丙型肝炎病毒NS3区不同末端基因的表达及产物抗原性分析

丙型肝炎病毒NS3区不同末端基因的表达及产物抗原性分析

一、丙型肝炎病毒NS3区不同末端基因的表达及产物抗原性分析(论文文献综述)

岳山[1](2021)在《牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS4B抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制研究》文中研究表明牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)属于单股正链RNA病毒,BVDV是黄病毒科、瘟病毒属的成员,主要引起牛的腹泻、发热、白细胞减少、口腔及消化道黏膜糜烂和坏死、怀孕母牛流产或产畸型胎儿等为特征的一种接触性传染病,急性病毒感染可引起免疫抑制,妊娠30-120日龄感染引起犊牛持续性感染和免疫耐受。本病在世界各国牛场普遍存在,给畜牧业生产造成严重的经济损失,世界动物卫生组织(OIE)将其列为进出口动物贸易必须检疫疫病,我国列为二类疫病。先前研究显示BVDV基因组编码的非结构蛋白Npro和结构蛋白Erns(E0)能够抑制宿主先天性免疫应答,非结构蛋白NS4B在病毒复制复合物中起到关键支架作用,但是,关于其在病毒发病机理中的作用知之甚少。本研究主要对BVDV基因组编码的NS4B蛋白在先天性免疫应答过程中的作用进行探究,并阐明其在RIG-I样受体(RIG-I like receptors,RLRs)介导的I型干扰素信号通路中的作用及其分子机制。首先,本研究构建了p CDNA3.0-HA-NS4B真核表达质粒,通过PCR扩增NS4B基因,胶回收和酶切后对目的基因及表达载体进行连接,经过转化和双酶切鉴定后,将鉴定正确的重组质粒p CDNA3.0-HA-NS4B转染至HEK-293T和MDBK细胞中,Western blot验证NS4B的表达;进一步应用双荧光素酶报告基因、实时荧光定量PCR和ELISA方法验证NS4B对I型干扰素的影响。结果显示,经Western blot检测NS4B在39 KDa处出现明显的目的条带,证明真核表达载体构建成功。通过双荧光素酶报告基因和实时荧光定量PCR检测发现BVDV NS4B显着抑制Se V诱导的IFN-β启动子的激活,并呈剂量依赖性,同时NS4B抑制HEK-293T和MDBK细胞中IFN-β的m RNA水平。ELISA检测结果发现NS4B抑制Se V诱导的HEK-293T细胞上清液中IFN-β的分泌。研究表明BVDV NS4B具有抑制I型干扰素的特性。其次,为深入探究BVDV NS4B通过何种机制抑制RLRs介导的I型干扰素应答,通过对RLRs通路中下游信号分子IRF3的磷酸化检测发现过表达BVDV NS4B后能抑制HEK-293T细胞中的IRF3磷酸化水平,通过双荧光素梅报告基因检测NS4B与RLRs信号通路中的关键信号分子对IFN-β启动子的激活,发现NS4B显着抑制MDA5诱导的IFN-β表达。随后过表达NS4B,通过实时荧光定量PCR检测各信号分子的转录水平,发现在HEK-293T细胞转染后12 h和24 h两个时间段NS4B均降低了MDA5的m RNA水平,而在MDBK细胞转染后24 h也显着降低了MDA5的m RNA水平。再次通过免疫共沉淀试验证明了NS4B与MDA5相互作用,并且激光共聚焦检测确定NS4B与MDA5存在共定位现象,并定位于细胞质中。研究表明BVDV NS4B通过与MDA5相互作用抑制I型干扰素通路的激活。最后,为深入探索BVDV NS4B与MDA5中哪个结构域存在相互作用,构建了MDA5三个不同结构域的真核表达载体质粒,经Western blot验证,结果显示2CARD、HEL、CTD分别在34 KDa、70 KDa和20 KDa处出现明显的目的条带,通过免疫共沉淀试验发现BVDV NS4B与MDA5中的2CARD结构域相互作用。激光共聚焦检测发现NS4B与MDA5-2CARD存在共定位现象,并定位于细胞质中。综上所述,本研究证明了BVDV NS4B蛋白与RLRs信号通路MDA5结构域中的2CARD区相互作用来负调控I型干扰素的表达。进一步提高了对BVDV非结构蛋白参与逃避宿主先天性免疫应答机制的理解,为深入了解BVDV致病机理奠定了理论基础。

刘存[2](2020)在《BVDV感染MDBK细胞转录组学分析及牛Mx1蛋白对BVDV复制的影响》文中研究指明牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)是一种可感染多种偶蹄动物的传染性病原,可引起牛病毒性腹泻/黏膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD),可造成严重的经济损失。天然免疫在抗病毒感染中发挥重要的作用,其与病毒间相互作用的分子机制,可以为疫病防控提供新的思路。干扰素(Interferon,IFN)系统是天然免疫的重要组成部分,而干扰素诱导蛋白是干扰素系统的效应分子,发挥直接抗病毒作用。黏病毒抵抗蛋白(Myxovirus-resistant protein,Mx)是IFN诱导抗病毒状态的关键成分,对其抗病毒作用机制的研究,有助于对病原与宿主间相互作用的认识。本文主要从BVDV与宿主相互作用的角度,围绕BVDV感染牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cells,MDBK)前后转录组学变化及牛Mx1蛋白对BVDV感染作用的影响进行了研究,获得了以下结果。1.分离鉴定了BVDV BJ-2013株和BVDV BJ-2016株2株病毒(1)通过RT-PCR检测、细胞分离培养、间接免疫荧光等方法由牛血清和胎牛血清中分离、鉴定2株BVDV毒株,命名为BVDV BJ-2013株和BVDV BJ-2016株。利用BVDV 5’UTR序列基因型分型分析,发现BVDV BJ-2013株和BVDV BJ-2016株分别属于1a和1b基因型。(2)通过氨基酸序列比对分析和同源性比较分析,发现BVDV BJ-2013株的NS2蛋白氨基酸序列中存在12个氨基酸(LGEGNWLVNADR)的插入,BVDV BJ-2013株与BVDV 08GB44-1株的核苷酸和氨基酸同源性最高,而BVDV BJ-2016株与BVDV HJ-1株的核苷酸和氨基酸同源性最高。通过遗传演化分析,BVDV BJ-2013株与BVDV08GB44-1、Oregon株位于同一分支,亲缘关系较近;BVDV BJ-2016株与BVDV HJ-1、PJ、08GB45-2等分离毒株被分配于同一进化分支中,显示它们之间的亲缘关系较近。2.BVDV感染MDBK细胞前后转录组学的比较分析(1)通过转录组学测序技术,比较了BVDV BJ-2016株感染MDBK细胞前后不同时间的细胞转录组的变化。结果显示,共获得转录本53929条,注释到24616个基因,注释到新转录本26651条、新基因2359个。(2)通过基因差异表达分析,在Mock vs MBV 2h、Mock vs MBV 6h、Mock vs MBV12h、Mock vs MBV 24h比较组中分别筛选了1297、1732、3072、1877个差异表达基因。通过差异表达基因的GO富集分析、KEGG pathway富集分析等,发现BVDV感染细胞后引起脂质代谢相关基因的表达上调,表明BVDV感染后改变了细胞的代谢网络;发现BVDV感染细胞后引起补体和凝血级联反应信号通路中F3、C3、C1R等基因表达下调和部分具有抗病毒作用基因(如ISG15、IFITM1、Mx1等)的表达呈现显着变化,提示补体系统在BVDV感染过程中发挥重要作用,提示BVDV感染后对细胞内天然免疫的抑制有助于其感染形成。3.牛Mx1蛋白对BVDV的复制具有抑制作用(1)通过牛Mx1基因过表达慢病毒和sh RNA干扰慢病毒的感染,分别建立了Mx1基因稳定过表达和稳定敲低的MDBK细胞系。鉴定结果显示,牛Mx1基因稳定过表达细胞系中Mx1基因的表达上调5.15倍,Mx1基因稳定敲低的细胞系中Mx1基因的敲低效率达93.03%。通过BVDV分别感染Mx1基因稳定过表达和稳定敲低的细胞系,检测BVDV复制水平,结果显示,牛Mx1基因的过表达可显着抑制BVDV复制(P<0.01),而Mx1基因的敲低显着促进BVDV复制(P<0.01),表明牛Mx1蛋白对BVDV复制具有抑制作用。(2)通过在反转录过程引入非病毒序列对BVDV正负链RNA进行区分,建立了BVDV链特异性荧光定量PCR方法。通过BVDV感染Mx1基因稳定过表达和稳定敲低细胞,检测细胞内BVDV正负链RNA的变化,结果显示,Mx1基因的过表达降低了细胞中BVDV正负链RNA的含量,在BVDV感染后12~24 h间显着降低细胞内BVDV正链RNA的含量(P<0.05或P<0.01),在感染后6~36 h间,显着降低了BVDV负链RNA的含量(P<0.05或P<0.01),显示Mx1基因过表达抑制BVDV正负链RNA的复制;Mx1基因的敲低提高了细胞中BVDV正负链RNA的含量,BVDV感染后6~36 h间显着提高了BVDV负链RNA的含量(P<0.01),而BVDV正链RNA仅在BVDV感染后24~36 h呈显着提高(P<0.05),显示Mx1基因的敲低促进正负链RNA复制。结果表明,Mx1蛋白对BVDV正负链RNA的复制具有抑制作用。综上所述,本研究分离鉴定了BVDV BJ-2013株和BVDV BJ-2016株2株病毒,明确了BVDV感染MDBK细胞前后转录组学变化及其部分差异基因的作用,建立了BVDV链特异性荧光定量PCR方法,发现牛Mx1蛋白显着抑制BVDV复制及BVDV正负链RNA的复制。研究结果为解析BVDV与宿主间的相互作用和牛Mx1蛋白抗BVDV感染作用及机制提供了新的科学资料。

靳明星[3](2020)在《宿主ARFGAP1对CSFV复制的影响及与NS5A的互作研究》文中进行了进一步梳理猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的猪瘟(Classical swine fever,CSF)是一种多系统、高传染性和具有重要经济意义的疾病,在全球范围内造成巨大的经济损失。探索出经济高效的防控方法在很大程度上取决于对CSFV致病机理的清楚认识。研究发现宿主细胞外被体蛋白Ⅰ(Coatproteincomplex Ⅰ,COP Ⅰ)可参与调控病毒的复制,而且发现COP Ⅰ与CSFV复制有着密切的关系。ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白 1(ADP ribosylation factor GTPase-activating protein 1,ARFGAP1)是 COPⅠ的一个关键调控蛋白,参与COP Ⅰ及网格蛋白包被的囊泡的形成,并且ARFGAP1还在病毒复制过程中发挥作用。CSFVNS5A蛋白是一个与病毒复制密切相关的非结构蛋白,但尚不清楚ARFGAP1是否与NS5A有互作关系。因此,本研究旨在探讨ARFGAP1对CSFV复制的影响及与NS5A的相互作用,获得了以下结果。(1)ARFGAP1正向调控CSFV的复制。用不同浓度ARFGAP1抑制剂(QS11)处理细胞或者同一浓度QS11处理细胞不同时间点后,显着抑制了 CSFV的复制和子代病毒的产生(P<0.05,P<0.01);通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和间接免疫荧光(IFA)检测发现,过表达ARFGAP1显着促进了 CSFV复制和子代病毒的产生,而干扰ARFGAP1则显着抑制了 CSFV复制及子代病毒的产生(P<0.05,P<0.01),说明ARFGAP1能够正向调控CSFV的复制。(2)CSFV感染促进ARFGAP1的mRNA和蛋白表达。应用RT-qPCR、Western blot检测CSFV感染细胞后ARFGAP1的mRNA和蛋白表达量,结果显示CSFV感染会增加ARFGAP1的mRNA和蛋白表达量。(3)ARFGAP1与CSFV NS5A蛋白存在相互作用。免疫共沉淀(Co-IP)发现ARFGAP1与CSFVNS5A蛋白在细胞内存在相互作用,GST pull-down发现ARFGAP1与CSFV NS5A蛋白存在直接相互作用,激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察到ARFGAP1与CSFVNS5A在细胞内存在共定位现象。综上所述,研究表明宿主ARFGAP1能够促进CSFV的复制,并且与CSFVNS5A存在相互作用。研究结果为了解ARFGAP1对CSFV复制的影响及与CSFVNS5A的相互作用提供了新的科学资料。

滕永泰[4](2020)在《重庆荣昌家禽坦布苏病毒流行病学调查及分子生物学特征分析》文中研究指明禽坦布苏病毒病(Tembusu virus disease,TMUVD)是由坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)引起禽类的一种急性高度接触性传染病,主要感染家禽,以种鸭和蛋鸭易感性最高,引起蛋鸭产蛋率急剧下降,肉鸭、雏鸭腹泻和神经症状,具有发病率高、死亡率低的特征。为了解重庆市荣昌区TMUV的流行趋势及基因遗传变异情况,本试验对重庆荣昌安富、峰高、双河、昌元4个地区采集的禽类样本进行了ELISA抗体和RT-PCR检测,并对TMUV的E、NS3基因进行扩增测序,分析相关基因的变异情况,为荣昌地区禽坦布苏病毒病的预防提供一定的理论依据,试验结果如下:1.ELISA抗体检测结果:在重庆荣昌区共采集未免疫的家禽血清及鸽蛋样本312份,检出阳性96份,阳性率为30.77%。其中鸭血清样本184份,检出阳性5份,阳性率为2.72%;鹅血清样本44份,检出阳性38份,阳性率为86.36%;鸡血清样本43份,检出阳性35份,阳性率为81.40%;鸽卵黄抗体样本41份,检出阳性18份,阳性率为43.90%。结果表明,鹅的阳性率最高,鸡和鸽次之,鸭最低。经统计学分析,鸭的阳性率与鸡、鹅、鸽的阳性率差异显着(P<0.05),鸽的阳性率与鸡、鹅的差异显着(P<0.05),鹅和鸡的阳性率差异不显着(P>0.05)。在荣昌区昌元街道、峰高街道、双河街道、安富街道采集的184份鸭血清中,其中肉鸭样本154份,检出阳性4份,阳性率为2.30%,蛋鸭血清样本30份,检出阳性1份,阳性率为3.33%,经统计学分析,肉鸭和蛋鸭的阳性率差异不显着(P>0.05),各街道采集的鸭血清样本分别为46份,43份,45份和50份,经ELISA检测,阳性样本数分别为1份,0份,1份和3份,阳性率分别为2.17%、0.00%、2.22%、6.00%,以安富街道阳性率最高,峰高街道阳性率最低,各街道之间阳性率差异不显着(P>0.05)。在荣昌区采集的154份肉鸭血清样本中,北京鸭血清样本29份,检出阳性1份,阳性率为3.45%;樱桃谷鸭血清样本125份,检出阳性3份,阳性率为2.40%,经统计学分析差异不显着(P>0.05)。在荣昌区采集的154份肉鸭血清样本中,50日龄以上的血清样本40份,检出阳性2份,阳性率为5.00%;50日龄以下的肉鸭血清样本114份,检出阳性2份,阳性率为1.75%,虽然50日龄以上肉鸭抗体阳性率高于50日龄以下,但统计学分析差异不显着(P>0.05)。在125份樱桃谷鸭血清中,50日龄以上血清样本22份,检出阳性1份,阳性率为4.55%;50日龄以下血清样本103份,检出阳性2份,阳性率为1.94%,经分析差异不显着(P>0.05)。在29份北京鸭血清样本中,50日龄以上的北京鸭血清样本18份,检出阳性1份,阳性率为5.56%;50日龄以下的北京鸭血清样本11份,检出阳性0份,阳性率为0.00%,经差分析差异不显着(P>0.05)。ELISA抗体检测结果显示,重庆荣昌区鹅的TMUV感染率最高,为86.36%;其次为鸡81.40%;鸽43.90%;最低为鸭2.72%。2.RT-PCR检测结果:在重庆荣昌区水口寺屠宰场和荣昌安邦家禽屠宰场共采集鸡、鸭、鹅肝脏样本20份、60份、10份,共90份。经NS3和E基因RT-PCR检测结果表明:鸭检出阳性2份,鸡、鹅均未检出,阳性率分别为3.33%、0%、0%。将检出的阳性样本分别命名为RC1株和RC2株,表明重庆荣昌区鸭存在健康带毒的情况。3.TMUV的NS3、E基因测序表明:RC-1和RC-2株NS3基因序列的同源性为96.4%,与我国鸭源毒株SD14的NS3基因序列同源性最高,为99.8%,在进化树上与我国鸭源毒株SD14聚集在一个小支上。RC-1、RC-2株E基因序列的同源性为99.4%,与我国鸭源毒株SD14的E基因序列同源性最高,为99.7%,与我国鸭源其它毒株的同源性在91.6%-92.9%之间,在进化树上与我国鸭源毒株SD14单独聚集在Group2上,NS3和E基因未出现明显遗传变异,表明重庆荣昌区禽坦布苏病毒E、NS3基因在遗传衍化过程中变异较小。

秦亚娟[5](2020)在《运用双抗原夹心ELISA法和间接ELISA法检测丙型肝炎病毒抗体结果的一致性比较》文中认为目的:探讨运用双抗原夹心酶联免疫法(ELISA)与间接ELISA法检测丙型肝炎病毒(HCV)抗体结果的一致性。方法:收集2018年1月1日至2018年10月31日新疆医科大学第三附属医院行丙型肝炎病毒抗体测定的176例患者血清标本,应用双抗原夹心ELISA法与间接ELISA法检测,并评估二者一致性及结果不一致的影响因素。结果:入组受试者的平均年龄为55.41±13.52岁。间接法(万泰)、双抗原夹法(万泰)与间接法(金豪)ELISA测定的阳性率分别为74.43%、68.75%和73.30%。前二者检测结果具有强的一致性(κ=0.829;P<0.001),后二者具有强的一致性(κ=0.847;P<0.001)。分析双抗原夹心ELISA与间接ELISA结果不一致的影响因素为:女性(OR:1.462;P<0.05),年龄(<35岁;OR:3.667;P<0.05),肿瘤(罹患恶性肿瘤;OR:3.621;P<0.05)。结论:双抗原夹心ELISA法和间接法ELISA检测丙型肝炎病毒抗体具有较高一致性,女性、年龄小于35岁和罹患恶性肿瘤是结果不一致的重要影响因素,推荐使用双抗原夹心ELISA法进行丙型肝炎病毒抗体的测定。

纪伟[6](2019)在《HCV和HBV的特异性T细胞免疫反应和分子机制研究》文中指出丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus,HCV)引起的一种主要经血液传播的传染病,呈世界性流行。根据世界卫生组织报告,全球丙型肝炎的流行率平均为3%,估计有1.7亿人感染丙型肝炎病毒,每年新增感染者300万-400万例,死亡25万例,占所有传染病死因的第10位。丙型肝炎已经成为困扰全球公共卫生的一个重要问题。目前,由于HCV基因的多样性以及缺乏理想的动物和细胞感染模型,HCV疫苗研究仍面临很多难题。T细胞免疫在急性HCV感染中病毒是否能自发清除起到关键作用。研究表明,在自限性HCV感染的患者或黑猩猩中发生了强烈的HCV特异性CD8+T细胞应答,但在慢性感染的宿主中观察到较弱CD8+T细胞应答。为了探究T细胞在HCV感染自然进程中的特征,及T细胞免疫与疾病进程的相关性,我们招募河北省某村因献血感染HCV的聚集性人群为研究对象,其中的HCV感染者是1970-1990年左右因献血感染,没有接受过任何治疗。我们用NS3蛋白overlapping多肽库体外刺激PBMC,通过流式分析T细胞细胞因子分泌、记忆细胞分型及抑制性分子表达等,探究T细胞免疫在HCV病毒清除组和慢性感染组的特征及差异。结果表明,病毒清除组的CD8+T和CD4+T细胞因子分泌能力显着高于慢性感染组和健康对照组。两组HCV特异性CD8+T细胞主要以效应性记忆T细胞(TEM)和效应性T细胞为主(TEMRA),而HCV特异性CD4+T细胞主要以效应性记忆T细胞(TEM)和中心记忆T细胞(TCM)为主。在抑制性分子的表达分析中,慢性感染者病毒特异性CD8+T细胞抑制受体的表达以PD-1高、TIM-3高表达为主要特征,其与以AST或ALT水平异常和形态病理学变化为特征的肝损伤相关。有趣的是,LAG-3在慢性感染者CD8+T细胞上的表达较低,与ALT或AST呈负相关。我们对长时期的HCV感染者的病毒特异性T细胞免疫的特征进行了研究,并有助于阐明免疫应答在相关临床过程中的作用。同时,我们也对慢性感染者感染的HCV病毒进行了分子水平的研究工作。我们对其感染的HCV病毒通过分子生物学实验进行基因分型,并利用一代测序和二代测序手段获得26条全基因组序列。根据基因分型结果,这些感染者感染的是HCV1b(17)、HCV2a(9)两种基因型。对于一代测序的全基因序列,我们根据MEGA7.0的进化距离分析发现,HCV1b间及HCV2a间的序列都有很高的同源性。通过与国内外序列进行系统发育进化树分析,HCV2a的序列相对聚集,聚集在一个独立的分支上,与国外测得的NDM228等株亲缘关系相对较近。HCV1b的17条序列相对分散。对各蛋白编码区也进行了系统进化分析,结果同全基因序列的分析基本一致。通过二代测序,我们获得的信息有原始reads、拼接序列、每条序列每个位点的测序深度、entropy、mutrate等。26条序列的拼接工作已经完成,数据分析还在进行中。我们在病毒“准种”、重要的T细胞表位和中和抗体表位的免疫逃逸突变等角度进行分析,结合临床数据,探究其与肝脏损伤程度的相关性。另外,MHC分子结构在T细胞免疫研究中起了很重要的作用。MHC分子可以限制TCR对多肽的识别,而且多肽与MHC之间的构象协调作用对于TCR的识别至关重要。如果将构像改变的关键氨基酸突变,就会导致pMHC复合物与TCR的结合变弱。同一 MHC-多肽可以被不同TCR识别,MHC-多肽复合物的柔性变化也是TCR可以交叉识别的原因之一。可以看出,MHC-多肽的结合能力以及它们的构象变化影响了TCR识别。我们通过对H-2Kd-HBV peptide复合物分子结构的分析,并结合HLA-B*4001的结构解析及分析,发现两个复合物结构中都有在一个带正电的氨基酸R和负电氨基酸E构成的两种不同形式的盐桥参与MHC与多肽的结合。我们对两个氨基酸进行了单突变和双突变,通过refolding、CD检测MHC与多肽结合的稳定性,以及H-2Kdtetramer对HBV特异性CD8+T的识别,结果证明了盐桥氨基酸的突变影响了多肽与MHC分子的结合能力及多肽-MHC复合物对TCR的识别。综上所述,本研究探究了 T细胞免疫在HCV感染自然进程中的特征和T细胞免疫与肝脏损伤程度的相关性,并对感染者感染的HCV病毒全序列进行了分析。另外,我们基于H-2Kd-HBV peptide HBc87-95和 HLA-B*4001-SARS N216-225复合物结构发现了盐桥在MHC与多肽结合及MHC-多肽复合物对TCR识别的重要性。该研究工作对HCV和HBV的预防和治疗具有一定的提示性和指导性。

王雅雯[7](2019)在《坦布苏病毒NS3蛋白互作宿主蛋白的筛选、验证》文中指出NS3蛋白是坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,TMUV)非结构蛋白中的重要成员,其包含三个结构域S7、DEXDc和HELICc,每个结构域各自分别具有丝氨酸蛋白酶,核苷酸三磷酸酶和RNA解旋酶活性,其具有多种生物学功能,参与病毒生命周期调控和宿主内抗病毒免疫反应。基于酵母双杂交系统,在本研究中,先将构建好的阳性重组质粒pGBKT7-NS3转化到酵母Y2H菌株中,证明它没有自激活能力和毒性,表明诱饵酵母菌已经准备完成,可以进行后续的筛选工作。将复苏后的鸭胚成纤维细胞cDNA文库的猎物酵母菌株与诱饵酵母菌株进行杂交混合培养,得到诱饵与猎物质粒共同存在的杂合二倍体酵母细胞。杂交后在营养缺陷型培养基上进行不同强度层次的筛选,先在低筛选强度的SD/-Trp/-Leu培养皿上进行筛选,以获得较多无表型且生长状态良好的酵母菌落,一对一进行转板,用较高筛选强度的DDO/X/A培养皿筛选出蓝色阳性克隆,再一对一转板到QDO/X/A上进行高筛选力培养,挑取阳性克隆接种到QDO/X/A重复筛选,以此得到更多、更为准确且重复性更高的阳性结果。与NCBI数据库比对,提示筛选出了七种与NS3存在潜在相互作用的宿主蛋白:MGST1,ERCC4,WIF1,WDR75,ACBD3,PRDX1和RPS7。过氧化物还原酶(PRDX1),在细胞内广泛分布并高表达,对活性氧族(ROS)高度亲和,能够调控细胞内由活性氧介导的氧化应激水平,也可协同参与许多转录因子和信号因子的还原过程,因此选择最感兴趣的PRDX1进行后续的验证。使用酵母双杂交回返试验进行体内验证,分别将NS3全长和NS3自身结构域S7、DEXDc、HELICc分组与鸭源以及人源PRDX1进行回返验证试验,回返结果证明HELICc和NS3都为阳性,且人源和鸭源PRDX1在互作结果上也均显示阳性,尽管两者氨基酸同源性上存在差异,但发挥互作的位点相似,表明可以将后续研究转到HEK293细胞中进行。运用激光共聚焦显微镜定位PRDX1和HELICc蛋白,显示在胞浆内存在部分区域的共定位,进一步说明具有互作结合的可能性。借助GST pull-down技术采取进一步的体外互作验证,最终结果表明PRDX1确实与NS3的HELICc结构域发生互作。TMUV NS3的HELICc结构域涉及病毒复制中的RNA解螺旋过程,在此阶段,它需要线粒体加速合成ATP以提供大量能量,同时,其产生的大量代谢副产物游离分布在细胞胞浆内,特别是ROS,过量的ROS导致细胞内稳态失衡,从而激活ASK1来介导P38/MAPK途径诱发细胞凋亡。可以推测,HELICc结构域是否能够通过结合配偶体PRDX1来降低ROS水平,从而缓解细胞内的氧化应激水平,使病毒可以逃避宿主免疫反应。实验结果表明,HELICc蛋白在HEK293细胞内的过表达能够上调PRDX1转录水平,并下调相关通路中P38的转录水平;过表达PRDX1使P38磷酸化降低,抑制P38/MAPK通路,最终减缓细胞凋亡的发生,逃避体内抗病毒免疫反应。本研究为坦布苏病毒感染后机体相关免疫逃逸机制的探索提供了初步理论依据

向田[8](2017)在《丙型肝炎病毒感染中异常表达的肝细胞糖复合物的相关研究》文中认为背景:丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)感染可导致慢性肝炎,肝硬化甚至肝癌。根据2017年世界卫生组织报告,全球估计有近7100万慢性HCV感染患者,每年约有39.9万人死于与丙型肝炎相关的肝脏疾病。我国HCV感染者和发病者总数均居世界首位,且近年来一直呈上升趋势。目前国内临床标准治疗方法为聚乙二醇干扰素α(Peg-IFNα)联合利巴韦林(ribavirin,RBV),但存在费用昂贵、副作用大等缺点。国外上市的DAAs(direct-actingantivirals)类药物,在HCV的治疗方面取得了重大进步。但是这些药物价格昂贵且因为HCV具有高度变异性,在治疗过程中可能会产生抗性突变毒株。蛋白质的糖基化修饰是一种极其重要的翻译后修饰,细胞中约80%蛋白都有糖基化修饰,主要由位于内质网和高尔基体中的糖基转移酶和糖苷酶有序调控完成。随着糖蛋白分析鉴定技术的发展,越来越多的研究表明糖蛋白异常糖基化修饰,尤其是N-糖基化修饰可作为生物标志物用于多种疾病(包括癌症)的诊断和预后评估。病毒感染后宿主细胞的N-糖表达谱的变化和糖识别模式的转变在一定程度上可以反映病毒感染的进展,有望作为病毒感染的诊断和治疗的新靶点。目的:近年来,寻找参与人类重要肝炎病毒感染与免疫致病的关键性宿主因子和翻译后修饰调控因子己成为研究热点。本研究拟从宿主方向着手对HCVcc感染人肝癌细胞Huh7.5.1过程中的异常糖基化及糖相关复合物进行探究。方法:本研究运用MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸飞行时间质谱)技术比较分析了 Huh7.5.1肝癌细胞感染HCVcc(细胞来源的丙肝病毒)前后N-糖链的表达差异。同时,制备了 40种凝集素组成的芯片,用以对HCVcc感染时的糖苷变化进行分析。运用qRT-PCR检测了 12种岩藻糖转移酶在HCV感染Huh7.5.1细胞中的表达变化。另外,我们还运用mRNA表达谱芯片检测Huh7.5.1细胞感染HCV前后mRNA表达的差异。结果:运用MALDI-TOF-MS在正常Huh7.5.1细胞中鉴定到14种N-糖链,在HCVcc感染Huh7.5.1细胞中鉴定到21种N-糖链,两者均表达的有12种N-糖链。对N-糖链进行分类的相对含量分析发现在HCVcc感染的细胞中,岩藻糖型和唾液酸型以及复合型N-糖链结构明显上调。凝集素芯片发现在HCV感染的过程中,LCA、ACA、ECA这3种凝集素所识别的糖苷要明显高于未感染细胞(流式细胞术和共聚焦显微镜分析均已验证)。通过质谱鉴定HCV感染细胞中异常增高的凝集素LCA结合的靶蛋白,我们筛选出HSP90B1(内质网素,也叫热休克蛋白90B1)和ANXA2(膜联蛋白2)作为候选的差异表达的糖蛋白。Western blotting验证发现HCV感染并不能促进这两种蛋白的表达,但是能够上调它们的α1,6岩藻糖基化修饰。同时我们发现HCV感染Huh7.5.1细胞中糖基转移酶FUT8(α1,6岩藻糖转移酶)mRNA表达水平显着上调。进一步验证发现FUT8增强了HCV感染细胞中HSP90B1和ANXA2的岩藻糖基化修饰。且在HCV感染中,FUT8催化活性增强;上调的FUT8通过激活PI3K-AKT信号通路,促进HCV感染细胞的增殖;诱导了 HCV对抗病毒药物的耐药;降低了抗病毒药物对HCV的抑制作用,从而导致HCV复制的增加。对mRNA芯片结果进行qRT-PCR验证,将HCV感染后表达上调最高的基因之一 TNNT1作为研究靶基因。发现TNNT1上调细胞周期相关基因的表达,促进细胞增殖和HCV的复制,并筛选出在病毒感染时与TNNT1相互作用的蛋白MTA2结论:本研究筛选与鉴定了 HCV感染诱导的异常表达的相关糖复合物以及其他差异表达的分子,研究成果将为阐明HCV感染的分子机制提供理论基础,同时也为研发HCV感染新型诊断及防治标记物奠定基础,为寻找HCV药物靶点提供新的思路。

赵程[9](2017)在《猪瘟病毒非结构蛋白p7及其对感染性病毒产生的调节》文中指出猪瘟(Classical swine fever,CSF)是猪的一种高度接触性、致死性传染病,由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染引起。猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)的广泛应用,有效地控制了猪瘟的爆发和大流行。但猪瘟在我国仍持续存在,呈现诸如非典型猪瘟、慢性猪瘟和持续感染等特点,给养猪业造成巨大危害。深入研究CSFV基因组编码蛋白的结构与功能,进而阐明病毒致病机制,是猪瘟病毒研究的重要方向之一。在CSFV基因组上,p7位于E2与NS2之间,是一种多功能离子通道蛋白,也是CSFV的毒力因子之一。在黄病毒科成员中,只有丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)和瘟病毒编码p7蛋白。目前已知HCV p7蛋白具有离子通道活性,通过介导病毒蛋白之间相互作用参与病毒粒子组装。但对瘟病毒p7的结构与功能及其在感染性病毒产生中作用的认识明显不足。为了揭示瘟病毒p7的结构与功能及其在感染性病毒产生中的作用,首先构建了 CSFVp7、E2和NS2真核表达质粒,研究了 p7与E2和NS2之间的相互作用。免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation assays,Co-IP)和荧光共聚焦(Confocal)实验结果证实,p7与NS2、E2与NS2、p7与p7之间存在蛋白-蛋白相互作用;而p7和E2的相互作用相对较弱。E2、p7和NS2蛋白在细胞中能够形成蛋白质复合物。通过分别构建p7和NS2的截短突变体,进行Co-IP和Confocal实验,研究发现p7第一个跨膜结构域(TM1)和NS2的TM1是二者相互作用的关键区域。另外,我们还构建了 E2p7前体蛋白和p7NS2联体蛋白的真核表达质粒,通过Co-IP和Confocal实验研究发现,与E2蛋白相比,E2p7前体蛋白与NS2或p7NS2的相互作用显着增强。基于CSFV感染性cDNA克隆pSM反向遗传操作,构建了 E2p7切割功能失活的cDNA克隆pSIM/E2ASG/NSR和p7中心区域缺失的cDNA克隆pSM/△p715-51。病毒拯救分析显示,E2p7切割功能失活或p7中心区域缺失导致无感染性病毒产生。在E2和p7切割位点之间插入核糖体进入位点序列(Internal ribosome entry site,IRES),构建了双顺反子cDNA克隆pSM/E2/IRES。病毒拯救分析显示,在没有E2p7前体蛋白存在的情况下,仍能有效拯救出CSFV。然而,与感染性cDNA克隆pSM相比,双顺反子cDNA克隆pSM/E2/IRES拯救出的CSFV滴度显着降低,表明E2p7前体蛋白切割产生成熟的E2和p7蛋白为感染性病毒产生所必需,而E2p7前体蛋白的存在能够促进感染性病毒的产生。基于CSFV感染性cDNA克隆pSM反向遗传操作,我们对p7蛋白N末端1-9位氨基酸进行单个位点突变,对p7 N端TM1不同性质的代表性氨基酸进行单个或三个位点突变。病毒拯救分析显示,除p7YFY25/26/30AAA完全阻碍感染性病毒产生外,其它所有位点突变均导致显着降低的感染性病毒产生,表明p7N末端1-9位氨基酸和TM1的氨基酸在调节感染性病毒产生中发挥作用。基于pSM/E2/IRES反向遗传操作,对p7 N末端1-9位氨基酸进行单个位点突变。病毒拯救分析显示,在没有E2p7前体蛋白存在的情况下,这些位点突变不影响或一定程度上调病毒产生,表明p7 N末端氨基酸对感染性病毒产生的调节一定程度上与影响E2p7前体蛋白的切割密切相关。通过构建p7 TM1三个位点突变的真核表达质粒进行Co-IP实验,研究发现p7 突变体如 p7TD118/19/20AAA、p7EVV21/22/23AAA或p7YFY25/26/30AAA与NS2的相互作用显着减弱,表明p7和NS2的相互作用是影响感染性CSFV产生的重要因素之一。为了研究p7在病毒基因组复制中的作用,选取了包含代表性p7突变位点(p7Q5A、p7V8A、p7V9A、p7Y30A、p7TD118/19/20AAA、p7EVV212223AAA)的单顺反子 cDNA 克隆进行基因组复制分析。结果显示,CSFVp7N端氨基酸突变不影响病毒基因组复制,暗示p7调节感染性病毒产生发生在基因组复制后的病毒蛋白加工及病毒粒子成熟阶段。本论文的研究结果有助于加深对猪瘟病毒基因组结构与功能、病毒复制调控和致病机制的理解,对于发展猪瘟防控新策略等有重要意义。

杨振[10](2009)在《中国献血员人群丙型肝炎病毒“窗口期”感染分析》文中认为血液传播是丙型肝炎病毒(HCV)感染的一个重要途径之一。在我国所有临床使用的血液,全部需经过HCV抗体检测以确保血液安全。由于国际上HCV抗体酶联免疫诊断试剂已从第一代向第三代甚至第四代发展,同时也出现了新的HCV抗体诊断方法,如微粒子试剂和化学发光试剂,HCV抗体试剂的质量明显提高。这些试剂在中国的血液中心和医院也已开始使用,这样就提高了血液和血液制品的质量,同时也保障了临床治疗的安全。但是,由于理论上HCV感染存在一个“窗口期”,这一阶段尚无抗体的出现,利用抗体试剂无法检出HCV感染的存在。在实际中,国内外均有因存在“窗口期”问题而导致HCV输血感染的报道。因此,欧洲、美国等国家相继规定在血源筛查中使用HCV抗原和核酸(RNA)检测方法。但中国关于这方面的临床研究及流行病学调查相对薄弱,因此,无法制定关于血液HCV抗原和核酸检测的相关政策。本研究为解决中国因HCV“窗口期”造成的输血感染问题,分别利用了来自北京某血液中心的6190份献血员样品,四川成都某血液中心的766份献血员样品,广东深圳某血液中心的1693份献血员样品,566份河北廊坊某血液中心的HCV可疑感染样品,总共9215份血样,对中国HCV“窗口期”感染情况进行研究分析。HCV游离核心抗原检测发现:在8649份自然供血员血清中,确证检出一份游离核心抗原单独阳性血清,在566份高危人群HCV可疑感染者血清中,确证检出一份游离核心抗原和HCV抗体同时阳性血清,经抗体确证该份血清产生的抗体是核心区抗体(Core)。HCV RNA试剂检测这2份血清,全部阳性,病毒载量分别为42300(copies/ml)和653000(copies/ml)。同时,这两份血清送澳大利亚国家血液中心进行RNA复核,检测结果与我们一致。由于确证检出了游离核心抗原阳性的“窗口期”样品,尽管游离核心抗原的检出率较低,但对于中国庞大的献血员人群仍有其现实意义。核心总抗原检测发现,在收集的血清中,用核心总抗原试剂共筛出91份阳性血清,其中,自然献血员中7份,可疑感染者中84份,这84份可疑感染者血清中HCV抗体同时阳性76份,抗体阴性而总抗原阳性血清8份。应用HCV RNA试剂检测这8份血清,6份RNA为阳性。抗体筛查阴性而总抗原阳性的8份血清中仅确证检出一份单独游离核心抗原阳性样品,这是否与抗原抗体复合物的形成对抗体的检测造成了影响,产生了抗体检测的假阴性结果,尚有待进一步的研究。核心总抗原试剂共筛出的91份阳性血清中,有2份HCV RNA和抗体检测都呈阴性的样品。看来HCV感染存在一个核酸和抗体都阴性,核心总抗原阳性的阶段。这一现象值得重视。HCV RNA检测发现,18-60岁的正常献血员中,筛出7份RNA阳性而抗体阴性的血清,利用HCV核心总抗原试剂检测全部阳性,表明,我们筛查的献血员中“窗口期”样品比例达0.081%,高于西方的0.041%。在566份HCV可疑感染者血清中,也筛出6份HCVRNA阳性而抗体阴性的血清,利用HCV核心总抗原试剂检测,这6份也是阳性,可以认为这些血清也是“窗口期”样品。这13份血清送到澳大利亚国家血液中心进行RNA复核,检测结果与我们一致。在566份HCV可疑感染的献血员血清中,检测出84份核心总抗原阳性样品,阳性率14.84%。检出491份RNA阳性样品,阳性率86.75%。检出抗体阳性样品550份,阳性率97.17%。抗体检出率最高,但仍漏检6份核心抗原与核酸阳性血清。从理论上来说,核酸检测应该是最早期出现的,但伴随免疫压力,它又不是一直得以检出。在566份血清中就可以看出,它的检出率并不是最高的。综上所述,RNA试剂、抗原试剂以及抗体试剂在血清学检测时,所得结果并不完全平行,有一部分重叠检出,也有一部分交叉检出,由于检出了HCV游离核心抗原、核心总抗原以及RNA单独阳性或同时阳性但抗体阴性的“窗口期”样品,利用HCV抗体试剂对血液进行筛查的同时,使用抗原以及RNA试剂做必要的补充实验,可以减少因“窗口期”样品造成的漏检。因此推荐这些检测方法互相补充来解决“窗口期”问题可能是比较可行的。进行基因型别分析,健康献血员中筛出的7份HCVRNA阳性的样本,其中北京3份,基因型分别为2a、lb和3a型。成都1份,基因型为3b型,深圳3份,基因型分别为1a和两个lb型。在566份HCV可疑感染者血清中,对检出RNA阳性的491份血清进行型别分布分析,以1b、2a型为主,分别为41.5%和39.3%。对照已有报道的临床样本基因型别分布情况,献血员样本与临床样本HCV RNA型别分布是一致的。研究不同基因型别样品与病毒载量及转氨酶的相互关系,我们发现在HCV早期感染人群中,1b与2a基因型间病毒载量差异具有统计学意义。2a型人群HCV RNA载量明显高于1b型人群(P<0.01),其他基因型别病毒载量均低于1b型。由于不同型别抗体检出率没有明显差异(P>0.05),这说明2a型与其他基因型别不存在免疫压力的差别,表明2a型在自然复制过程中,与其他型别相比,存在复制优势。同时,不同基因型人群,丙氨酸转氨酶(ALT)水平的差异有统计学意义,2a型人群ALT明显高于1b型人群(P<0.01)。由此看来,这两个基因型别之间,HCV对肝的损伤程度可能有差别,2a型更易引起肝损伤,当然,这也需要得到临床进一步的研究来证实。其他基因型由于样本量太少,小样本与1b、2a基因型的大样本无法进行统计分析,也有待进一步研究。基于本研究,我们得出如下结论:(1)由于检出了HCV游离核心抗原、核心总抗原以及RNA单独阳性或同时阳性但抗体阴性的“窗口期”样品,表明,HCV感染“窗口期”的存在会严重威胁血液和血液制品的安全,因此,在HCV抗体筛查的基础上,对血液和血液制品的HCV RNA和核心抗原的进一步检测是必要的,能够减少“窗口期”样品的漏检:(2)在我国,HCV“窗口期”感染率为0.081%,高于西方国家的0.041%;(3)后“窗口期”感染的基因型主要为1b和2a,与我国已报道过的临床样本基因型别分布比例基本一致,有别于西方国家的基因型别分布。(4)2a基因型与其他型别相比,病毒载量有显着升高,它较其他基因型存在复制优势,这一发现,国内外尚没有相关报道。

二、丙型肝炎病毒NS3区不同末端基因的表达及产物抗原性分析(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、丙型肝炎病毒NS3区不同末端基因的表达及产物抗原性分析(论文提纲范文)

(1)牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS4B抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制研究(论文提纲范文)

摘要
英文摘要
第一章 文献综述
    1.1 牛病毒性腹泻/黏膜病研究进展
        1.1.1 概述
        1.1.2 BVDV分类与基因组
        1.1.3 BVDV基因组结构蛋白和非结构蛋白
        1.1.4 BVDV流行情况
    1.2 抗病毒天然免疫及Ⅰ型干扰素信号通路的研究进展
        1.2.1 抗病毒天然免疫
        1.2.2 抗病毒天然免疫受体
        1.2.3 Ⅰ型干扰素的研究进展
        1.2.4 RNA病毒诱导的Ⅰ型干扰素产生的信号通路
        1.2.5 TLRs介导的信号通路
        1.2.6 RLRs介导的信号通路
    1.3 黄病毒科非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制的研究进展
        1.3.1 WNV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制
        1.3.2 ZⅠKV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制
        1.3.3 YFV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制
        1.3.4 JEV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制
        1.3.5 DENV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制
        1.3.6 HCV非结构蛋白抑制Ⅰ型干扰素作用机制
    1.4 瘟病毒属CSFV和 BVDV抑制Ⅰ型干扰素研究进展
    1.5 研究目的和意义
第二章 BVDV NS4B真核表达载体的构建及对ⅠFN-β的影响
    2.1 材料
        2.1.1 细胞、毒株及质粒
        2.1.2 质粒构建载体图谱及多克隆位点
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 仪器设备
    2.2 方法
        2.2.1 细胞培养
        2.2.2 引物设计
        2.2.3 BVDV和 SeV的增殖
        2.2.4 病毒/细胞总RNA的提取
        2.2.5 重组质粒的构建
        2.2.6 磷酸钙转染
        2.2.7 质粒电击转染MDBK细胞
        2.2.8 免疫印记分析
        2.2.9 双荧光素酶报告基因检测
        2.2.10 实时荧光定量RT-PCR
        2.2.11 ELISA检测细胞上清液中IFN-β的分泌
        2.2.12 统计学方法
    2.3 结果
        2.3.1 BVDV NADL株感染MDBK细胞结果
        2.3.2 BVDV-NS4B扩增结果
        2.3.3 重组质粒pCDNA3.0-HA-NS4B的鉴定
        2.3.4 Western blot验证pCDNA3.0-HA-NS4B表达结果
        2.3.5 BVDV NS4B抑制SeV诱导的IFN-β启动子活性
        2.3.6 BVDV NS4B蛋白抑制SeV诱导的IFN-β表达
        2.3.7 BVDV NS4B蛋白抑制SeV诱导的细胞上清液中IFN-β的分泌
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 牛病毒性腹泻病毒NS4B蛋白对RLRs通路的抑制作用研究
    3.1 材料
        3.1.1 细胞、毒株及质粒
        3.1.2 质粒构建载体图谱及多克隆位点
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 主要仪器设备
    3.2 方法
        3.2.1 RLRs通路信号分子重组质粒的构建
        3.2.2 磷酸钙转染
        3.2.3 质粒电击转染MDBK细胞
        3.2.4 免疫印记分析
        3.2.5 BVDV NS4B对 IRF3 磷酸化的影响
        3.2.6 NS4B和 RLRs信号通路中各信号分子对IFN-β启动子的激活
        3.2.7 实时荧光定量检测NS4B蛋白对内源性RLRs通路各信号分子的转录水平.
        3.2.8 免疫共沉淀
        3.2.9 激光共聚焦
        3.2.10 统计学方法
    3.3 结果
        3.3.1 RLRs各信号分子双酶切鉴定结果
        3.3.2 RLRs各信号分子Western blot表达结果
        3.3.3 BVDV NS4B抑制IRF3 的磷酸化
        3.3.4 BVDV NS4B作用靶点位于MDA5 及其上游水平
        3.3.5 BVDV NS4B抑制内源性MDA5 的表达
        3.3.6 BVDV NS4B与外源性MDA5 相互作用
        3.3.7 BVDV NS4B与外源性MDA5 共定位
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 BVDV NS4B蛋白对MDA5 不同结构域作用机制研究
    4.1 材料
        4.1.1 细胞、菌株和质粒
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 仪器设备
    4.2 方法
        4.2.1 MDA5 不同结构域引物设计
        4.2.2 磷酸钙转染
        4.2.3 免疫印记分析
        4.2.4 免疫共沉淀
        4.2.5 激光共聚焦
    4.3 结果
        4.3.1 MDA5-2CARD、MDA5-HEL、MDA5-CTD重组质粒双酶切鉴定
        4.3.2 MDA5 各结构域Western blot表达结果
        4.3.3 BVDV NS4B与外源性MDA5-2CARD相互作用
        4.3.4 BVDV NS4B与外源性MDA5-2CARD共定位
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 结论
参考文献
致谢
附录
个人简历

(2)BVDV感染MDBK细胞转录组学分析及牛Mx1蛋白对BVDV复制的影响(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
文献综述
    第一章 牛病毒性腹泻病毒研究进展
        1.1 BVDV病原学概述
        1.2 BVDV分子特征
        1.3 BVDV生命周期
        1.4 BVDV与宿主相互作用
        1.4.1 宿主模式识别受体
        1.4.2 BVDV感染对天然免疫细胞的影响
        1.4.3 BVDV感染对细胞因子的影响
        1.4.4 BVDV感染与细胞凋亡
        1.4.5 BVDV感染与免疫逃逸
    第二章 Mx蛋白及其抗病毒感染研究进展
        2.1 Mx蛋白的结构
        2.2 Mx蛋白抗病毒感染机制
        2.2.1 Mx蛋白抗流感病毒感染机制
        2.2.2 Mx蛋白抗弹状病毒科病毒感染机制
        2.2.3 Mx蛋白抗布尼亚病毒科病毒感染机制
        2.2.4 Mx蛋白抗副黏病毒科病毒感染机制
        2.2.5 Mx蛋白抗黄病毒科病毒感染机制
        2.2.6 Mx蛋白抗其他病毒感染机制
试验研究
    第三章 牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定
        3.1 材料
        3.1.1 样品来源
        3.1.2 细胞、菌毒种和主要试剂
        3.1.3 主要仪器
        3.2 方法
        3.2.1 引物设计与合成
        3.2.2 细胞的培养与传代
        3.2.3 RNA提取及c DNA合成
        3.2.4 PCR鉴定
        3.2.5 病毒的分离
        3.2.6 间接免疫荧光法鉴定BVDV
        3.2.7 病毒粒子的形态学观察
        3.2.8 TCID50效价测定
        3.2.9 病毒基因型的鉴定
        3.2.10 全基因组序列测序及分析
        3.3 结果
        3.3.1 血清样品RT-PCR检测
        3.3.2 BVDV毒株的分离
        3.3.3 间接免疫荧光法鉴定BVDV
        3.3.4 病毒粒子的形态学观察
        3.3.5 TCID50效价测定
        3.3.6 病毒基因型的鉴定
        3.3.7 全基因组序列分析
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第四章 BVDV感染MDBK细胞前后的转录组学测定及差异分析
        4.1 材料
        4.1.1 病毒、细胞和主要试剂
        4.1.2 主要仪器
        4.2 试验方法
        4.2.1 BVDV BJ-2016株的增殖与特征
        4.2.2 转录组测序
        4.2.3 数据处理与评价
        4.2.4 基因表达差异分析
        4.2.5 差异表达基因富集分析
        4.3 结果
        4.3.1 BVDV BJ-2016株生长特征
        4.3.2 RNA提取与质量评估
        4.3.3 数据处理与评价
        4.3.4 基因表达差异分析
        4.3.5 差异表达基因GO富集分析
        4.3.6 差异表达基因KEGG Pathway富集分析
        4.4 讨论
        4.5 小结
    第五章 牛Mx1蛋白对BVDV复制的抑制作用研究
        5.1 材料
        5.1.1 细胞、菌毒种和主要试剂
        5.1.2 主要仪器
        5.2 方法
        5.2.1 引物设计
        5.2.2 BVDV链特异性荧光定量PCR方法的建立
        5.2.3 牛Mx1基因的克隆
        5.2.4 牛Mx1基因稳定过表达细胞系的构建及鉴定
        5.2.5 Mx1基因稳定敲低细胞系的构建及鉴定
        5.2.6 Western blot
        5.2.7 Mx1基因过表达对BVDV复制的影响
        5.2.8 Mx1基因敲低对BVDV复制的影响
        5.2.9 牛Mx1蛋白与BVDV蛋白相互作用验证
        5.2.10 数据统计
        5.3 结果
        5.3.1 BVDV链特异性RT-qPCR方法的建立
        5.3.2 牛Mx1基因克隆及表达鉴定
        5.3.3 Mx1基因稳定过表达细胞系的构建及鉴定
        5.3.4 Mx1基因敲低细胞系的构建及鉴定
        5.3.5 Mx1基因过表达对BVDV复制的影响
        5.3.6 Mx1基因敲低对BVDV复制的影响
        5.3.7 免疫共沉淀验证牛Mx蛋白与BVDV蛋白
        5.4 讨论
        5.5 小结
结论
创新点
参考文献
致谢
作者简历

(3)宿主ARFGAP1对CSFV复制的影响及与NS5A的互作研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
文献综述
    第一章 猪瘟病毒和ARFGAP1研究进展
        1.1 猪瘟病毒研究进展
        1.1.1 猪瘟病毒结构蛋白的特征及其功能
        1.1.2 猪瘟病毒非结构蛋白特征及其功能
        1.1.3 猪瘟病毒蛋白与宿主细胞的相互作用
        1.1.3.1 宿主细胞调控CSFV的增殖
        1.1.3.2 CSFV蛋白调控宿主天然免疫
        1.1.3.3 CSFV蛋白对细胞自噬及凋亡的影响
        1.2 猪瘟的防控
        1.3 外被体蛋白Ⅰ及ARFGAP1研究进展
        1.3.1 外被体蛋白Ⅰ研究进展
        1.3.1.1 外被体蛋白Ⅰ结构和功能
        1.3.1.2 外被体蛋白Ⅰ参与病毒生命周期
        1.3.2 ARFGAP1功能及研究进展
        1.4 本研究的目的和意义
试验研究
    第二章 ARFGAP1对猪瘟病毒复制的影响
        2.1 材料
        2.1.1 病毒、细胞及质粒
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器设备
        2.2 方法
        2.2.1 细胞培养和传代
        2.2.2 IFA检测CSFV的TCID_(50)
        2.2.3 CSFV感染PK-15细胞
        2.2.4 CSFV增殖曲线的建立
        2.2.5 细胞总RNA的提取及cDNA的合成
        2.2.6 实时荧光定量PCR
        2.2.7 Western blot
        2.2.7.1 蛋白的提取
        2.2.7.2 Western blot步骤
        2.2.8 CCK-8法检测细胞活性
        2.2.8.1 QS11的细胞安全浓度的测定
        2.2.8.2 ARFGAP1过表达及干扰细胞系活力的检测
        2.2.9 ARFGAP1真核表达载体的构建
        2.2.9.1 引物的设计和合成
        2.2.9.2 ARFGAP1基因的PCR扩增与纯化
        2.2.9.3 ARFGAP1全长和pCDH-CMV载体的双酶切
        2.2.9.4 目的基因与载体的连接转化
        2.2.9.5 菌落的挑取及PCR鉴定
        2.2.9.6 重组质粒的提取
        2.2.9.7 重组质粒双酶切鉴定
        2.2.10 ARFGAP1干扰载体的构建
        2.2.10.1 引物的设计与合成
        2.2.10.2 干扰载体的构建
        2.2.11 重组慢病毒包装
        2.2.12 ARFGAP1过表达和干扰细胞系的构建
        2.2.13 数据分析
        2.3 结果
        2.3.1 CSFV在PK-15细胞中增殖曲线的绘制
        2.3.2 ARFGAP1抑制剂QS11对CSFV复制的影响
        2.3.3 过表达ARFGAP1对CSFV复制的影响
        2.3.3.1 ARFGAP1过表达载体的构建与鉴定
        2.3.3.2 ARFGAP1过表达细胞系的构建和鉴定
        2.3.3.3 过表达ARFGAP1促进CSFV复制
        2.3.4 干扰ARFGAP1对CSFV复制的影响
        2.3.4.1 ARFGAP1干扰载体的构建和鉴定
        2.3.4.2 ARFGAP1慢病毒干扰细胞系的构建
        2.3.4.3 ARFGAP1干扰载体干扰效率的筛选
        2.3.4.4 干扰ARFGAP1抑制CSFV复制
        2.3.5 ARFGAP1对CSFV子代病毒产生的影响
        2.3.6 CSFV感染促进ARFGAP1的表达
        2.4 讨论
        2.5 小结
    第三章 ARFGAP1与CSFV NS5A蛋白的相互作用
        3.1 材料
        3.1.1 细胞、菌株、病毒和质粒
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器设备
        3.2 方法
        3.2.1 载体的构建和鉴定
        3.2.1.1 引物的设计和合成
        3.2.1.2 ARFGAP1和NS5A基因的扩增及纯化
        3.2.1.3 载体和ARFGAP1、NS5A基因的双酶切、连接及转化
        3.2.2 真核重组质粒表达产物的检测
        3.2.2.1 真核重组质粒的转染
        3.2.2.2 真核重组质粒表达产物的Western blot检测
        3.2.3 原核重组质粒表达产物的检测
        3.2.3.1 原核重组质粒的转化和诱导表达
        3.2.3.2 原核重组质粒表达产物的Western blot检测
        3.2.4 Co-IP验证ARFGAP1和NS5A的相互作用
        3.2.5 GST pull-down验怔ARFGAP1和NS5A的相互作用
        3.2.6 激光共聚焦验证ARFGAP1和NS5A的共定位
        3.3 结果
        3.3.1 载体的构建及酶切鉴定
        3.3.1.1 ARFGAP1和NS5A基因的PCR扩增
        3.3.1.2 重组质粒的双酶切鉴定
        3.3.1.3 pDsRed-ARFGAP1和pEGFP-NS5A重组质粒转染效率的检测
        3.3.2 Co-IP验证ARFGAP1与NS5A相互作用
        3.3.3 GST pull-down验证ARFGAP1与NS5A的相互作用
        3.3.4 激光共聚焦验证ARFGAP1与NS5A共定位
        3.4 讨论
        3.5 小结
结论
本论文的创新点
参考文献
附录A 缩略词及中英文对照表(Abbreviation Index)
致谢
个人简介

(4)重庆荣昌家禽坦布苏病毒流行病学调查及分子生物学特征分析(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
第1章 综述
    1.1 TMUV的结构及特性
        1.1.1 TMUV的分类和形态
        1.1.2 TMUV的蛋白特征
        1.1.3 TMUV的理化特性
        1.1.4 TMUV的培养特性
    1.2 TMUV的流行病学
        1.2.1 易感动物
        1.2.2 传染源
        1.2.3 传播途径
    1.3 TMUV的临床症状及病理变化
    1.4 TMUV的诊断方法
        1.4.1 病毒分离鉴定
        1.4.2 血清学诊断
        1.4.3 分子生物学诊断
    1.5 TMUV疫苗研究进展
        1.5.1 TMUV灭活疫苗
        1.5.2 TMUV弱毒活疫苗
    1.6 TMUV的防控措施
第2章 引言
    2.1 研究的目的和意义
    2.2 研究内容和方法
        2.2.1 TMUV血清流行病学调查
        2.2.2 TMUV病原流行病学调查
        2.2.3 TMUV E、NS3 基因分子特征分析
第3章 重庆荣昌家禽TMUV血清流行病学调查
    3.1 试验材料
        3.1.1 样本采集
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
    3.2 试验方法
        3.2.1 被检血清制备
        3.2.2 ELISA法检测TMUV抗体
        3.2.3 数据处理
    3.3 试验结果
        3.3.1 重庆荣昌区鸭、鸡、鹅、鸽血清坦布苏病毒ELISA抗体检测结果
        3.3.2 重庆荣昌区各街道鸭血清坦布苏病毒ELISA抗体检测结果
        3.3.3 重庆荣昌区不同种类鸭血清坦布苏病毒ELISA抗体检测结果
        3.3.4 不同品种肉鸭血清坦布苏病毒ELISA抗体检测结果
        3.3.5 不同日龄肉鸭血清坦布苏病毒ELISA抗体检测结果
    3.4 讨论
    3.5 小结
第4章 重庆荣昌区家禽TMUV病原流行病学调查及分子生物学特征分析
    4.1 试验材料
        4.1.1 样本采集
        4.1.2 试验仪器
        4.1.3 试验试剂
    4.2 试验方法
        4.2.1 TMUV核酸的提取
        4.2.2 cDNA的合成
        4.2.3 PCR检测
        4.2.4 目的片段的回收测序
        4.2.5 数据处理
    4.3 试验结果
        4.3.1 荣昌区家禽TMUV RT-PCR检测结果
        4.3.2 TMUV NS3 基因进化树和同源性分析
        4.3.3 TMUV E基因RT-PCR扩增结果
        4.3.4 TMUVE基因进化树和同源性分析结果
    4.4 讨论与分析
第五章 结论
参考文献
致谢

(5)运用双抗原夹心ELISA法和间接ELISA法检测丙型肝炎病毒抗体结果的一致性比较(论文提纲范文)

中英文缩略词对照表
摘要
ABSTRACT
前言
研究内容与方法
    1.研究材料
        1.1 研究对象
        1.2 标本要求
    2.内容与方法
        2.1 主要仪器与试验原理
        2.2 试剂组成与保存方法
    3.质量控制
    4.统计学分析
    5.技术路线图
结果
讨论
小结
致谢
参考文献
综述
    参考文献
攻读硕士学位期间发表的学位论文
导师评阅表

(6)HCV和HBV的特异性T细胞免疫反应和分子机制研究(论文提纲范文)

中文摘要
ABSTRACT
第一部分 研究内容
    第一章 聚集性献血导致的HCV感染的T细胞免疫研究
        1.1 前言
        1.2 实验材料
        1.2.1 主要实验仪器
        1.2.2 主要实验试剂
        1.3 实验方法
        1.3.1 研究对象
        1.3.2 血样的采集与处理
        1.3.3 抗HCV抗体的定性检测
        1.3.4 临床信息的获得
        1.3.5 HCV基因分型
        1.3.6 HCV RNA足量
        1.3.7 HCV多肽库的设计与合成
        1.3.8 HCV特异性T细胞的刺激及流式分析
        1.3.9 统计分析
        1.4 实验结果
        1.4.1 研究对象的人口学特征
        1.4.2 研究对象的临床特征
        1.4.3 HCV慢性感染者的病毒特征
        1.4.4 HCV病毒清除组与HCV慢性感染组有持续的CD8~+T细胞及CD4~+T细胞应答
        1.4.5 多因子分泌
        1.4.6 HCV特异性T细胞的表型特征
        1.4.7 免疫抑制分子的表达特点
        1.4.8 T细胞免疫与肝功能
        1.5 小结与讨论
    第二章 聚集性献血感染HCV的分子生物学研究
        2.1 前言
        2.2 实验材料
        2.2.1 主要实验仪器
        2.2.2 主要的试剂及耗材
        2.3 实验方法
        2.3.1 HCV RNA提取
        2.3.2 RNA反转录
        2.3.3 全序列引物设计及测序
        2.3.4 序列组装及分析
        2.3.5 二代测序
        2.4 实验结果
        2.4.1 HCV病毒基因组的各片段反转录PCR结果
        2.4.2 HCV病毒5'/3' RACE扩增结果
        2.4.3 全基因序列拼接
        2.4.4 序列同源性分析及进化分析
        2.4.5 二代测序
        2.5 小结与讨论
    第三章 盐桥在HBV特异性多肽呈递和T细胞识别中的作用机制研究
        3.1 前言
        3.2 实验材料
        3.2.1 实验主要仪器
        3.2.2 主要实验耗材及商品试剂
        3.2.3 实验试剂及其配方
        3.2.4 实验动物、菌株、载体
        3.3 实验方法
        3.3.1 实验所用的多肽合成和载体构建
        3.3.2 H-2K~d-HBV多肽免疫小鼠及脾细胞的获得
        3.3.3 ELISPOT实验
        3.3.4 H-2K~d和HLA-B~*4001分子的表达与纯化
        3.3.5 HLA-B*4001-peptide(GETALALLLL)的结晶条件的筛选
        3.3.6 HLA-B*4001 Χ-射线衍射及结构解析
        3.3.7 圆二色谱实验检测H-2K~d-HBVpeptide的热稳定性
        3.3.8 H-2K~d-HBV peptide四聚体的制备及流式染色
        3.4 实验结果
        3.4.1 H-2K~d分子和HLA-B~*4001-分子的蛋白纯化
        3.4.2 探究H-2K~d/HLA-B~*4001野生型/突变体与多肽的结合能力
        3.4.3 探究H-2-K~d野生型及突变体结合多肽识别TCR
        3.4.4 H-2K~d和HLA-B~*4001形成的两种不同的盐桥
        3.4.5 盐桥对MHCI和结合肽的结构构象的影响
        3.4.6 潜在盐桥广泛存在不同脊椎动物中
        3.5 讨论
第二部分 文献综述
    第四章 HCV病毒及细胞免疫概述
        4.1 HCV病毒的流行病学及临床
        4.1.1 HCV的流行
        4.1.2 HCV的临床表现
        4.1.3 HCV病毒的检测和实验室诊断
        4.1.4 HCV的防控及治疗
        4.2 HCV病毒的基本特征
        4.2.1 HCV病毒的形态特征
        4.2.2 HCV病毒的基因组成及全基因组测序
        4.2.3 HCV病毒的生活周期
        4.2.4 HCV病毒的传播及变异
        4.3 HCV病毒感染的免疫反应特征
        4.3.1 血清学反应
        4.3.2 T细胞免疫
    第五章 MHC分子结构免疫学概述
        5.1 MHC的概念
        5.2 MHC的抗原呈递及T细胞识别
        5.2.1 MHCⅠ类途径
        5.2.2 MHCⅡ类途径
        5.2.3 外源抗原的MHCⅠ类途径交叉呈递
        5.3 MHC及相关分子的结构特征
        5.3.1 MHCⅠ类分子的结构特征
        5.3.2 MHCⅡ类分子的结构
        5.3.3 非经典的MHCⅠ类分子结构
        5.4 MHC分子结构在T细胞免疫研究中的应用
        5.4.1 MHC结构研究对于MHC分子分类的影响-HLA超级型及其意义
        5.4.2 MHC分子对TCR识别的限制性
        5.4.3 MHC交叉呈递和TCR交叉识别的结构基础
全文总结
参考文献
附录1 缩略表
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文
致谢

(7)坦布苏病毒NS3蛋白互作宿主蛋白的筛选、验证(论文提纲范文)

符号说明
中文摘要
ABSTRACT
1 前言
    1.1 坦布苏病毒感染研究进展
        1.1.1 坦布苏病毒病原学研究
        1.1.2 坦布苏病毒感染流行病学研究
        1.1.3 坦布苏病毒感染临床症状及病理变化
        1.1.4 坦布苏病毒感染防治措施
    1.2 蛋白质相互作用技术简介
        1.2.1 蛋白互作的研究意义
        1.2.2 酵母双杂交技术研究蛋白互作
        1.2.4 激光共聚焦技术在蛋白定位中的应用
        1.2.5 GST pull-down技术在蛋白互作中的应用
    1.3 本研究的目的及意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 毒株、菌株、载体及细胞
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要溶液的配制
        2.1.4 主要仪器设备
    2.2 方法
        2.2.1 酵母双杂交系统互作宿主蛋白的筛选
        2.2.2 酵母双杂交回返验证
        2.2.3 GST pull-down互作体外验证
        2.2.4 激光共聚焦互作蛋白共定位
        2.2.5 荧光定量PCR和 Western blot分析P38/MAPK信号通路
3 结果
    3.1 酵母双杂交试验
        3.1.1 TMUV NS3 目的基因扩增结果
        3.1.2 诱饵质粒p GBKT7-NS3 双酶切验证结果
        3.1.3 诱饵质粒转化Y2H酵母感受态细胞结果
        3.1.4 诱饵蛋白NS3 毒性及自激活检测结果
        3.1.5 鸭胚成纤维细胞cDNA文库滴度测定结果
        3.1.6 诱饵酵母菌株与cDNA文库酵母菌株融合培养结果
        3.1.7 杂交效率计算结果
        3.1.8 阳性质粒的鉴定和分析结果
    3.2 酵母双杂交回返体内验证试验
        3.2.1 鸭源和人源PRDX1 基因扩增结果
        3.2.2 猎物质粒p GADT7-PRDX1 的双酶切鉴定结果
        3.2.3 TMUV NS3 结构域S7/DEXDc/HELICc基因扩增结果
        3.2.4 结构域诱饵质粒pGBKT7-S7/DEXDc/HELICc酶切鉴定结果
        3.2.5 猎物与诱饵质粒共转Y2H酵母回返验证结果
    3.3 GST pull-down体外验证试验
        3.3.1 NS3 结构域HELICc基因扩增结果
        3.3.2 GST标签原核表达载体pGEX-6p-1-HELICc酶切鉴定结果
        3.3.3 GST标签融合蛋白HELICc原核表达及Westen blot验证结果
        3.3.4 鸭源PRDX1 基因扩增结果
        3.3.5 GFP标签真核表达载体pEGFP-Duck PRDX1 酶切鉴定结果
        3.3.6 GFP标签融合蛋白真核表达及Western blot验证结果
        3.3.7 GST pull-down体外验证HELICc和 PRDX1 互作结果
    3.4 HELICc和 PRDX1 激光共聚焦定位试验
        3.4.1 HELICc基因扩增结果
        3.4.2 HA标签真核表达载体pCAGGS-HELICc酶切鉴定结果
        3.4.3 HA标签融合蛋白真核表达及Western blot验证结果
        3.4.4 HELICc和 PRDX1 激光共聚焦定位结果
    3.5 信号通路P38/MAPK荧光定量PCR检测
    3.6 信号通路中P38 蛋白磷酸化水平检测
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表论文情况

(8)丙型肝炎病毒感染中异常表达的肝细胞糖复合物的相关研究(论文提纲范文)

中文摘要
ABSTRACT
引言
第一部分 HCV感染过程中异常表达的糖苷和糖蛋白的鉴定
    一、实验材料
    二、主要仪器
    三、实验方法
    四、实验结果
        (一) 确认HCVcc成功感染Huh7.5.1细胞
        (二) Huh7.5.1细胞感染HCVcc前后N-糖链的质谱分析
        (三) 凝集素芯片技术解析HCV感染过程中糖苷的变化以及结果验证
        (四) 凝集素LCA富集差异表达的糖蛋白以及候选糖蛋白的筛选与鉴定
        (五) Huh7.5.1细胞感染HCVcc后岩藻糖转移酶家族表达谱的变化
        (六) FUT8参与对HSP90B1和ANXA2蛋白糖基化修饰的调节
    讨论
第二部分 FUT8在HCV感染过程中异常表达及其作用机制研究
    一、实验材料
    二、主要仪器
    三、实验方法
    四、实验结果
        (一) HCVcc感染增强FUT8的催化活性
        (二) FUT8特异性shRNA干扰质粒的构建、鉴定及表达
        (三) FUT8促进HCV的复制
        (四) FUT8在HCV感染过程中参与的信号通路的研究
        (五) FUT8通过激活PI3K/AKT信号通路促进细胞的增殖和病毒的复制
        (六) FUT8对抗病毒药物IFNα-2b的影响
    讨论
第三部分 HCV感染过程中异常表达的TNNT1及其相关性研究
    一、实验材料
    二、主要仪器
    三、实验方法
    四、实验结果
        (一) HCVcc感染Huh7.5.1细胞后诱导细胞mRNA表达谱改变
        (二) Huh7.5.1细胞感染HCVcc后mRNA芯片结果验证
        (三) TNNT1特异性shRNA干扰质粒的构建、鉴定及表达
        (四) TNNT1过表达质粒的构建、鉴定及表达
        (五) TNNT1促进HCV的复制
        (六) TNNT1促进HCV感染细胞的增殖和细胞周期相关基因的表达
        (七) TNNT1与HCVcc感染Huh7.5.1细胞的MTA2结合
    讨论
全文总结
参考文献
综述
    参考文献
攻读博士学位期间已发表的科研成果
后记

(9)猪瘟病毒非结构蛋白p7及其对感染性病毒产生的调节(论文提纲范文)

摘要
Abstract
第一章 猪瘟病毒分子生物学
    1.1 概述
    1.2 猪瘟病毒及其基因组结构与功能
        1.2.1 病毒的分类和病毒粒子
        1.2.2 猪瘟病毒基因组结构
        1.2.3 猪瘟病毒的生命周期
        1.2.4 猪瘟病毒编码蛋白的结构与功能
        1.2.5 猪瘟病毒基因组非编码区
    1.3 p7蛋白
        1.3.1 丙型肝炎病毒p7蛋白的结构及功能
        1.3.2 瘟病毒p7蛋白的结构与功能
    1.4 猪瘟病毒的生物学特性
        1.4.1 猪瘟病毒的增殖
        1.4.2 猪瘟病毒感染与免疫逃逸
        1.4.3 CSFV毒力的分子基础
    1.5 本论文研究目的和意义
第二章 实验材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 病毒与细胞
        2.1.2 菌种和克隆载体
        2.1.3 工具酶、常规试剂、抗体
        2.1.4 常用溶液的配制
        2.1.5 实验仪器及耗材
    2.2 实验方法
        2.2.1 目的DNA的PCR扩增
        2.2.2 琼脂糖凝胶电泳
        2.2.3 DNA目的片段回收
        2.2.4 目的片段与载体的酶切与连接
        2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
        2.2.6 质粒或酶连接产物的转化
        2.2.7 阳性菌落的鉴定与质粒的提取
        2.2.8 细胞复苏、传代和冻存
        2.2.9 质粒或RNA转染细胞:
        2.2.10 间接免疫荧光(indirect immunofluorescence staining,IF)实验和共聚焦(Confocal)实验
        2.2.11 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹实验(Western blot)
        2.2.12 免疫共沉淀实验(Co-immunoprecipitation assays,Co-IP)
        2.2.13 病毒基因组体外转录
        2.2.14 病毒扩增
        2.2.15 基因组RNA提取
        2.2.16 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
        2.2.17 病毒滴度测定
        2.2.18 实时定量PCR (Quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR)
第三章 猪瘟病毒编码蛋白E2、p7和NS2的相互作用
    3.1 猪瘟病毒E2、p7、NS2真核表达质粒的构建与鉴定
    3.2 非结构蛋白p7与NS2和E2的相互作用
    3.3 介导p7和NS2相互作用的NS2区域
    3.4 介导p7和NS2相互作用的p7区域
    3.5 E2p7前体蛋白和NS2的相互作用
    3.6 讨论
第四章 非结构蛋白p7在调节CSFV基因组复制和感染性病毒产生中的作用
    4.1 基于反向遗传操作构建CSFV突变体cDNA克隆
        4.1.1 感染性克隆pSM/Ap7~(15-51)、pSM/E2/IRES和pSM/E2~(ASG/NSR)的构建
        4.1.2 基于CSFV单顺反子感染性cDNA克隆的p7突变体构建
        4.1.3 基于CSFV双顺反子感染性cDNA克隆的p7突变体构建
    4.2 重组病毒拯救
    4.3 p7蛋白位点突变对p7和NS2相互作用的影响
    4.4 p7氨基酸突变对病毒基因组复制的影响
    4.5 讨论
研究总结
参考文献
博士期间发表的成果
致谢

(10)中国献血员人群丙型肝炎病毒“窗口期”感染分析(论文提纲范文)

缩写词表
中文摘要
Abstract
第一部分 中国自然献血员人群丙型肝炎病毒"窗口期"感染检测数据分析
    前言
    实验材料与方法
        1. 试剂
        2. 样品
        3. 主要仪器设备
        4. 检测与分析
        5. 实验工作流程图
    实验结果
        1. HCV抗体检测
        2. HCV游离核心抗原检测
        3. HCV核心总抗原检测
        4. HCVRNA检测及基因型别分析
    讨论
    结论
第二部分 中国献血员中高危人群丙型肝炎病毒"窗口期"感染流行病学调查与分析
    前言
    实验材料与方法
        1. 试剂
        2. 样品
        3. 仪器设备
    实验结果
        1. 对收集的廊坊地区献血员进行人群分布情况的流行病学调查
        2. 所收集样本HCV抗体检测
        3. HCV游离核心抗原检测
        4. 所收集样本总抗原检测
        5. HCV RNA检测
        6. HCV RNA阳性血清基因型别检测
        7. 不同HCV基因型别样品的病毒载量和ALT检测以及基因型别与它们的关系研究
        8. 不同HCV基因型别样品对应HCV基因不同区域抗体的检测
    讨论
    结论
    附件:原始数据
参考文献
综述
    第一部分:HCV基因结构与功能分析
    第二部分:HCV疫苗的研制
    第三部分:细胞免疫在HCV预防和治疗中的作用
    第四部分:HCV体液免疫疫苗的研制
简历
发表文章
致谢

四、丙型肝炎病毒NS3区不同末端基因的表达及产物抗原性分析(论文参考文献)

  • [1]牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS4B抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制研究[D]. 岳山. 黑龙江八一农垦大学, 2021(01)
  • [2]BVDV感染MDBK细胞转录组学分析及牛Mx1蛋白对BVDV复制的影响[D]. 刘存. 西北农林科技大学, 2020(02)
  • [3]宿主ARFGAP1对CSFV复制的影响及与NS5A的互作研究[D]. 靳明星. 西北农林科技大学, 2020(02)
  • [4]重庆荣昌家禽坦布苏病毒流行病学调查及分子生物学特征分析[D]. 滕永泰. 西南大学, 2020(01)
  • [5]运用双抗原夹心ELISA法和间接ELISA法检测丙型肝炎病毒抗体结果的一致性比较[D]. 秦亚娟. 新疆医科大学, 2020(07)
  • [6]HCV和HBV的特异性T细胞免疫反应和分子机制研究[D]. 纪伟. 中国疾病预防控制中心, 2019(12)
  • [7]坦布苏病毒NS3蛋白互作宿主蛋白的筛选、验证[D]. 王雅雯. 山东农业大学, 2019(01)
  • [8]丙型肝炎病毒感染中异常表达的肝细胞糖复合物的相关研究[D]. 向田. 武汉大学, 2017(06)
  • [9]猪瘟病毒非结构蛋白p7及其对感染性病毒产生的调节[D]. 赵程. 武汉大学, 2017(01)
  • [10]中国献血员人群丙型肝炎病毒“窗口期”感染分析[D]. 杨振. 中国协和医科大学, 2009(04)

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丙型肝炎病毒NS3区不同末端基因的表达及产物抗原性分析
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