性相关的转录调控和响应Cd胁迫的复杂的内部网络。5.研究施加外源NO对草地早熟禾Cd耐性在转录层面的调节机理,结果显示,4个处理组（CK、Cd、NO、Cd+NO）共有22 730个差异表达基因,包括15 332个上调基因和7 398个下调基因。KEGGs和GO分析发现,Cd与Cd+NO处理相比,DEGs主要参与丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号传导、植物激素信号转导、氨基酸转运与代谢、苯丙烷生物合成、碳水化合物转运与代谢、脂肪酸代谢以及生物合成相关通路。通过分析Cd处理与Cd+NO处理组的差异表达基因和代谢通路,筛选出谷氨酰胺-同型半胱氨酸甲基转移酶、蛋氨酸-γ-裂合酶、谷氨酰胺合酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、s-腺苷蛋氨酸合酶、过氧化物酶（POD）、udp-葡萄糖-6脱氢酶等一系列由NO信号介导的草地早熟禾响应Cd胁迫的关键基因,并将其列为缓解草地早熟禾Cd应激的候选基因,本研究为挖掘草地早熟禾耐Cd相关功能基因和调控因子奠定了坚实基础。
易晨龙[4]（2020）在《基于内皮细胞Calpain在心脏异种移植排斥反应中的调节作用研究》文中提出心脏移植是目前终末期心衰患者的唯一治愈希望,但供体短缺成为同种异体移植发展的瓶颈。异种心脏移植由于其生物源性及可修饰能力具有广阔的应用前景,但是复杂的免疫排斥反应是异种心脏移植临床应用的重要阻碍。异种移植的排斥反应主要包括超急性排斥反应（Hyper acute rejection,HAR）、延迟性排斥反应（Delayed xenograft rejection,DXR）或称为急性血管性排斥反应（Acute vascular rejection,AVR）和慢性细胞及体液排斥反应。目前基因编辑技术结合免疫疗法可有效控制HAR,但随后出现的DXR因其发生机制不明、治疗方法效果不佳,已成为异种心脏移植研究的主要障碍。DXR目前广泛认可的机制是以下三个方面:（1）活化的炎症细胞进行性浸润供体器官,（2）微血管内广泛的血小板聚集和纤维蛋白沉着,（3）供体血管内皮细胞活化。而内皮细胞激活在DXR的发生中发挥中枢作用。钙蛋白酶（Calpains）是一类细胞内钙依赖性水解酶,它们通过细胞内Ca2+激活及自溶而表现出蛋白水解酶的活性。Calpain系统目前有15个同工酶,其中Calpain 1和Calpain 2在组织中广泛分布而且是在内皮细胞中特有表达的Calpain。Calpastatin（CAST）是Calpain内源性特异性抑制剂蛋白。目前关于Calpain的研究越来越多,发现其在细胞增殖、分化、坏死和凋亡等生命过程中都发挥了重要的调节作用,但Calpain在异种移植免疫排斥中的作用未见研究报道。基于Calpain在同种移植及心血管病研究中的重要作用,Calpain在异种移植免疫排斥中的作用及相关机制的研究有一定的价值。目的:本研究在体内及体外建立异种移植模型,通过抑制内皮细胞中的Calpain活性来探讨内皮细胞Calpain在异种移植排斥反应中的作用。方法:（1）体内实验:利用内皮细胞特异性Capns1敲除小鼠建立小鼠-大鼠异种心脏移植模型,观察异种移植心脏存活时间;通过H&E和免疫组织化学染色来观察异种移植心脏病理形态学变化和炎性细胞浸润程度;（2）体外实验:将内皮细胞与大鼠血清/淋巴细胞共培养体外模拟异种免疫排斥反应,利用包装CAST的腺病毒转染小鼠心脏微血管内皮细胞（MCECs）,抑制Calpain活性;观察内皮细胞形态、细胞内Calpain的活性及内皮细胞对异种淋巴细胞黏附能力的影响;（3）相关机制研究:使用炎症因子TNF-α刺激内皮细胞,通过检测内皮细胞黏附分子、增殖、迁移和成管能力,以及核转录因子κB（NF-κB）的抑制蛋白（I-κB）和β-链蛋白（β-catenin）表达,分析Calpain在内皮细胞中激活和功能的作用。结果:在小鼠-大鼠异种心脏移植模型中,免疫抑制剂的应用能够使Capns1-/-小鼠的心脏存活时间明显长于野生型小鼠,病理学检测发现Capns1-/-小鼠的移植心脏炎性细胞浸润数量明显减轻;体外实验发现Calpain活性抑制可减少内皮中细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）的表达水平,同时保护内皮细胞的形态完整。体外TNF-α作用于内皮细胞能够激活内皮细胞,诱导细胞内Calpain活性提高,上调ICAM-1和VCAM-1的表达,并促进内皮细胞增殖,迁移和成管能力。TNF-α对内皮细胞的激活作用有赖于细胞内Calpain的活性,这与Calpain能够剪切I-κB,上调β-catenin的表达作用有关。结论:异种移植的DXR时期,内皮细胞Calpain活性增加促进内皮细胞黏附分子的表达,从而导致内皮细胞激活,增加炎性细胞的趋化和浸润,而Calpain活性抑制能后够减弱内皮细胞激活,减少移植物中的炎性浸润,延长移植物的存活时间。Calpain活性抑制还可以抵制炎症因子对内皮细胞功能的影响,降低内皮细胞增殖,迁移和成管能力,其机制与Calpain活性增加能够水解I-κB并上调β-catenin的表达水平有关。
田思聪[5]（2019）在《莱菔硫烷对肝脏脂肪滴形成的影响及MAM区的调控机制》文中进行了进一步梳理非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是以脂滴（lipid droplets,LDs）过度沉积于肝脏为特征的脂代谢紊乱疾病,可直接导致非酒精性脂肪肝炎、肝硬化、最终发展成肝癌。莱菔硫烷（sulforaphane,SFN）是富含于十字花科蔬菜中的一种异硫氰酸酯（isothiocyanates,ITCs）类植物化学物,具有多种生物学功能。前期研究发现,SFN能够改善糖尿病、肥胖和酒精性肝损伤等糖脂代谢紊乱引起的代谢型疾病,但SFN对高脂摄入引起的NAFLD是否也具有改善作用,及可能的作用机制尚未见报道。本文采用高脂膳食（highfat diet,HFD）建立NAFLD整体动物模型,以脂肪酸（fatty acid,FA）诱导HHL-5肝细胞为体外模型,并以SFN为干预因素,内质网（ER）与线粒体（MT）偶联区（MAM）作为主要研究核心,探讨SFN对肝脏脂滴形成的影响和改善NAFLD的分子机制。分别用HFD喂养大鼠10周,250 μmol/LFA诱导HHL-5肝细胞5 d,成功建立体内及体外肝细胞脂肪变模型。分别以不同剂量SFN（5,10,20 mg/kg）经口灌胃大鼠10周,及SFN（1,5,10,20μmol/L）处理HHL-5肝细胞,可降低大鼠血清和肝脏及HHL-5肝细胞中甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）含量。HE和油红O染色病理观察发现,SFN明显改善肝脏病理损伤,减少脂滴数量和平均面积。采用Western blot方法检测脂滴核心组份TG和TC合成关键酶二脂酰甘油酰基转移酶2（DGAT2）和胆固醇酰基转移酶（ACAT1）蛋白水平发现,SFN抑制其表达。Real-time PCR、免疫组化和Western blot方法检测脂滴表面结构蛋白发现,SFN抑制大鼠肝脏PLIN2和PLIN5 mRNA及蛋白水平表达;FA诱导HHL-5肝细胞10 d,PLIN2和PLIN5表达逐渐上升,SFN从第3 d到第10 d下调PLIN2和PLIN5表达。SFN抑制PLIN2/PLIN5的转录因子PPARγ表达;PPARγ兴奋剂Tro处理HHL-5肝细胞,TG含量上升,PLIN2及PLIN5表达上调。PPARγ兴奋和过表达后,SFN不再抑制PLIN2和PLIN5表达。上述结果提示,SFN不仅降低了脂滴脂肪核心的含量,更是通过抑制PPARγ下调脂滴外周蛋白PLIN2及PLIN5的表达,抑制脂滴形成。FA是合成脂滴脂肪核心的底物,Real-time PCR和Western blot方法检测FA合成相关酶ACC1、SCD1和FAS及其转录因子SREBP1c表达发现,SFN下调其mRNA及蛋白表达。动态观察发现,FA作用24 h后,SFN即下调SREBP1c;FA作用3d后,细胞内TG含量明显减少。ER是合成FA的关键细胞器,肝细胞透射电镜观察发现,SFN可明显修复ER的生理形态,减轻ER肿胀,缩短ER周长;同时改善MT生理形态。内质网应激（ERS）是调控FA合成相关酶的重要途径,Western blot检测发现,SFN下调ERS标志蛋白GRP78表达,降低ERS元件XBP1和PERK的mRNA及蛋白水平表达。采用ERS抑制剂4-PBA处理细胞,XBP1和SREBP1c mRNA表达被抑制,TG含量减少,脂滴形成也明显减少;可见,SFN与ERS抑制剂4-PBA作用类似。综上,SFN通过ERS 两条途径 XBP1-ACC1/SCD1 和 PERK-SREBP1c-FAS 减少脂质积累。ERS发生后,MT与ER形态和功能的变化使二者形成结构偶联区（MAM）。透射电镜观察大鼠肝脏及MT粗提物发现,SFN减轻了肝细胞中MT的膨胀,拉开MT与ER之间的距离,明显下调MAM区连接蛋白PACS2的表达,提示SFN有促进MAM区解体的倾向。SFN明显降低胞浆及MT中Ca2+浓度,从而降低MAM区内通讯信号分子活动。Western blot检测发现,SFN下调ER膜上Ca2+释放通道蛋白IP3R表达和MT内膜上吸收Ca2+的钙离子单向转运蛋白MCU的表达。SFN抑制MAM区中脂滴脂肪核心合成酶DGAT2和ACAT1的表达。高脂摄入严重损害MT的DNA（mtDNA）合成,SFN升高mtDNA表达量,恢复MT膜电位,减少ROS产生,从而减轻MT损伤。SFN提高MT氧化呼吸链中复合物IV的活性,促进ATP合成,改善能量代谢。综上,SFN抑制高脂诱导的肝细胞脂滴形成,其作用机制与抑制ERS,下调MAM区内Ca2+相关蛋白表达、促进MT的氧化磷酸化有关。
周青[6]（2019）在《ROS/ADMA/DDAHⅡ/eNOS/NO通路介导的铁过载损伤内皮细胞线粒体》文中提出目的:人们之前已经认识到铁过载可能损害身体健康。血管内皮细胞（VECs）是铁过载损伤的主要靶点之一,最初认为其机制与产生过量的活性氧（ROS）有关。然而,铁过载导致血管内皮细胞损伤的亚细胞区域、ROS生成的时间特征,下游潜在机制、ROS的靶细胞器以及不对称二甲基精氨酸（ADMA）/二甲基精氨酸二甲氨基水解酶Ⅱ（DDAHⅡ）/内皮一氧化氮合酶（eNOS）/一氧化氮（NO）通路在铁过载诱导的血管内皮细胞损伤中的作用均未被阐明。本次研究中,我们通过体外实验阐明了上述问题。方法:本实验中,我们用50μM右旋糖酐铁处理人脐静脉内皮细胞48小时以建立损伤模型。本实验进行了以下几个阶段的实验设计。第一阶段,确定铁过载是否对HUVECs造成损伤。实验随机分成4组:（1）对照组（Control）;（2）铁组（50μM Iron-D）;（3）pAD/DDAHⅡ预处理组（50μM Iron-D+pAD/DDAHⅡ）;（4）L-Arg预处理组（50μM Iron-D+1 mM L-Arg）。检测细胞存活率,LDH和caspase-3活性以及HUVECs的凋亡情况。第二阶段,确定铁过载是否能导致ROS大量生成。实验随机分成5组:（1）对照组（Control）;（2）铁组（50μM Iron-D）;（3）L-Arg预处理组（50μM Iron-D+1 mM L-Arg）;（4）Eda预处理组（50μM Iron-D+100μM Eda）;（5）CsA预处理组（50μM Iron-D+1μM CsA）。测定细胞存活率,LDH活性以及加铁后4,8,16,24和48小时的细胞和线粒体内ROS生成情况。第三阶段,确定ROS生成如何损伤VECs并探索ADMA/DDAHⅡ/eNOS/NO通路。实验随机分为6组:（1）对照组（Control）;（2）铁组（50μM Iron-D）;（3）pAD/DDAHⅡ预处理组（50μM Iron-D+pAD/DDAHⅡ）;（4）L-Arg预处理组（50μM Iron-D+1 mM L-Arg）;（5）pAD/DDAHⅡ-shRNA预处理组（50μM Iron-D+pAD/DDAHⅡ-shRNA）;（6）pAD/DDAHⅡ+L-NAME预处理组（50μM Iron-D+pAD/DDAHⅡ+10μM L-NAME）。检测细胞存活率,LDH活性,ADMA和NO水平,eNOS,p-eNOS,DDAHⅡ表达情况以及DDAHⅡ活性。第四阶段,确定铁过载的靶细胞器。实验随机分为5组:（1）对照组（Control）;（2）铁组（50μM Iron-D）;（3）pAD/DDAHⅡ预处理组（50μM Iron-D+pAD/DDAHⅡ）;（4）L-Arg预处理组（50μM Iron-D+1 mM L-Arg）;（5）CsA预处理组（50μM Iron-D+1μM CsA）。测定OCR,MMP,mPTP开放程度,从线粒体释放到胞浆中的Cyt C的表达量。结果:1.和对照组对比,铁组中的细胞存活率、一氧化氮含量、DDAHⅡ表达和活性、eNOS磷酸化都降低、LDH和caspase-3活性、ADMA含量、凋亡细胞比例明显升高。加入L-精氨酸（L-Arg）或pAD/DDAHⅡ后,上述变化均发生逆转。2.自由基清除剂Eda或ADMA的竞争性底物L-Arg,mPTP的关闭剂CsA都降低细胞和线粒体内ROS的生成,ROS最初在胞质内产生并激活ROS诱导的ROS释放（RIRR）机制,导致线粒体内产生大量ROS。3.用Eda,L-Arg,CsA或L-NAME处理铁过载损伤后的细胞,上调或下调DDAHⅡ的表达,可影响DDAHⅡ,ADMA和NO的活性,以及p-eNOS的表达。4.相比Control,铁处理组的细胞,OCR下降,MMP稳定性下降,mPTP开放,从线粒体释放到胞浆的Cyt C表达量显着增加,与pAD/DDAHⅡ,L-Arg,CsA共处理后,均可改善以上变化。结论:1、铁过载可导致ROS爆发,损伤血管内皮细胞;2、ADMA/DDAHⅡ/eNOS/NO通路在铁过载诱导的血管内皮细胞损伤中起关键作用;3、线粒体是铁诱导的血管内皮细胞损伤的靶细胞器。
杨亚娟[7]（2019）在《黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇改善氧化应激介导的糖尿病动物心房重构》文中研究表明目的心房颤动（房颤,AF）的发病机制十分复杂,包括炎症,氧化应激及钙稳态异常等。黄嘌呤氧化酶（XO）是嘌呤代谢过程的关键酶,其过度激活可使体内氧化应激水平升高。在本研究中,我们探讨了氧化应激和钙调控异常与心房电重构及结构重构的关系,以及黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇对以上病理过程的干预作用。方法本研究的动物实验部分应用了两种糖尿病动物模型:糖尿病兔模型和糖尿病大鼠模型。将90只成年大耳白兔随机分为3组:对照组（C,n=30）,糖尿病组（DM,n=30）及别嘌呤醇干预组（ALLO,n=30）,以四氧嘧啶溶液经兔耳缘静脉注射建立糖尿病兔模型。将成年雄性SD大鼠随机分为3组:对照组（n=30）,糖尿病组（n=30）及别嘌呤醇干预组（n=30）,以链脲佐菌素经大鼠尾静脉注射建立糖尿病大鼠模型。别嘌呤醇干预组在糖尿病模型建立成功后开始给药,药物干预时间为8/6周。在糖尿病兔/大鼠模型建立成功8/6周后,对各组动物进行在体心脏超声检查及血流动力学检测,取血清及组织标本,测定血清氧化应激指标,包括黄嘌呤氧化酶、一氧化氮、超氧化物歧化酶及丙二醛等。通过离体心脏灌流进行电生理研究,测定各组动物心房间传导时间,房室传导周期,心房有效不应期及房颤诱发率。通过马松染色观察心房间质纤维化水平,通过HE染色观察心房肌细胞排列情况。通过免疫组化观察心房组织XO表达情况,通过western blot法检测氧化应激（XO,Mn-SOD）,心肌纤维化及其上游相关蛋白（TGF-β,p-38,P-p38,JNK,P-JNK,ERK,P-ERK）、钙通道调控蛋白(Cav1.2,RyR2,SERCA2a,NCX,FKBP12.6,PLB,P-PLB)及线粒体代谢相关蛋白（TFAM,NRF-1,Drp-1,mfn1）表达情况。利用膜片钳技术测定左心房心肌细胞L型钙电流并利用共聚焦显微镜测定细胞内钙瞬变。为进一步研究钙信号通路上游的调控机制,通过免疫组化,western blot及PCR观察心房组织CaMKII及p-CaMKII蛋白及mRNA表达情况。培养小鼠心房肌细胞系HL-1细胞,将细胞随机分为4组:对照组,血管紧张素II（AngII）刺激组,别嘌呤醇预处理（10μM）+AngII刺激组,别嘌呤醇预处理（100μM）+AngII刺激组。通过检测HL-1细胞中ROS生成及MnSOD等蛋白表达测定各组HL-1细胞氧化应激水平,测定各组细胞CaMKII及p-CaMKII蛋白表达水平。结果超声检查及病理学研究发现,与对照组相比,糖尿病组动物左心室肥厚及心房间质纤维化程度增加,发生明显心脏结构重构。在电生理研究中,糖尿病组动物心房间传导时间及房室传导周期延长,房颤诱发率明显升高,发生明显心脏电重构。糖尿病组兔血清氧化应激指标,包括黄嘌呤氧化酶（XO）、一氧化氮（NO）及丙二醛（MDA）水平明显升高。另外,通过western blot检测蛋白表达发现,氧化应激、纤维化相关蛋白,包括XO,Mn-SOD,NF-κB,TGF-β,P-p38,P-JNK,ERK,P-ERK及线粒体合成代谢相关蛋白,包括TFAM,NRF-1,Drp-1,mfn1在糖尿病心房组织中表达水平均明显升高,应用别嘌呤醇干预可抑制心房结构重构及电重构,降低氧化应激、纤维化蛋白及线粒体合成相关蛋白表达。此外,糖尿病动物心房组织中钙通道蛋白如Cav1.2,NCX表达增加,L型钙电流密度及细胞内钙瞬变幅度均增大,提示糖尿病动物心房细胞内钙离子调控异常,应用别嘌呤醇干预后可改善钙离子通道重构。免疫组化及western blot显示糖尿病组动物心房组织CaMKII及p-CaMKII表达增加,应用别嘌呤醇干预后可降低其表达水平。另外,应用AngII刺激HL-1细胞后ROS生成及MnSOD表达水平有所上调,且CaMKII及p-CaMKII蛋白表达有一定程度升高,给别嘌呤醇干预后可在一定程度降低其水平。结论别嘌呤醇作为一种抗氧化剂,可通过抑制黄嘌呤氧化酶活性,减少体内活性氧的生成,抑制CaMKII活性,从而改善糖尿病兔心房结构重构及电重构,抑制细胞内钙离子调控异常,并改善线粒体代谢异常。因此,别嘌呤醇有可能成为糖尿病相关房颤的一种上游治疗方法。关于别嘌呤醇对房颤的治疗作用尚需进一步研究。
陈晓莉[8]（2019）在《BHAPI通过Mfn2对缺血性卒中后线粒体功能起保护作用》文中提出脑卒中后继发脑损伤是决定其预后的主要因素之一,而氧化损伤是脑卒中脑损伤的主要病理机制之一。据WHO统计,全球每年新发脑卒中患者1500万例,其中1/3例死亡,1/3例呈永久性残疾。在我国,每年新发脑卒中患者约200万例,其中120万人死亡,并以每年8.7%的速度增长,是继缺血性心脏病之后的第二位致死性疾病。随着医疗技术、护理等水平的提升,全球脑卒中死亡率已有下降趋势,但是其发病率、致残率仍呈持续增长趋势。脑卒中高致残率的特性严重影响患者的生活质量,明显加重患者家庭及社会的经济负担。缺血性脑卒中是脑卒中疾病中的主要类型,占75%。而目前对于缺血性卒中的病理生理机制仍未完全阐明,缺血性卒中的临床治疗也缺乏有效的治疗药物和方法。经过大量的体内、体外研究,越来越多的证据表明铁离子参与并加重缺血性卒中的病理过程,脑卒中后细胞内游离铁离子增多,对细胞产生较长时间的损害,也称为铁积累诱导的铁死亡,因此,铁螯合剂可以特异性地螯合并减少细胞内游离铁离子,可能成为一种新的神经保护剂。动物模型中的研究发现铁螯合剂对缺血性卒中病灶有保护作用,并在患者的临床观察中发现铁螯合剂甲基替拉扎特可以降低患者死亡率,改善临床预后,在缺血性卒中的治疗中具有一定的临床价值,但是因为传统铁螯合剂非选择地干扰铁代谢过程,导致细胞内铁缺乏和死亡,进而限制了其在临床应用。近年来研究由水杨醛异烟酰腙（SIH）改良的（E）-N’-（1-（2-（（4-（4,4,5,5-四甲基-1,2,3-二恶英-2-基）苄基）氧基）苯基）亚乙基）异烟酰肼（BHAPI）铁螯合剂是一类新型的选择性铁螯合剂,其既具有较好的稳定性,具有明显的抗氧化损伤作用,并且只针对损伤区域发挥特异性作用,不影响正常细胞内铁代谢,具有巨大的潜在保护作用。在前期心肌细胞强氧化剂氧化损伤的实验中被证实对于氧化应激损伤的保护和维持效果良好。但是目前,BHAPI对于缺血性卒中是否有保护作用,其效果如何尚不清楚。因此,我们通过构建体外缺血再灌注OGD/R细胞模型,探讨BHAPI对HT22细胞及线粒体的保护作用并探究其可能的机制。实验一BHAPI在OGD/R细胞模型中的变化及其对细胞的影响目的:检测BHAPI在缺血再灌注OGD/R细胞模型中是否可以转化成HAPI,以及BHAPI对OGD/R细胞模型的HT22细胞的保护作用。方法:用HT22海马神经元细胞建立体外缺血再灌注OGD/R细胞模型,并加入不同浓度梯度的BHAPI,使用CCK-8实验测定细胞增殖活力,并采用HPLC方法检测最佳浓度BHAPI的变化。分别采用流式细胞术、Western blot等方法检测HT22神经元细胞凋亡及胱天蛋白酶-3的活化等情况,评估BHAPI对缺血再灌注OGD/R细胞模型中细胞的影响。结果:（1）BHAPI在OGD/R细胞模型中,24 h后几乎全部转化成HAPI;（2）OGD/R组细胞增殖活力显着下降,BHAPI处理的OGD/R组细胞增殖活力下降程度较OGD/R组的明显降低（P<0.05）;（3）相反,OGD/R组细胞上清液中LDH的含量显着升高,BHAPI处理的OGD/R组细胞上清液中LDH含量明显低于OGD/R组（P<0.05）;（4）流式细胞术检测BHAPI处理的OGD/R组细胞凋亡程度较OGD/R组的明显减轻;（5）BHAPI处理的OGD/R组caspase-3的活化分解明显减少。结论:（1）BHAPI在缺血再灌注OGD/R细胞模型中可以活化,转变成HAPI;（2）BHAPI可以改善糖氧剥夺对OGD/R细胞模型中细胞的损伤和凋亡,在缺血缺氧情况下,可能对HT22海马神经元细胞有一定的保护作用,有望成为缺血缺氧引起的神经元细胞损伤的潜在保护性治疗手段。实验二BHAPI对OGD/R细胞模型线粒体的影响目的:探索BHAPI对OGD/R细胞模型HT22细胞内线粒体的保护作用。方法:用四甲基罗丹明甲酯（TMRM）染色细胞,采用FV10i激光共聚焦扫描显微镜检测线粒体膜电位（MMP）的变化;提取线粒体,检测线粒体的吸光度及钙离子的缓冲能力;用Seahorse能量代谢仪检测细胞的耗氧量及细胞外酸化率。结果:（1）OGD/R细胞模型组线粒体膜电位较正常对照组显着降低（P<0.05）,BHAPI处理的OGD/R组细胞的线粒体膜电位降低程度较OGD/R组明显减少（P<0.05）;（2）与对照组相比,OGD/R组线粒体Ca2+缓冲能力降低约60%,而BHAPI处理的OGD/R组Ca2+诱导的线粒体肿胀较OGD/R组显着减弱（P<0.05）;（3）与OGD/R组相比,BHAPI处理组可部分改善OGD/R诱导的氧消耗（P<0.05）和细胞外酸化率（P<0.05）。结论:BHAPI可以改善糖氧剥夺诱导的OGD/R模型细胞内线粒体的功能障碍。实验三调控Mfn2验证BHAPI对OGD/R细胞模型的影响目的:探究BHAPI对线粒体动力学的调节和机制。方法:用Mito Tracker染色检查线粒体形态的变化;用Western blot检测BHAPI处理的OGD/R组与OGD/R组线粒体融合、分裂相关蛋白（Mfn1、Mfn2、Drp1、Opa1）的表达情况。采用si-RNA瞬时转染技术和Gateway过表达技术干扰下游靶点,重复CCK-8实验、流式细胞术等方法进行验证。结果:（1）OGD/R组明显改变了线粒体形态,BHAPI处理组与OGD/R组相比较,线粒体形态改变部分减少;（2）OGD/R组只有Mfn2蛋白表达显着减少,BHAPI处理组只有Mfn2蛋白表达部分增加,但是对Mfn1、Drp1、Opa1蛋白表达无影响;（3）Si-Mfn2部分减少Mfn2蛋白的表达,并对于100μM BHAPI产生的细胞增殖活力、LDH释放量、细胞凋亡和线粒体MMP水平的保护效果有明显抑制作用;（4）Gateway系统过表达Mfn2的蛋白水平,并对于10μM BHAPI产生的细胞增殖活力、LDH释放量、细胞凋亡和线粒体MMP水平的保护效果有明显提高作用。结论:BHAPI可能通过Mfn2促进线粒体融合,维持线粒体功能,进而达到对HT22细胞的保护作用。
胡馨丹[9]（2019）在《外源ATP对油菜幼苗抗寒性的影响》文中提出低温是影响植物生长发育和作物产量的重要环境因子,它不仅会导致植物产量的降低,严重时还会造成植株的死亡。目前,低温灾害问题已成为制约农业发展的重要因素,提高作物耐寒性成为了农业科学研究的重点。许多植物能够感知低温的变化,激活体内代谢机制提高对低温的忍耐。低温胁迫降低质膜的完整性,导致细胞内溶物包括ATP释放到胞外。胞内ATP通过主动转运或者被动运输扩散到胞外后,胞外的ATP（extracellular ATP,eATP）成为重要的信号分子,在调节防御反应中起重要作用。ATP信号参与调控多种生理过程,并且ATP的浓度决定不同的生理反应。研究表明,植物对多种环境胁迫的响应都有eATP信号的参与,比如病原体入侵、机械损伤和高盐胁迫等,但关于eATP是否参与植物对低温胁迫的响应,国内外报道较少,其提高植株对逆境抗寒性的机理尚不清楚。本实验选择白菜型油菜陇油7号为研究材料,从膜系统损伤程度、活性氧代谢、抗氧化系统、渗透调节系统和光合系统等方面探究外源ATP缓解低温胁迫下油菜幼苗的生理及分子机制,以期为低温条件下种植油菜提供一定的理论依据。主要研究结果如下:1、为明确外源ATP缓解白菜型油菜陇油7号低温胁迫的适宜浓度,本实验研究了4个浓度的ATP(10μmol·L-1、25μmol·L-1、50μmol·L-1和100μmol·L-1)对4℃低温胁迫下油菜幼苗生理生化的影响。结果表明:25μmol·L-11 ATP可以明显提高油菜幼苗叶片光合色素含量,可溶性蛋白和可溶性糖等渗透性调节物质含量,缓解膜脂过氧化伤害,降低低温引起的相对电导率和丙二醛（molondialdehyde,MDA）含量,促进油菜幼苗的生长发育。本研究所采用浓度中,25μmol·L-11 ATP对油菜幼苗低温胁迫的缓解效果最佳。2、低温胁迫下,油菜幼苗体内活性氧（reactive oxygen species,ROS）逐渐积累,渗透性调节物脯氨酸和可溶性糖含量均比对照高,抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）、过氧化物酶（peroxidase,POD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidate,APX）酶活性上升,说明油菜幼苗在受到低温胁迫时,积累渗透性调节物和提高抗氧化酶活性来缓解低温胁迫带来的氧化损伤。低温胁迫会造成叶绿素荧光参数中实际光化学量子产量Y（Ⅱ）、光适应下最大光化学效率Fv’/Fm’、光化学淬灭系数qP、表观电子传递效率ETR的降低,调节性能量耗散的量子产量Y（NPQ）和非光化学淬灭系数NPQ升高。与单独低温胁迫相比,低温+ATP复合处理后,过氧化氢（hydrogenperoxide,H2O2）和羟自由基（hydroxyl radicals,·OH）积累量更高,超氧阴离子(superoxideanion,O2·?)积累量降低,渗透性调节物脯氨酸、可溶性糖含量以及抗氧化酶SOD、POD、CAT和APX活性均进一步升高,缓解叶绿素荧光参数的改变,MDA含量降低,减轻膜脂过氧化程度,说明外源ATP能有效的提高油菜幼苗的抗寒性。3、与低温+ATP复合组相比,分别经过DPI（NADPH氧化酶抑制剂）、DMTU（H2O2清除剂）、U0126（MAPKK专一性阻断剂）和EGTA(Ca2+螯合剂)抑制剂预处理再进行低温+ATP处理的油菜幼苗叶片,渗透性调节物质含量降低、脂膜损伤严重和抗氧化酶活性降低,说明NADPH氧化酶、MAPK级联途径和H2O2、Ca2+等信号分子均参与外源ATP诱导的油菜幼苗的抗寒性过程。4、与低温处理相比,低温+ATP处理诱导H2O2含量增加,同时钙泵(Ca2+-ATPase)活性增高,二者表现出相同的趋势;外源CaCl2预处理对低温胁迫下H2O2含量增加有促进作用,外源H2O2预处理也同样增加了低温胁迫下Ca2+-ATPase的活性;当用DMTU预处理油菜幼苗再进行低温胁迫时Ca2+-ATPase的活性下降,用EGTA预处理油菜幼苗时H2O2含量下降,且在DMTU/EGTA+低温组中加入ATP可以显着缓解DMTU和EGTA带来的抑制作用。通过代谢通路关键酶基因相对表达的研究发现呼吸爆发氧化酶基因RBOHD、RBOHF和钙依赖蛋白激酶基因CPK4、CPK5的相对表达量均在ATP处理中上调。说明了在低温胁迫下Ca2+和H2O2相互影响,并且,外源ATP在激活油菜幼苗耐寒性相关的信号通路中,Ca2+和H2O2共同发挥作用。以上结果表明:以25μmol·L-11 ATP对油菜幼苗低温胁迫的缓解效果最佳,外源施加25μmol·L-1ATP能够显着提高油菜幼苗的抗寒性,缓解低温胁迫带来的伤害。且NADPH氧化酶、H2O2、MAP激酶级联途径和Ca2+均参与ATP诱导的油菜幼苗的抗寒性过程。外源施加ATP能够诱导低温胁迫下油菜幼苗RBOH基因和CPK基因的转录水平,促进H2O2和Ca2+的升高,二者能够进一步影响油菜的各种生理生化反应,从而增强油菜幼苗的抗寒性。
林小娟[10]（2019）在《SERCA2氧化还原位点C674的失活加剧心脏纤维化的机制研究》文中研究说明背景:许多心脏疾病的发生和发展过程都涉及心脏纤维化,心脏纤维化是心脏应对各种外界有害刺激的代偿性反应,其病理特征是以胶原为主要成分的心肌细胞外基质的沉积增加。这些基质的积累会引起组织僵硬、心脏顺应性降低和舒张功能障碍,最终可导致心室扩张、心脏肥大以及充血性心力衰竭。心脏纤维化的发病机制主要包括心脏成纤维细胞的表型转化、炎性反应和氧化应激等,各机制之间相互促进,其中成纤维细胞转化为肌成纤维细胞是心脏纤维化发生的关键因素。肌浆网/内质网钙ATP酶（sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase,SERCA）是内质网膜上运输Ca2+的关键蛋白,对于维持胞质和内质网的钙稳态至关重要,其中SERCA2是心脏和血管中的主要亚型。SERCA2第674位半胱氨酸（cysteine 674,C674）上的巯基是重要的氧化还原位点,可维持心血管系统的稳态。常用的心脏纤维化模型是利用血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）灌注小鼠进行诱导。我们发现,AngⅡ处理的小鼠心脏发生明显纤维化,并且在心脏和心脏成纤维细胞中活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）的生成均增多,进一步造成SERCA2上C674的不可逆氧化增加,由此推测C674的不可逆氧化可能参与了心脏纤维化的进程。方法及结果:为了证明SERCA2中C674的不可逆氧化不仅是ROS增加的标志,还可能直接参与了心脏纤维化的进程,我们将C674突变为丝氨酸（serine 674,S674）来模拟病理情况下该位点的不可逆氧化造成的氧化还原修饰调节失活,构建了SERCA2的C674S基因敲入（SERCA2C674S knockin,SKI）小鼠。我们发现,在AngⅡ诱导的心脏纤维化模型中,SKI小鼠心脏间质的胶原沉积明显多于对照组野生型（wild type,WT）小鼠,说明SERCA2中C674的失活直接参与了心脏纤维化的进程。与WT小鼠相比:1)SKI小鼠心脏中纤维化相关因子（α-平滑肌肌动蛋白、胶原蛋白Ⅰ&Ⅲ）和炎性因子（白细胞介素6、血管粘附因子1、磷酸化p65核转录因子）的表达都显着上调;2)SKI小鼠的心脏成纤维细胞中,与细胞转型和纤维化相关的蛋白（α-平滑肌肌动蛋白、胶原蛋白Ⅰ&Ⅲ、基质金属蛋白酶2）及炎性因子（白细胞介素6、血管粘附因子1、磷酸化p65核转录因子）的表达也都显着上调;3)SKI小鼠的心脏成纤维细胞中Ca2+浓度增加,钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子通路激活,而抑制该通路的环孢菌素A可以逆转上调的纤维化和炎性因子的表达;4)SKI小鼠的心脏成纤维细胞中,活化T细胞核因子的激活可通过上调间隙连接蛋白43和转化生长因子β的表达,来诱导成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞,从而促进心脏纤维化。在SKI小鼠的心脏成纤维细胞中使用SERCA激活剂CDN1163干预后,升高的成纤维细胞转型相关蛋白（α-平滑肌肌动蛋白、胶原蛋白Ⅰ&Ⅲ、基质金属蛋白酶2）、炎性因子（血管粘附因子1、磷酸化p65核转录因子）、连接蛋白43和转化生长因子β1的表达均明显下调,纤维化反应得到缓解。结论:病理情况下SERCA2中C674的失活通过诱导心脏成纤维细胞转化为肌成纤维细胞以及炎症反应加剧了心脏纤维化的进程。
二、NITRIC OXIDE INHIBITS A RISE OF ATP-INTRODUCED CYTOSOLIC FREE Ca~(2+) CONCENTRATION AND RELEASE FROM INTRACELLULAR STORED Ca~(2+)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、NITRIC OXIDE INHIBITS A RISE OF ATP-INTRODUCED CYTOSOLIC FREE Ca~(2+) CONCENTRATION AND RELEASE FROM INTRACELLULAR STORED Ca~(2+)（论文提纲范文）
（1）桃叶珊瑚苷对胰岛素抵抗的改善作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 胰岛素信号通路 |
| 1.1.1 胰岛素 |
| 1.1.2 胰岛素信号通路 |
| 1.2 胰岛素抵抗 |
| 1.2.1 胰岛素抵抗机制 |
| 1.2.2 胰岛素抵抗与疾病 |
| 1.2.3 胰岛素抵抗的治疗 |
| 1.3 桃叶珊瑚苷 |
| 1.3.1 抗氧化作用 |
| 1.3.2 抗炎作用 |
| 1.3.3 保护肝脏作用 |
| 1.3.4 抗纤维化作用 |
| 1.3.5 神经保护作用 |
| 1.3.6 骨保护作用 |
| 1.3.7 杀菌作用 |
| 1.3.8 胰腺保护作用 |
| 1.4 研究内容与目的意义 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 目的意义 |
| 2 基于网络药理学预测AU改善胰岛素抵抗作用机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 软件与数据库 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 AU与IR相关靶点的获取 |
| 2.3.2 PPI网络的构建 |
| 2.3.3 GO和 KEGG的富集分析 |
| 2.3.4 分子对接 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 AU与IR关键靶点的获取 |
| 2.4.2 PPI网络蛋白的构建 |
| 2.4.3 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.4.4 分子对接 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 3 AU对 IR-HepG 2 细胞模型的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验细胞株 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 主要试剂及配方 |
| 3.2.4 主要实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 细胞活力的测定 |
| 3.3.3 HepG 2 细胞胰岛素抵抗模型的建立 |
| 3.3.4 AU对 IR-HepG 2 细胞葡萄糖消耗的影响 |
| 3.4 统计学方法 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 AU对 HepG 2 细胞毒性的影响 |
| 3.5.2 HepG 2 细胞胰岛素抵抗模型建立 |
| 3.5.3 AU对 IR-HepG2 细胞葡萄糖消耗的影响 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 小结 |
| 4 AU对 IR-HepG2 细胞胰岛素信号转导通路的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验细胞株 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 主要实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 AU对 IR-HepG2 细胞IRS/Akt通路的影响 |
| 4.3.2 AU对 IR-HepG2 细胞糖原合成的影响 |
| 4.3.3 AU对 IR-HepG2 细胞糖异生的影响 |
| 4.4 统计学方法 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 AU对 IR-HepG2 细胞IRS/Akt通路的影响 |
| 4.5.2 AU对 IR-HepG2 细胞糖原合成的影响 |
| 4.5.3 AU对 IR-HepG2 细胞糖异生的影响 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 小结 |
| 5 AU对 IR-HepG2 细胞炎症与氧化应激的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验细胞株 |
| 5.2.2 主要实验试剂 |
| 5.2.3 主要实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 ELISA法检测 HepG2 细胞外炎症因子的检测 |
| 5.3.2 AU对 IR-HepG2 氧化应激的影响 |
| 5.4 统计学方法 |
| 5.5 实验结果 |
| 5.5.1 AU对 IR-HepG2 炎症的影响 |
| 5.5.2 AU对 IR-HepG2 氧化应激的影响 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（2）小鼠神经细胞中CBS催化生成的H2S对脑微血管内皮细胞增殖、迁移和形成血管的影响及与VEGFR2的关系（论文提纲范文）
| 英文缩略词(Abbreviation) |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 药品与试剂 |
| 2.3 仪器与设备 |
| 3 实验方法与研究内容 |
| 3.1 实验相关溶液和药物的配制 |
| 3.2 细胞处理 |
| 3.2.1 细胞培养与传代 |
| 3.2.2 细胞冻存 |
| 3.2.3 细胞复苏 |
| 3.2.4 细胞共培养 |
| 3.2.5 si RNA转染处理 |
| 3.3 Western blot法检测VEGFR_2蛋白的表达 |
| 3.3.1 提取总蛋白 |
| 3.3.2 BCA法测蛋白的浓度 |
| 3.3.3 蛋白变性 |
| 3.3.4 WB实验 |
| 3.4 CCK-8 增殖实验 |
| 3.5 细胞划痕实验 |
| 3.6 Transwell细胞迁移实验 |
| 3.7 内源性H_2S含量的甲基蓝法 |
| 3.8 细胞内游离Ca~(2+)浓度的钙荧光成像法 |
| 3.9 内皮细胞成管实验 |
| 3.10 统计学处理 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 外源性H_2S引起的内皮细胞的增殖迁移及与VEGFR_2的关系 |
| 4.1.1 Na HS促进小鼠脑微血管和人脐静脉内皮细胞的增殖 |
| 4.1.2 SU5416对Na HS诱导的小鼠脑微血管和人脐静脉内皮细胞的增殖的影响 |
| 4.1.3 Na HS促进小鼠脑微血管和人脐静脉内皮细胞迁移及SU5416 对其的影响 |
| 4.2 神经源性H_2S引起的小鼠脑微血管内皮细胞的增殖迁移及与VEGFR_2的关系 |
| 4.2.1 L-Cys单用及合用AOAA或 SU5416 对小鼠海马神经元和内皮细胞共培养中H_2S生成的影响 |
| 4.2.2 神经元CBS产生的H_2S促进b End.3 内皮细胞的增殖和迁移 |
| 4.2.3 阻断VEGFR_2对神经元CBS产生的H_2S促 b End.3 细胞的增殖和迁移的影响 |
| 4.2.4 L-Cys单用及合用AOAA或 SU5416对共培养中小鼠脑微血管内皮细胞的胞内游离的Ca~(2+)浓度的影响 |
| 4.2.5 神经元CBS产生的 H_2S的促增殖和迁移作用在VEGFR_2-si RNA转染的 b End.3 细胞中的变化 |
| 4.3 外源性和神经源性H_2S对小鼠脑微血管内皮细胞生成血管的影响及与VEGFR_2的关系 |
| 4.3.1 NaHS对小鼠脑微血管内皮细胞生成血管的影响及与VEGFR_2的关系 |
| 4.3.2 神经元CBS产生的H_2S对小鼠脑微血管内皮细胞生成血管的影响 |
| 5 讨论 |
| 5.1 H_2S在内皮细胞的增殖和迁移中的作用 |
| 5.2 神经源性H_2S在脑血管内皮细胞的增殖、迁移中的作用.. |
| 5.3 神经源性H_2S在脑血管内皮细胞形成血管中的作用 |
| 5.4 神经源性H_2S促进脑血管内皮细胞增殖、迁移和形成血管作用的机制 |
| 5.4.1 促进脑血管内皮细胞增殖、迁移作用与VEGFR_2的关系 |
| 5.4.2 通过脑血管内皮细胞VEGFR_2升高胞内游离Ca~(2+)来促细胞增殖和迁移 |
| 5.4.3 促进脑血管内皮细胞形成血管作用与VEGFR_2的关系 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 H_2S 与血管生成生物学 |
| 参考文献 |
（3）草地早熟禾对Cd胁迫的分子响应及外源NO的缓解效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 附录 |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 Cd胁迫对植物的影响 |
| 1.1 Cd胁迫对植物的毒害效应 |
| 1.1.1 Cd胁迫对植物的生长抑制 |
| 1.1.2 Cd胁迫对光合作用的影响 |
| 1.1.3 Cd胁迫对呼吸作用的影响 |
| 1.1.4 Cd胁迫对植物活性氧代谢的影响 |
| 1.2 植物对Cd的吸收、转运及积累 |
| 1.2.1 植物对Cd的吸收 |
| 1.2.2 植物体的Cd转运 |
| 1.2.3 植物体内的Cd分布 |
| 2 Cd介导的信号转导及基因表达 |
| 2.1 Cd诱导的信号转导 |
| 2.1.1 丝裂原活化蛋白激酶信号级联 |
| 2.1.2 活性氧(Reactive oxygen species,ROS)信号 |
| 2.1.3 活性氮(reactive nitrogen species,RNS)信号 |
| 2.1.4 钙离子信号 |
| 2.1.5 植物激素信号 |
| 2.2 响应Cd胁迫的转录因子 |
| 3 植物对Cd的解毒途径 |
| 3.1 苯丙烷代谢 |
| 3.2 谷胱甘肽代谢 |
| 3.3 植物螯合素的合成 |
| 3.4 金属硫蛋白合成 |
| 4 NO在植物生长中的作用 |
| 4.1 NO性质及产生途径(酶促途径和非酶促途径) |
| 4.1.1 NO化学性质 |
| 4.1.2 NO产生途径 |
| 4.2 NO在植物体中的作用 |
| 4.2.1 NO与植物种子萌发 |
| 4.2.2 NO与植物生长发育 |
| 4.2.3 NO与植物衰老 |
| 4.3 NO对Cd胁迫的缓解效应 |
| 4.4 NO调控的植物转录组研究概况 |
| 5 本研究的目的意义和主要研究内容 |
| 5.1 研究的目的意义 |
| 5.2 研究的主要内容 |
| 5.3 技术路线图 |
| 第二章 不同草地早熟禾种质材料幼苗的Cd耐性评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料及来源 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 叶片相对含水量的测定 |
| 1.3.2 干物质含量的测定 |
| 1.3.3 光合色素含量的测定 |
| 1.3.4 酶活性测定 |
| 1.3.5 脯氨酸含量测定 |
| 1.3.6 丙二醛含量测定 |
| 1.4 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Cd胁迫对草地早熟禾相对干物质含量及叶片相对含水量的影响 |
| 2.2 Cd胁迫10个草地早熟禾材料光合色素差异 |
| 2.3 Cd胁迫下综合评价指标的耐Cd系数 |
| 2.4 模糊隶属函数法综合评价草地早熟禾耐Cd性 |
| 2.5 Cd胁迫对草地早熟禾叶片中SOD、POD、CAT活性的影响 |
| 2.6 Cd胁迫对草地早熟禾叶片中脯氨酸及MDA含量的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 Cd胁迫对草地早熟禾幼苗生长指标和光合色素的影响 |
| 3.2 Cd胁迫草地早熟禾幼苗质膜过氧化和细胞渗透调节物质的影响 |
| 3.3 Cd胁迫对草地早熟禾幼苗抗氧化酶活性的影响 |
| 4 小结 |
| 第三章 内源NO对草地早熟禾Cd胁迫的响应研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料与试剂 |
| 1.2 试验设计与处理 |
| 1.3 测定指标 |
| 1.4 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 内源NO对Cd胁迫下草地早熟禾幼苗叶片抗氧化酶活性的影响 |
| 2.2 内源NO对Cd胁迫下草地早熟禾幼苗叶片光合特性的影响 |
| 2.3 内源NO对 Cd胁迫下草地早熟禾幼苗叶片MDA含量的影响 |
| 2.4 内源NO对 Cd胁迫下草地早熟禾幼苗叶片Pro含量的影响 |
| 2.5 内源NO对Cd胁迫下草地早熟禾幼苗生长的影响 |
| 2.6 Cd胁迫下NO合成抑制剂及清除剂对草地早熟禾叶片内源NO含量的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 外源NO介导的草地早熟禾Cd耐性的生理响应研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料及培养 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 试验一 |
| 1.2.2 试验二 |
| 1.3 测定方法 |
| 1.3.1 发芽相关指标计算 |
| 1.3.2 根系形态的扫描 |
| 1.3.3 Cd含量的测定 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同浓度外源NO对Cd胁迫下草地早熟禾种子萌发的影响 |
| 2.1.1 对发芽率、胚根胚芽长度的影响 |
| 2.1.2 对发芽势、活力指数、发芽指数的影响 |
| 2.2 不同浓度外源NO对Cd胁迫下草地早熟禾幼苗生长的影响 |
| 2.3 不同浓度外源NO对Cd胁迫下草地早熟禾幼苗叶片光合色素含量的影响 |
| 2.4 不同浓度外源NO对Cd胁迫下草地早熟禾幼苗叶片抗氧化酶系统的影响 |
| 2.5 不同浓度外源NO对Cd胁迫下草地早熟禾丙二醛、脯氨酸含量的影响 |
| 2.6 NO对Cd胁迫下草地早熟禾幼苗叶片相对含水量的影响 |
| 2.7 NO对Cd胁迫下草地早熟禾丙二醛的影响 |
| 2.8 NO对Cd胁迫下草地早熟禾抗氧化酶的影响 |
| 2.9 NO对Cd胁迫下草地早熟禾游离脯氨酸含量的影响 |
| 2.10 NO对Cd胁迫下草地早熟禾根系形态的影响 |
| 2.11 NO对 Cd胁迫下草地早熟禾Cd含量的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 耐Cd型与敏感型草地早熟禾品种的Cd耐性分子响应研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物培养和处理 |
| 1.2 RNA提取、Illumina测序和从头组装 |
| 1.3 差异表达基因(DEGs)的鉴定和功能注释 |
| 1.4 转录调控因子的预测和分类 |
| 1.5 中枢TFs与监管互动之间的网络分析 |
| 1.6 实时荧光定量PCR验证 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 2个品种响应Cd胁迫的差异表达基因(DEGs)和表型特征 |
| 2.2 Cd胁迫诱导的DEGs的GO和 KEGG富集分析 |
| 2.3 耐Cd型对Cd胁迫的转录调控概况 |
| 2.4 差异表达转录因子(DETs) |
| 2.5 差异表达的受体激酶、蛋白修饰和降解基因 |
| 2.6 植物激素和钙信号相关的DEGs |
| 2.7 DEGs网络分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关键代谢途径及其相互作用转录因子的调控 |
| 3.2 通过植物激素代谢和信号转导的转录调控 |
| 3.3 翻译后修饰与蛋白质降解的调控 |
| 3.4 描述草地早熟禾对Cd胁迫反应的转录调控网络假想模型 |
| 4 结论 |
| 第六章 外源NO介导的草地早熟禾Cd耐性的分子响应研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料培养和处理 |
| 1.2 RNA提取、文库构建和RNA-Seq |
| 1.3 序列拼接和注释 |
| 1.4 基因表达水平的量化和差异表达分析 |
| 1.5 实时荧光定量PCR分析 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录组测序和组装 |
| 2.2 R型差异表达基因(DEGs)分析 |
| 2.3 Cd胁迫下外源NO诱导的R型 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.4 外源NO介导的R型Cd解毒相关途径 |
| 2.5 外源NO介导的R型响应Cd胁迫关键功能基因 |
| 2.6 M型差异表达基因分析 |
| 2.7 Cd胁迫下外源NO诱导的M型 GO富集分析 |
| 2.8 Cd胁迫下外源NO诱导的M型 KEGG富集分析 |
| 2.9 实时荧光定量PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 外源NO诱导木质素合成代谢响应Cd胁迫 |
| 3.2 外源NO诱导氨基酸的合成和代谢响应Cd胁迫 |
| 3.3 ROS、Ca~(2+)和NO信号之间的互作是植物Cd胁迫响应机制之一 |
| 3.4 外源NO诱导生长素合成响应Cd胁迫 |
| 3.5 外源NO诱导植物激素合成响应Cd胁迫 |
| 3.6 外源NO诱导草地早熟禾糖代谢及信号转导是其适应Cd胁迫的策略之一 |
| 3.7 外源NO诱导脂质代谢及脂肪酸代谢响应Cd胁迫 |
| 4 结论 |
| 第七章 全文结论与展望 |
| 1 全文结论 |
| 2 研究创新 |
| 3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附表1 潜在下游基因与TFS相互作用的KEGG功能总结 |
| 附表2 差异表达的蛋白降解基因 |
| 附表3 差异表达的蛋白修饰基因 |
| 附表4 差异表达的受体激酶基因 |
| 附表5 植物激素和钙信号相关的DEGS |
| 附表6 差异表达转录因子的KEGG通路分析 |
| 附表7 差异表达基因的KEGG通路分析 |
| 附表8 氨基酸运输和代谢中的COG分析 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（4）基于内皮细胞Calpain在心脏异种移植排斥反应中的调节作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 序言 |
| 1.1 背景综述 |
| 1.2 研究目的与方法 |
| 1.3 主要研究内容 |
| 1.4 研究技术路线 |
| 1.5 参考文献 |
| 第二章 内皮Calpain在心脏移植排斥反应中的作用 |
| 2.1 实验材料与动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章结论 |
| 2.6 参考文献 |
| 第三章 Calpain在炎症因子诱导内皮细胞激活中的作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章结论 |
| 3.6 参考文献 |
| 第四章 结论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 创新点 |
| 4.3 后续研究展望与建议 |
| 综述1 钙蛋白酶与心血管疾病 |
| 参考文献 |
| 综述2 内皮细胞中钙的作用 |
| 参考文献 |
| 主要英文缩略语词表 |
| 攻读博士学位期间主要科研成果 |
| 致谢 |
（5）莱菔硫烷对肝脏脂肪滴形成的影响及MAM区的调控机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究的目的和意义 |
| 1.2 异硫氰酸酯的结构、代谢及功能 |
| 1.2.1 异硫氰酸酯及其前体物、黑芥子酶的结构 |
| 1.2.2 肠道菌群对GRP的降解及ITCs在体内的代谢 |
| 1.2.3 莱菔硫烷的抗氧化作用 |
| 1.2.4 莱菔硫烷的抗炎性作用 |
| 1.2.5 莱菔硫烷的抗癌作用 |
| 1.2.6 莱菔硫烷对代谢类疾病的改善作用 |
| 1.3 脂滴 |
| 1.3.1 脂滴组成 |
| 1.3.2 脂滴的合成与降解 |
| 1.4 内质网应激对脂质代谢的调控 |
| 1.4.1 PERK信号通路 |
| 1.4.2 IRE信号通路 |
| 1.4.3 ATF6信号通路 |
| 1.5 内质网与线粒体偶联区调控脂代谢与能量代谢 |
| 1.5.1 内质网与线粒体偶联区(MAM) |
| 1.5.2 MAM区调控脂代谢 |
| 1.5.3 MAM区钙信号传导调控脂质代谢与能量合成 |
| 1.6 本文的主要研究内容 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料与仪器设备 |
| 2.1.1 试剂及药品 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.2 动物模型及细胞模型的建立 |
| 2.2.1 高脂膳食诱导大鼠肝脏脂肪病变模型的建立及分组 |
| 2.2.2 混合脂肪酸诱导肝细胞模型的建立及分组 |
| 2.3 内质网、线粒体和MAM的提取及结构观察 |
| 2.3.1 提取试剂的制备 |
| 2.3.2 提取过程 |
| 2.4 测定方法 |
| 2.4.1 甘油三酯和总胆固醇含量的测定 |
| 2.4.2 大鼠肝脏病理观察及评分 |
| 2.4.3 油红O染色 |
| 2.4.4 透射电镜观察 |
| 2.4.5 荧光定量PCR检测基因表达 |
| 2.4.6 Western blot检测蛋白表达 |
| 2.4.7 免疫组化检测脂滴外周蛋白的表达 |
| 2.4.8 荧光染色检测脂滴 |
| 2.4.9 Ca~(2+)的检测 |
| 2.4.10 线粒体膜电位的检测 |
| 2.4.11 ROS的检测 |
| 2.4.12 ATP的检测 |
| 2.4.13 异柠檬酸脱氢酶及α酮戊二酸脱氢酶的检测 |
| 2.4.14 线粒体复合物的检测 |
| 2.5 数据处理及分析 |
| 第3章 莱菔硫烷对肝细胞脂肪滴形成的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 莱菔硫烷对脂滴积累的影响 |
| 3.2.1 对大鼠肝脏中脂质积累的影响 |
| 3.2.2 对体外培养肝细胞脂质积累的影响 |
| 3.2.3 对大鼠肝脏脂滴形态学的影响 |
| 3.2.4 对体外培养肝细胞脂滴形态及数量的影响 |
| 3.3 莱菔硫烷对脂滴核心成分的影响 |
| 3.3.1 肝细胞内TG含量动态变化 |
| 3.3.2 对DGAT2和ACAT1表达的影响 |
| 3.4 莱菔硫烷对脂滴外周蛋白的影响 |
| 3.4.1 对肝脏PAT家族蛋白转录及翻译水平表达的影响 |
| 3.4.2 离体肝细胞中脂滴外周蛋白的动态变化 |
| 3.5 SFN调控PPARr影响脂滴的形成 |
| 3.5.1 PPARγ激活剂对肝细胞中TG含量的影响 |
| 3.5.2 PPARγ激活剂对肝细胞中PPARγ与PLIN2和PLIN5的影响 |
| 3.5.3 莱菔硫烷对对PPARγ与PLIN2和PLIN5的影响 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 莱菔硫烷调控内质网应激改善脂质积累的机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 莱菔硫烷对脂肪酸合成相关酶的影响 |
| 4.2.1 对ACC1和SCD1的影响 |
| 4.2.2 对FAS的影响 |
| 4.2.3 对SREBP1c的影响 |
| 4.3 莱菔硫烷对内质网的影响 |
| 4.3.1 对内质网形态的影响 |
| 4.3.2 对内质网应激标志蛋白的影响 |
| 4.4 抑制内质网应激后脂质生成情况 |
| 4.4.1 对XBP1 和SREBP1c的影响 |
| 4.4.2 对TG含量及脂肪滴形成的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 莱菔硫烷对内质网与线粒体偶联区的调控机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 莱菔硫烷对MAM区形成的影响 |
| 5.3 莱菔硫烷对CA~(2+)浓度的影响 |
| 5.4 莱菔硫烷对MAM区蛋白的影响 |
| 5.4.1 对ER钙相关蛋白的影响 |
| 5.4.2 对线粒体钙相关蛋白的影响 |
| 5.4.3 对MAM区连接蛋白的影响 |
| 5.4.4 对MAM区脂合成相关蛋白的影响 |
| 5.5 莱菔硫烷对线粒体ATP合成的影响 |
| 5.5.1 对Ca~(2+)过载造成线粒体损伤的影响 |
| 5.5.2 对肝脏中ICD和α-KD的影响 |
| 5.5.3 对线粒体复合物的影响 |
| 5.5.4 对ATP的影响 |
| 5.6 本章小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录(一): 缩略词表 |
| 附录(二): 肝细胞胞浆中钙离子水平 |
| 附录(三): 肝细胞线粒体膜电位 |
| 附录(四): 肝细胞ROS水平 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）ROS/ADMA/DDAHⅡ/eNOS/NO通路介导的铁过载损伤内皮细胞线粒体（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 主要材料与试剂 |
| 2.2 主要仪器及设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组腺病毒表达载体 |
| 2.3.2 HUVECs内皮细胞的培养 |
| 2.3.3 腺病毒感染HUVECs细胞 |
| 2.3.4 构建铁过载损伤模型 |
| 2.3.5 实验分组及处理 |
| 2.3.6 MTS测 HUVECs细胞存活率 |
| 2.3.7 测定乳酸脱氢酶(LDH)活性 |
| 2.3.8 Caspase-3活性测定 |
| 2.3.9 Annexin V-FITC和PI双染色法检测HUVECs细胞凋亡 |
| 2.3.10 流式细胞仪检测HUVECs细胞及线粒体内活性氧(ROS)的水平 |
| 2.3.11 HPLC法测ADMA含量 |
| 2.3.12 NO含量测定 |
| 2.3.13 HUVECs细胞DDAHⅡ活性测定 |
| 2.3.14 海马仪测定HUVECs细胞氧消耗率(OCR) |
| 2.3.15 JC-1检测HUVECs细胞线粒体膜电位(△Ψm) |
| 2.3.16 检测线粒体通透性转换孔(m PTP)的开放程度 |
| 2.3.17 Western blotting检测HUVECs细胞中蛋白的表达 |
| 2.4 数据处理 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 铁过载损伤最佳浓度的确定 |
| 3.2 铁过载诱导内皮细胞损伤 |
| 3.3 铁过载诱导细胞内产生大量ROS,以及“ROS诱导的ROS释放”的作用 |
| 3.4 铁过载产生过量的ROS诱导血管内皮细胞损伤,以及ADMA/DDAHⅡ/e NOS/NO通路的作用 |
| 3.5 铁过载损伤的效应器：线粒体,以及其功能障碍的形成过程 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（7）黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇改善氧化应激介导的糖尿病动物心房重构（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、糖尿病模型的建立、实验设计和可行性分析 |
| 1.1 对象和方法?????????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.1.1 实验动物及分组????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.1.2 实验仪器及试剂????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.1.3 建模方法??????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.1.4 血流动力学检查????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.1.5 统计学处理???????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.2 结果??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.2.1 三组家兔基础指标?????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.2.2 三组大鼠基础指标?????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.3 讨论??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 1.3.1 四氧嘧啶诱导的1型糖尿病模型的可行性分析???????????????????? |
| 1.3.2 链脲佐菌素诱导的2型糖尿病模型的可行性分析????????????????? |
| 1.4 小结??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 二、别嘌呤醇对糖尿病动物心房重构的影响????????????????????????????????????? |
| 2.1 对象和方法????????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.1.1 实验仪器???????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.1.2 实验试剂???????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.1.3 心脏超声检查?????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.1.4 电生理检查????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.1.5 病理学实验????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.1.6 统计学处理????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.2 结果???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.2.1 心脏超声检查????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.2.2 电生理研究????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.2.3 病理学实验 |
| 2.3 讨论?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? |
| 2.3.1 糖尿病与心血管疾病的关系 |
| 2.3.2 糖尿病诱导的心房结构重构参与房颤的发生 |
| 2.3.3 糖尿病诱导的心房电重构参与房颤的发生 |
| 2.3.4 糖尿病诱导的心房自主神经重构参与房颤的发生 |
| 2.4 小结 |
| 三、糖尿病介导的心房重构的分子机制及别嘌呤醇的干预作用?????????? |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验仪器 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 心房组织留取 |
| 3.1.4 血液生化检查 |
| 3.1.5 Western blotting |
| 3.1.6 统计学处理 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 血液生化学检查 |
| 3.2.2 Western blot 实验 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 糖尿病导致房颤的病理生理机制 |
| 3.3.2 核转录因子 NF-κB 与心房重构的关系 |
| 3.3.3 MAPK 信号通路与心房结构重构的关系 |
| 3.4 小结 |
| 四、钙信号通路异常介导的糖尿病心房重构及别嘌呤醇的干预作用 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验设备 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 膜片钳实验 |
| 4.1.5 共聚焦显微镜测定细胞内钙波 |
| 4.1.6 Western blotting 检测钙通道相关蛋白表达 |
| 4.1.7 Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction(PCR)实验 |
| 4.1.8 免疫组化 |
| 4.1.9 统计学处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 膜片钳实验 |
| 4.2.2 共聚焦显微镜测定细胞内钙波 |
| 4.2.3 Western blotting 测定钙通道相关蛋白表达 |
| 4.2.4 PCR 实验 |
| 4.2.5 免疫组化 |
| 4.3.讨论 |
| 4.3.1 兴奋-收缩偶联的生理过程及结构基础 |
| 4.3.2 细胞内钙稳态失衡导致房颤发生的机制 |
| 4.3.3 Ca MKII 在心血管系统中的分布及作用 |
| 4.3.4 Ca MKII过度激活参与房颤的发生过程 |
| 4.4 小结 |
| 五、氧化应激介导的线粒体代谢相关蛋白表达异常 及别嘌呤醇的干预作用 |
| 5.1 对象和方法 |
| 5.1.1 实验仪器 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 Western blotting 检测线粒体代谢相关蛋白 |
| 5.1.4 统计学处理 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 六、血管紧张素 II 介导的氧化应激对 HL-1 细胞 钙信号通路的影响及别嘌呤醇的干预作用 |
| 6.1 对象和方法 |
| 6.1.1 实验仪器 |
| 6.1.2 实验试剂 |
| 6.1.3 溶液配制 |
| 6.1.4 HL-1 细胞培养 |
| 6.1.5 HL-1 细胞实验分组 |
| 6.1.6 酶标仪测定细胞 ROS 水平 |
| 6.1.7 Western blot 检测蛋白表达 |
| 6.1.8 统计学处理 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 酶标仪测定 HL-1 细胞内 ROS 生成 |
| 6.2.2 Western blotting |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 氧化应激与心血管疾病的关系 |
| 6.3.2 血管紧张素 II 通过增加氧化应激水平引起细胞损伤 |
| 6.3.3 Ca MKII激活可通过引起多种离子通道活化异常导致房颤发生 |
| 6.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 氧化应激及其介导的钙信号通路异常与心房颤动的关系及 黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇的干预作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）BHAPI通过Mfn2对缺血性卒中后线粒体功能起保护作用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验一 BHAPI在缺血再灌注细胞模型中的变化及其对细胞的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验细胞及来源 |
| 1.2 主要实验仪器与设备 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 海马神经元HT22 细胞培养 |
| 2.2 OGD/R细胞模型建立 |
| 2.3 CCK-8 细胞增殖活力检测及筛选BHAPI作用浓度 |
| 2.4 高效液相色谱(HPLC)分析 |
| 2.5 细胞LDH的检测 |
| 2.6 细胞凋亡检测 |
| 2.7 蛋白印迹检测和分析 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 BHAPI在 OGD/R细胞模型中的稳定性分析 |
| 3.2 BHAPI处理的OGD/R细胞模型细胞的变化特点 |
| 4 讨论 |
| 实验二 BHAPI对缺血缺氧细胞模型线粒体的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验细胞及来源 |
| 1.2 主要实验仪器与设备 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 海马神经元HT22 细胞培养 |
| 2.2 OGD/R细胞模型建立 |
| 2.3 线粒体肿胀测量 |
| 2.4 线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)测定 |
| 2.5 线粒体对钙离子缓冲能力测量 |
| 2.6 细胞耗氧率和细胞外酸化率测量 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 BHAPI处理的OGD/R细胞模型细胞线粒体功能变化的特点 |
| 4 讨论 |
| 实验三 调控Mfn2 验证BHAPI对 OGD/R细胞模型的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验细胞及来源 |
| 1.2 主要实验仪器与设备 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 海马神经元HT22 细胞及293t细胞培养 |
| 2.2 OGD/R细胞模型建立 |
| 2.3 线粒体形态检测 |
| 2.4 siRNA进行靶基因部分沉默实验 |
| 2.5 Gateway系统过表达实验 |
| 2.6 蛋白印迹检测和分析 |
| 2.7 CCK-8 细胞增殖活力和LDH的检测 |
| 2.8 细胞凋亡检测 |
| 2.9 线粒体膜电位检测 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 BHAPI处理的OGD/R细胞模型线粒体形态学及相关蛋白表达的变化特点 |
| 3.2 Si-Mfn2 干扰后细胞线粒体Mfn2 表达变化及对BHAPI保护作用的影响特点 |
| 3.3 Gateway系统过表达Mfn2 后对BHAPI的保护作用有提高作用 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（9）外源ATP对油菜幼苗抗寒性的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩写词 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 低温胁迫对植物生长发育的影响 |
| 1.1.1 低温胁迫引起植物细胞氧化损伤 |
| 1.1.2 低温胁迫破坏植物的细胞膜系统 |
| 1.1.3 低温胁迫破坏植物细胞的光合系统 |
| 1.2 植物应对低温胁迫的途径 |
| 1.2.1 提高自身总抗氧化能力 |
| 1.2.2 积累渗透性调节物质 |
| 1.2.3 信号转导途径的参与 |
| 1.3 ATP对植物生长发育的影响 |
| 1.3.1 胞外ATP的来源 |
| 1.3.2 胞外ATP的生理功能 |
| 1.3.3 在植物中胞外ATP的信号通路 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 技术路线图 |
| 第2章 不同浓度的外源ATP对低温胁迫下油菜幼苗生理指标的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料的培养 |
| 2.2.2 实验材料的处理 |
| 2.2.3 光合色素含量的测定 |
| 2.2.4 膜系统损伤程度的测定 |
| 2.2.5 渗透性调节物质含量的测定 |
| 2.2.6 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同浓度的外源ATP对低温胁迫下油菜幼苗光合色素含量的影响 |
| 2.3.2 不同浓度的外源ATP对低温胁迫下油菜幼苗渗透性调节物质含量的影响 |
| 2.3.3 不同浓度的外源ATP对低温胁迫下油菜幼苗细胞膜损伤程度的影响 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 讨论 |
| 2.4.2 小结 |
| 第3章 外源ATP对低温胁迫下油菜幼苗生理指标的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料的培养 |
| 3.2.2 实验材料的处理 |
| 3.2.3 染色法定位O_2~·-分布 |
| 3.2.4 H_2O_2和·OH含量的测定 |
| 3.2.5 脯氨酸含量的测定 |
| 3.2.6 可溶性糖含量的测定 |
| 3.2.7 抗氧化酶活性的测定 |
| 3.2.8 叶绿素荧光参数测定 |
| 3.2.9 MDA含量的测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 外源ATP对低温胁迫下油菜幼苗ROS含量的影响 |
| 3.3.2 外源ATP对低温胁迫下油菜幼苗渗透性调节物质含量的影响 |
| 3.3.3 外源ATP对低温胁迫下油菜幼苗抗氧化酶活性的影响 |
| 3.3.4 外源ATP对低温胁迫下油菜幼苗叶绿素荧光参数的影响 |
| 3.3.5 外源ATP对低温胁迫下油菜幼苗MDA含量的影响 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 3.4.1 讨论 |
| 3.4.2 小结 |
| 第4章 外源ATP对低温胁迫下油菜幼苗抗寒性调节过程机理的探究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料的培养 |
| 4.2.2 实验材料的处理 |
| 4.2.3 MDA、叶绿素、脯氨酸和H_2O_2含量的测定 |
| 4.2.4 实时荧光定量PCR |
| 4.2.5 T-AOC和Ca~(2+)-ATPase活性的检测 |
| 4.2.6 试剂和仪器 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 抑制剂处理对低温胁迫下油菜幼苗叶片MDA含量的影响 |
| 4.3.2 抑制剂处理对低温胁迫下油菜幼苗叶片叶绿素含量的影响 |
| 4.3.3 抑制剂处理对低温胁迫下油菜幼苗叶片脯氨酸含量的影响 |
| 4.3.4 外源ATP在响应低温胁迫过程中与Ca~(2+)和H_2O_2的关系 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 讨论 |
| 4.4.2 小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 前景展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（10）SERCA2氧化还原位点C674的失活加剧心脏纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词对照表 |
| 1 前言 |
| 1.1 心脏纤维化 |
| 1.2 心脏纤维化的发病机制 |
| 1.2.1 心脏成纤维细胞(cardiacfibroblast,CFs)转分化为肌成纤维细胞(myofibroblasts,MFB) |
| 1.2.2 炎性反应 |
| 1.2.3 氧化应激 |
| 1.3 AngⅡ诱导心脏纤维化模型 |
| 1.3.1 AngⅡ诱导心脏纤维化 |
| 1.3.2 AngⅡ诱导心脏纤维化的病理机制 |
| 1.4 SERCA亚型及其生理功能 |
| 1.4.1 SERCA亚型 |
| 1.4.2 SERCA的生理功能 |
| 1.4.3 SERCA2及其C674位点在心脏中的作用 |
| 1.4.4 胞浆钙介导的钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)-活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)信号通路 |
| 2 课题研究目的、内容、技术路线 |
| 2.1 研究目的 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.2.1 动物实验 |
| 2.2.2 细胞实验 |
| 2.3 技术路线 |
| 2.3.1 动物实验 |
| 2.3.2 细胞实验 |
| 2.4 实验创新点及拟解决的关键问题 |
| 2.4.1 实验创新点 |
| 2.4.2 拟解决的关键问题 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 基因鉴定 |
| 3.2.2 AngⅡ诱导心脏纤维化模型 |
| 3.2.3 心脏组织取材 |
| 3.2.4 心脏组织冰冻切片 |
| 3.2.5 心脏组织切片马松染色 |
| 3.2.6 心脏组织切片免疫组化染色 |
| 3.2.7 心脏左心室RNA提取 |
| 3.2.8 荧光定量PCR |
| 3.2.9 乳鼠心脏成纤维细胞的分离培养及传代 |
| 3.2.10 细胞免疫荧光染色 |
| 3.2.11 CFs的鉴定 |
| 3.2.12 AngⅡ处理细胞及环孢菌素A(ciclosporin A, CsA)、CDN1163干预处理 |
| 3.2.13 细胞荧光染料Fluo4染色 |
| 3.2.14 CFs的二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)染色 |
| 3.2.15 细胞和组织总蛋白的提取 |
| 3.2.16 蛋白质印迹法 |
| 4 实验结果及讨论 |
| 4.1 AngⅡ增加ROS的生成和心脏SERCA2中C674的不可逆性氧化 |
| 4.1.1 AngⅡ增加心脏中ROS的含量 |
| 4.1.2 CFs的鉴定 |
| 4.1.3 AngⅡ增加CFs中ROS的含量 |
| 4.1.4 AngⅡ增加心脏组织中SERCA2中C674的不可逆氧化 |
| 4.2 SERCA2中C674的失活加剧AngⅡ诱导的心脏纤维化 |
| 4.2.1 小鼠基因鉴定结果 |
| 4.2.2 SERCA2中C674的失活加重AngⅡ诱导的心脏纤维化 |
| 4.2.3 心脏SERCA2中C674的失活不影响SERCA2的表达 |
| 4.2.4 心脏SERCA2中C674的失活上调纤维化相关因子的表达 |
| 4.2.5 心脏SERCA2中C674的失活上调炎性因子的表达 |
| 4.3 SERCA2中C674的失活促进CFs向MFB转化及CFs中的炎性反应 |
| 4.3.1 C674的失活不影响CFs中SERCA2的表达量 |
| 4.3.2 SERCA2中C674的失活促进CFs向MFB转化 |
| 4.3.3 SERCA2中C674的失活促进CFs中炎性因子的表达 |
| 4.4 C674的失活激活CFs中NFAT通路促进心脏纤维化 |
| 4.4.1 C674的失活引起CFs中胞浆Ca~(2+)浓度升高 |
| 4.4.2 C674的失活激活CFs中 NFAT信号通路 |
| 4.4.3 NFAT通路介导了C674的失活对CFs中纤维化及炎性相关蛋白的调控 |
| 4.5 C674的失活通过CX43-TGFβ1通路促进心脏纤维化 |
| 4.5.1 C674的失活上调心脏中CX43-TGFβ1通路蛋白的表达 |
| 4.5.2 C674的失活上调CFs中CX43-TGFβ1通路蛋白的表达 |
| 4.5.3 NFAT介导了CFs中C674的失活对CX43-TGFβ1通路的调控 |
| 4.6 SERCA激活剂CDN1163逆转C674失活对CFs表型转化及炎性蛋白的影响 |
| 4.6.1 CDN1163抑制CFs中C674失活导致的表型转化及炎性反应 |
| 4.6.2 CDN1163抑制CFs中C674失活上调的CX43-TGFβ1通路相关蛋白 |
| 4.7 讨论 |
| 5 主要结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A.作者在攻读学位期间发表的文章 |
| B.作者在攻读学位期间参加的科研项目 |
| C.学位论文数据集 |
| 致谢 |
四、NITRIC OXIDE INHIBITS A RISE OF ATP-INTRODUCED CYTOSOLIC FREE Ca~(2+) CONCENTRATION AND RELEASE FROM INTRACELLULAR STORED Ca~(2+)（论文参考文献）
- [1]桃叶珊瑚苷对胰岛素抵抗的改善作用机制研究[D]. 周玉荣. 大连理工大学, 2021(01)
- [2]小鼠神经细胞中CBS催化生成的H2S对脑微血管内皮细胞增殖、迁移和形成血管的影响及与VEGFR2的关系[D]. 陈佳妮. 安徽医科大学, 2021(01)
- [3]草地早熟禾对Cd胁迫的分子响应及外源NO的缓解效应研究[D]. 鲜靖苹. 甘肃农业大学, 2020
- [4]基于内皮细胞Calpain在心脏异种移植排斥反应中的调节作用研究[D]. 易晨龙. 苏州大学, 2020(06)
- [5]莱菔硫烷对肝脏脂肪滴形成的影响及MAM区的调控机制[D]. 田思聪. 哈尔滨工业大学, 2019(01)
- [6]ROS/ADMA/DDAHⅡ/eNOS/NO通路介导的铁过载损伤内皮细胞线粒体[D]. 周青. 南昌大学, 2019(01)
- [7]黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇改善氧化应激介导的糖尿病动物心房重构[D]. 杨亚娟. 天津医科大学, 2019
- [8]BHAPI通过Mfn2对缺血性卒中后线粒体功能起保护作用[D]. 陈晓莉. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [9]外源ATP对油菜幼苗抗寒性的影响[D]. 胡馨丹. 西北师范大学, 2019(06)
- [10]SERCA2氧化还原位点C674的失活加剧心脏纤维化的机制研究[D]. 林小娟. 重庆大学, 2019(01)