一、40种化学治疗药物使用说明书的分析及临床指导（论文文献综述）
孙一涵[1]（2021）在《石斛提取物毛兰素对人结直肠癌细胞的干预作用及机制研究》文中研究说明目的:结直肠癌（CRC）是一类临床上较为常见的恶性肿瘤。近些年来,其发病率显着提升并已跃升为全球恶性肿瘤第三位。在我国,该病的发病率亦较为显着,同时,其较广泛的危害性严重影响着我国人民的生产生活。目前,对于本病的治疗仍以外科手术为主,并辅以化学治疗,此外亦有生物免疫以及分子靶向等治疗方法。然而,由于免疫、靶向疗法的不甚成熟以及外科手术、化学治疗较高的复发率和诸多的不良反应,使得新型辅助疗法的开发和使用较为必要。中医药疗法具有毒副作用较低、患者依从性与耐受性良好等综合优势。其在本病的应用具体体现在以联合结直肠癌切除/根治手术治疗、联合化学药物治疗以及针对并发症状,减轻患者不良反应等方面。在众多关于恶性肿瘤的治法中,养阴生津法具有悠远的应用历史以及较高的临床地位。因大肠与肺相表里,共同调节体内阴津的输布,故大肠癌发生发展对于阴津的影响更为显着,同时,肠道内阴津的输布失调亦可为肿瘤的发生发展提供重要条件。养阴生津法不但可对肿瘤的生长起到抑制作用,亦可改善手术、放化疗所造成的机体津亏以及疾病易进展的病理状态。石斛属中医学“养阴生津法”的常用药物之一,历代医家总结出其最主要的作用在于“养阴生津”,并列其为“养阴圣品”。对于大肠癌的治疗,无论是在养阴生津法、清热生津法还是益气养阴法中,石斛均可作为主要的中药配伍。毛兰素（Erianin）作为中药石斛发挥功效的主要活性成分,具有抗血管生成、杀菌以及灭活病毒的多重生物学作用。近年来随着对于本单体实验研究的增加,发现了其在抗癌方面具有较高的价值以及前景。现有的资料表明,在抗癌方面,毛兰素具有抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡、防止转移和抑制血管生成等综合作用。本实验的主要目的为探究毛兰素对SW480、HCT116两种结直肠癌细胞生长增殖、周期、凋亡的调控作用及其相关机制,同时亦进行了免疫缺陷小鼠移植瘤实验以评估其在生物体内的作用。主要研究意义是在中医学“养阴生津法”的指导之下,通过对中药石斛提取物单体抗肿瘤的机制研究,为结直肠癌的治疗开拓一种全新、疗效显着、无毒副作用且经济、便捷的中医药辅助疗法。方法与结果:为探究本药物对于肠癌细胞以及人正常结直肠上皮细胞增殖的影响,应用不同浓度的毛兰素处理SW480、HCT116、NCM460三种细胞,并在不同的时间节点采用CCK8法测定细胞活性,应用集落形成实验评估肠癌细胞的长期生存能力。结果显示,高浓度、长时间的毛兰素的刺激作用可明显抑制肿瘤细胞增殖并减弱其活性（P<0.05）。此外,NEM460细胞在药物刺激后的增殖活性未发生明显改变。为探究本药物对于肠癌细胞周期的调控作用,应用不同浓度的毛兰素处理肿瘤细胞48小时,在流式细胞仪上观测各组细胞的周期分布情况。结果显示,毛兰素组在经药物刺激后,G2/M期的细胞占比出现了不同程度的提升（P<0.05）,相反,G0/G1以及S期细胞占比随药物浓度增高呈现下降趋势（P<0.05）。为探究本药物对于肠癌细胞凋亡的影响,我们应用荧光法测定Caspase3/7活性、免疫印迹法测定剪切PARP以及Bcl-2家族蛋白的表达情况,并应用Annexin V-FITC流式细胞术以及DAPI染色法直接观测毛兰素对细胞凋亡的影响。结果显示,高浓度毛兰素显着提升了肿瘤细胞Caspase3/7的活性以及裂解PARP、Bak、Bax的蛋白含量,并减少了Bcl-2以及Bcl-xl的表达（P<0.05）。此外,染色实验显示随着药物浓度的增加,死亡细胞数占比逐渐提升,提示毛兰素显着提升了肠癌细胞凋亡率。为探究本药物对于Wnt/β-catenin信号通路的作用影响及相关机制,我们进行了对β-catenin磷酸化、核浆易位、转录活性、热稳定性、靶基因表达情况以及与信号通路阻断剂WNT974的联合效应研究。结果显示,毛兰素可在不改变β-catenin磷酸化水平的情况下显着增加细胞浆内、减少细胞核内的β-catenin表达,同时亦降低了β-catenin对其下游T细胞因子的转录活性,提升了β-catenin的热稳定性（P<0.05）。此外,毛兰素显着降低了两种靶基因C-myc、Cyclin D1的m RNA水平以及其蛋白表达（P<0.05）,且在与WNT974联合应用后,该效应未发生显着变化。为探究本药物对于CD47的表达以及巨噬细胞吞噬效率的影响,我们应用QRT-PCR法、免疫印迹法以及流式细胞术观测CD47的表达情况,并采用离体巨噬细胞实验测定其对于两种肠癌细胞的吞噬效率。结果显示,高浓度的毛兰素减少了肿瘤细胞表面CD47的分布水平以及CD47的m RNA水平、蛋白含量（P<0.05）。同时,两种细胞被毛兰素处理后,巨噬细胞对其吞噬效率显着提升（P<0.05）。在体内实验中,我们予NOD/SCID免疫缺陷小鼠皮下接种SW480肿瘤细胞的方式构建免疫缺陷小鼠移植瘤模型,并予50mg/kg毛兰素进行腹腔内注射,同时测定相关指标。结果显示,毛兰素显着减小了移植瘤的肿瘤体积以及质量,降低了移植瘤组织Bcl-2并增加了Bax的表达,且对β-catenin具有明显的入核阻滞作用。此外,其亦降低了移植瘤组织内c-Myc、CD47的蛋白含量（P<0.05）。结论:毛兰素对于SW480、HCT116细胞具有抑制增殖,促进凋亡,阻滞Wnt/β-catenin信号通路的作用,减少CD47表达量的同时提升了巨噬细胞对肠癌细胞吞噬效率,展现出了显着的抗肿瘤疗效,为结直肠恶性肿瘤提供了全新的研究靶点与辅助治疗思路,亦提示我们中药石斛以及中医学养阴生津法在大肠癌治疗中的重要效用价值。
郭文佳[2]（2021）在《食管鳞癌和贲门腺癌中拷贝数扩增基因的筛选及功能研究》文中研究表明背景和目的:食管鳞癌起源于食管鳞状黏膜上皮,是常见的恶性肿瘤,在我国食管鳞癌的发生率和死亡率都居世界前列。我们课题组已有来自高发区的食管鳞癌样本的全基因组测序数据,通过数据分析鉴定出了包含1,591个拷贝数扩增基因23个拷贝数扩增区段。通过整合分析94例食管鳞癌全基因组和转录组数据,发现食管鳞癌组织中有149个拷贝数扩增的基因存在异常高表达,这些基因可能与食管鳞癌有着密切的关系。因此,本课题的研究目标为利用高通量功能筛选技术,从已知的149个候选基因中筛选出在食管鳞癌中拷贝数扩增且具有功能的关键基因,运用分子生物学、细胞生物学等实验策略,探讨该目的基因在食管鳞癌中发挥怎样的生物学作用以及具体的作用机制。方法:从高通量技术筛选出的候选基因中挑选目的基因VA V2,通过分析转录组测序数据,从mRNA水平上分析目的基因VA V2在食管鳞癌组织以及癌旁组织中的表达差异;通过免疫组化的方法,从蛋白水平上检测目的基因在食管鳞癌组织以及癌旁组织中的表达情况,并且比较mRNA和蛋白水平是否一致。在食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE150中构建稳定的VAV2敲除和过表达细胞模型。接着通过一系列体外和体内的实验,我们探索VAV2表达改变是否对对食管鳞癌细胞的增殖和侵袭转移能力产生影响。具体而言,我们通过细胞学和分子生物学实验（细胞活力检测、克隆形成、细胞侵袭/迁移、划痕、免疫印迹等）,探究目的基因VAV2影响食管鳞癌细胞增殖和转移的作用机制。结果:通过高通量的功能筛选,我们发现VAV2基因是一个和食管鳞癌增殖、转移均相关的基因。在食管鳞癌细胞系中敲除VAV2抑制其表达,能降显着降低食管鳞癌细胞的增殖和迁移、侵袭能力;而过表达VAV2后则能显着促进食管鳞癌细胞的增殖和迁移、侵袭能力以及在裸鼠皮下的成瘤能力。结论:我们在食管鳞癌组织和细胞中发现VAV2拷贝数扩增且高表达,能够促进食管鳞癌细胞的增殖和侵袭转移能力,是首次在食管鳞癌中发现VAV2的促癌作用。提示深入了解VAV2在食管鳞癌发生发展过程中的生物学机制对食管鳞癌的早期诊断可能具有重要意义。
翟韵怡[3]（2021）在《养阴解毒方联合化疗对NSCLC患者血清中β3GnT8、CD147表达影响的临床研究》文中提出目的:本研究旨在“癌毒致病”理论指导下,以非小细胞肺癌（NSCLC）患者为研究对象,分析NSCLC患者血清中β3GnT8、CD147表达与复发转移相关因素的联系,通过组内对照及组间对照,观察养阴解毒方联合化疗对阴虚毒热证患者血清中β3GnT8、CD147及其他肿瘤标志物表达、免疫性指标、中医症状积分、体重改变的影响,探究养阴解毒方的作用机理。方法:本次研究收集2019年10月至2021年01月在南京中医药大学附属苏州市中医医院肿瘤科、常熟市第二人民医院肿瘤科、苏州市第九人民医院肿瘤科住院NSCLC患者90例,40例健康志愿者,记录患者的一般资料（年龄、性别、原发部位、病理类型、转移情况）,血清中β3GnT8、CD147表达。后将其中符合纳排标准的50例病例列为实验研究对象,随机分为对照组和观察组,观察过程中,观察组3例、对照组12例因资料缺失、严重不良事件无法按时完成研究所需疗程等因素予以剔除,最终完成观察全程病例共35例,观察组22例,对照组13例。对照组依据NCCN非小细胞肺癌临床实践指南（2019.7版）原则予以化疗方案,观察组在化疗基础上联合使用养阴解毒方。均以3周为一个疗程,连续用药2个疗程。2个疗程观察结束后比较各组治疗前后血清中β3GnT8、CD147表达、肿瘤标志物CEA、CA125、免疫细胞CD4+、CD8+计数、CD4+/CD8+比值、中医证候疗效评分、体重变化、血常规、尿常规、肝肾功能等相关安全性指标,运用统计软件进行数据分析,归纳结论。结果:血清中β3GnT8、CD147的表达水平在健康人群与罹患NSCLC的患者中有差异,NSLCL患者的表达水平明显高于健康人（P<0.01）,且伴转移患者的两个指标表达均较无转移者更高（P<0.05）。阴虚毒热证的研究病历中,相较于单纯运用化疗的对照组,养阴解毒方与化疗联合使用的观察组在多个方面都展现出治疗优势,两组均可以降低血清中β3GnT8、CD147表达,且中西医结合的观察组效果明显优于对照组（P<0.01）。但在肿瘤标志物CEA、CA125的数值改变上,两组比较未表现出统计学差异（P>0.05）。治疗后的免疫细胞方面,对照组免疫功能下降,以CD4+计数和CD4+/CD8+比值的改变最为明显（P<0.01）,而观察组免疫功能各项指标变化显着（P<0.01）,免疫功能提升。中医证候积分的改变方面,观察组治疗后的分值较前明显下降（P<0.01）,而对照组数值改变无统计学意义（P>0.05）。从体重改变的角度看,无论是组内比较还是组间比较,均无统计学意义（P>0.05）。血尿常规、肝肾功能等安全性指标方面,除对照组治疗后血常规中白细胞及血小板计数明显下降（P<0.01）、观察组治疗后谷丙转氨酶较前升高以外（P<0.05）,余各组各项安全性指标治疗前后差异无统计学意义（P>0.05）,而观察组的总不良反应发生率低于对照组,显示中医药可以减少化疗副反应,且有减毒增效的作用。结论:（1）NSCLC患者血清中β3GnT8、CD147表达高于健康人群,且与疾病转移情况相关,有转移者表达更高;（2）养阴解毒方与化学治疗联合使用可以降低血清中β3GnT8、CD147表达,改善中医临床症状,且效果均较单纯化疗组更为显着;（3）与单纯运用化学治疗手段相比,养阴解毒方联合化学治疗可以改善NSCLC患者免疫功能,安全性也较好。
吴鸿帅[4]（2020）在《新型pH响应的含金属纳米平台用于肿瘤的安全治疗》文中指出癌症（恶性肿瘤）主要是由于基因的突变以及正常细胞的无序生长所引起的。由于肿瘤细胞复杂的运转机制,癌症已经成为全世界人类死亡的主导因素之一。因此,癌症的诊断与治疗在生命科学和临床研究领域受到了广泛的关注。过去几十年里,癌症治疗在许多方面已经取得了重要的进展,但不足的治疗效率仍然是一个严重的问题。为此,各种各样多功能的纳米平台作为一种新型的肿瘤治疗方式被大力地开发与研究。具有良好生物相容性可激活的纳米系统能够通过响应内部或外部的刺激如pH和光等实现智能的肿瘤消融。本文成功构建了三种新型pH响应的含金属纳米平台,并研究了其在癌症安全治疗中的潜在应用。主要内容如下所示:1.合理地整合化学疗法和羟基自由基（·OH）介导的化学动力学疗法（CDT）对癌症治疗具有很大的意义。在此,本文使用一个简单的还原法合成了生物相容的多孔核壳氧化亚铜纳米晶（Cu2O-PEG NCs）,通过其发生的类芬顿（Fenton）反应催化双氧水（H2O2）形成毒性的·OH,并用其成功负载阿霉素（DOX）进行化学和化学动力学协同疗法。在Cu2O外部原位形成的的高密度亲水壳层聚乙二醇（PEG）可以显着地改善纳米晶的稳定性和相容性。Cu2O-PEG NCs的多孔结构赋予了其有效的DOX装载（DOX@Cu2O-PEG NCs）与递送能力。不仅如此,DOX@Cu2O-PEG NCs还可以作为极好的纳米催化剂通过酸敏感的方式释放类Fenton的Cu+用于·OH的催化产生,并进行活性氧（ROS）相关的CDT。由于Cu2O-PEG NCs对酸性pH的响应分解,负载的DOX快速释放不仅可以获得化学疗法,还能够通过提升细胞内的H2O2含量来增强CDT。小鼠经过尾静脉注射后,Cu2O-PEG NCs可以在外部亲水的PEG壳层作用下有效地富集在肿瘤区域。体外和体内实验表明了DOX@Cu2O-PEG NCs出色的治疗效力和高的生物相容性。2.在上述工作基础之上,本文进一步构建了一个可激活的自催化纳米反应器（HT@GOx-DMONs）,首次将Cu2+基的金属有机框架（MOFs）修饰在负载了葡萄糖氧化酶（GOx）的大孔有机硅纳米粒子（DMONs）上,用于自强化类Fenton的CDT。构建的纳米反应器可以通过生长的羧酸MOFs（HKUST-1）防止其在中性条件中Cu2+和GOx的提前泄露,但可在酸性核内体和溶酶体环境中快速地释放药物。随后,纳米反应器通过pH激活Cu+介导的类Fenton反应产生高毒性的·OH。与此同时,Cu2+诱导的谷胱甘肽（GSH）消耗和GOx催化的H2O2自给以酸激活的途径提高·OH的生成。自强化·OH介导的CDT展现了卓越的体外毒性和体内抗肿瘤能力,并且不会产生明显的系统毒性。3.在之前的工作中,本文通过构建智能的纳米平台实现了肿瘤的生长抑制,但所构建的纳米药物缺乏有效的主动靶向能力。因此,本文将Fe3+基的MOFs原位修饰在聚乙烯吡络烷酮（PVP）稳定的聚多巴胺纳米粒子（PDANPs）上,随后通过透明质酸（HA）包覆封装GOx,构建成一个智能的CD44靶向的核壳纳米药物（HG-MIL@PDANPs）,用于肿瘤特异性的光热和化学动力学协同疗法。纳米药物内部的PDANPs具有优异的近红外（NIR）光诱发的光热性质,可以通过产生的局部高热消融肿瘤。此外,纳米药物的外部壳层会发生pH触发NIR光强化的分解,从而快速地释放出Fe3+和GOx。随后,Fe3+参与的GSH消耗以及GOx催化的酸度增强和H2O2自给能够通过改善Fenton反应活力来增强·OH的生成。而HA配体的引入不仅可以加速CD44过表达肿瘤细胞对纳米药物的摄取,还能够延长纳米药物在血液的循环半衰期。基于此,纳米药物呈现了出色的肿瘤积聚能力。除了可以有效地抑制肿瘤细胞生长,构建的纳米药物还能够在不引起毒副作用的前体下,利用定点可控的PTT结合强化的CDT实现出色的肿瘤消融。
王君宇[5]（2020）在《鹰嘴豆芽素A基于PI3K/AKT信号通路缓解PM10致急性肺细胞损伤机制研究》文中进行了进一步梳理流行病学研究表明,大气中PM10浓度升高与人群心肺疾病风险增加密切相关。PM10携带的大量有毒有害物质,极易通过上呼吸道纤毛和粘膜物理阻隔,在支气管和肺泡中直接加深和沉积,引发或加重各类心肺系统疾病,严重影响人体健康。鹰嘴豆芽素A（Biochanin A,BCA）作为一种豆科植物中的天然异黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗菌等多种生物活性,在干预PM10诱导的急性肺细胞损伤中的作用越来越受到关注,但其分子作用机制尚不完全清楚。本论文采集天津市大气PM10颗粒物并分析其粒径、成分、形态,结果表明PM10颗粒物的当量直径集中在10μm左右,总体动力学直径在0～100μm范围内。PM10来源广泛,生物、化学成分组成较为复杂,主要由可溶性盐离子(F-、Cl-、NO2-、SO42-、NO3-、PO4-)、重金属以及放射性等元素、有机物（芳香烃及其含氧衍生物、支链/正构烷烃、硅烷衍生物、酮类等）和生物组分组成。通过使用美国动物研究数据库（Tox Ref DB）、体外高通量筛选数据库（Tox Cast DB）和文献检索-生物信息学系统分析明确了PM10中致毒成分与呼吸系统损伤/潜在的关键分子靶点之间的显着相关性;揭示了PM10中致毒成分和预防与治疗PM10致呼吸系统损伤的信号途径及分子靶点:钙离子、丝裂原活化蛋白激酶、磷酸肌醇信号通路为PM10致呼吸系统损伤的主要途径,提示这些通路中的核心蛋白有极大可能性可作为预防与治疗PM10所致损伤的分子靶点。以BCA为研究对象,基于人源支气管正常上皮细胞,构建PM10暴露-BCA保护作用体外细胞模型,通过测定炎症反应、氧化应激等相关生理指标发现,PM10极显着诱发胞内ROS激增,降低胞内CAT水平,引发胞内LDH外流以及脂质过氧化作用现象,极显着上调炎症因子IL-6,IL-8,TNFα基因表达及其释放,促进炎症介质NO的合成及其对应的关键合成酶基因i NOS的转录,而BCA（5、10、20、40μM）和PI3K/AKT靶蛋白抑制剂LY294002（10μM）均可有效干预PM10引起的上述变化,表现出良好的抗炎抗氧化活性。此外,围绕PI3K/AKT信号通路,利用Western Blot和q RT-PCR等分子生物学手段初步揭示了BCA在缓解PM10致急性肺细胞损伤中的调节PI3K/AKT进程作用机制:PM10暴露会极显着影响到胞内生物标记蛋白、PI3K/AKT、DNA碱基修复通路的正常运作,而BCA则可能通过靶向作用于PI3K蛋白在细胞内膜的活化过程,干预XRCC1和PTEN蛋白对PI3K/AKT的调控及PI3K对下游AKT蛋白表达及其磷酸化,进而对下游信号分子产生一定程度的调控以发挥抗损伤功能活性。
张玉林[6]（2020）在《人羊膜上皮细胞修复大鼠卵巢功能不全的实验研究》文中研究指明每年全球范围内有多达百万女性罹患癌症,其中大约10%的女性患者在育龄期。化学治疗的应用使癌症患者的生存率明显提高,约90%年轻的早期癌症患者在治疗后可以存活,但是化学治疗引起的远期并发症的风险却不可忽视。其中,最突出的远期影响包括因为化学治疗所引起的原发性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency,POI）或卵巢早衰（premature ovarian failure,POF）所致的早绝经和不育,极大地影响育龄期患者的生存质量。因此,在不妨碍癌症治疗的原则上,提高此类患者的生存质量、保护卵巢功能和生育力已经成为临床上医生与患者共同面临的难题。基础实验及临床病例表明,在杀灭癌症细胞的同时,许多化学治疗药物可以不同程度地损伤卵巢功能、使卵巢结构紊乱、卵巢纤维化明显、影响卵泡的启动、生长发育及成熟过程,但其具体机制仍不十分清楚。目前,临床上预防或者治疗化疗相关卵巢功能不全主要的方法有:促性腺激素释放激素类似物治疗、性激素替代治疗及生育力冷冻保存技术。促性腺激素释放激素类似物治疗预防化疗引起的卵巢功能不全目前只在乳腺癌中观察到有一定效果;性激素替代治疗只能改善患者的围绝经期症状,不能改善卵巢功能及生育能力;而生育力冷冻保存技术受到患者年龄、身体状态及婚姻状态等的制约,因此每种方法都有其局限性,尚不能广泛应用于临床。随着再生医学的兴起及发展,干细胞已经在多种疾病中证实有组织修复及组织再生的作用。目前,多个研究表明,干细胞移植在改善卵巢功能、修复卵巢组织结构及促进生育力方面具有一定的作用,但其机制仍不清楚。近年来,人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cells,h AECs）的发现及研究为再生医学领域指引了新的研究方向。由于羊膜为医疗废物、来源丰富、获取简单、无道德伦理的制约,且h AECs具有一定干细胞特性、免疫原性低且未发现致瘤性,因此h AECs在再生医学领域具有广阔的应用前景,有望成为修复化疗所致卵巢功能不全的新方法。据报道,h AECs可以分泌多种细胞因子,这些细胞因子可能参与增殖、免疫调节、细胞凋亡和血管生成过程,并可以通过静脉移植、原位注射或腹腔注射h AECs或h AECs条件培养基改善卵巢功能,但其具体机制仍不十分清楚。第一部分 hAECs的原代细胞提取及生物学特性目的提取h AECs并培养、鉴定,为后续实验提供细胞移植的种子细胞。方法征得孕妇及家属同意并书面签署知情同意书后,收集经剖腹产分娩的羊膜组织,采用胰酶消化法获取h AECs;通过观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物的表达,对分离培养的h AECs进行鉴定;通过细胞免疫荧光检测h AECs表达卵泡刺激素受体（Follicle-stimulating hormone receptor,FSHR）的情况。结果分离纯化的h AECs呈铺路石样,细胞大小及形态均一,呈圆形或多角形,并呈集落样生长;4代后细胞渐呈梭形,细胞增殖减慢;h AECs高表达干细胞标志物（SSEA4,Nanog）、上皮细胞标志物（CD324,CD326）;而低表达间充质细胞标志物（CD105）、造血干细胞标志物（CD34、CD45）和免疫学标志物（HLA-DR）;h AECs可以表达颗粒细胞的标志物FSHR。结论h AECs来源丰富,具有干细胞及上皮细胞特性,低免疫原性,无成瘤性,在干细胞治疗领域中具有广阔的应用前景。第二部分 环磷酰胺诱导大鼠卵巢损伤模型的建立目的建立稳定的环磷酰胺所致大鼠卵巢损伤的动物模型。方法将8-10周龄有规律动情周期的SD大鼠随机分为4组（环磷酰胺注射第1天记为D1）:对照组（D1-D15 0.9%生理盐水）;低剂量环磷酰胺损伤组（D1 50mg/kg,D2-D15 8mg/kg）;中剂量环磷酰胺损伤组（D1 100mg/kg,D2-D15 8mg/kg）;高剂量环磷酰胺损伤组（D1200mg/kg,D2-D15 8mg/kg）。（1）观察大鼠一般状态,称量体重及卵巢重量,绘制大鼠的生存曲线;（2）检测大鼠的动情周期改变,分析环磷酰胺对大鼠卵巢的毒性作用;（3）化学发光法检测化疗结束后3天及2周的血清雌激素E2水平,了解环磷酰胺对大鼠内分泌功能的作用;（4）Elisa检测化疗结束后2周的血清AMH及FSH水平,了解环磷酰胺对大鼠内分泌功能的作用;（5）HE染色观察大鼠卵巢组织学改变及卵泡计数,评估环磷酰胺对卵巢组织学的损伤情况及对卵泡的作用。结果（1）低剂量环磷酰胺组大鼠体重及卵巢重量降低,死亡率低,中、高剂量环磷酰胺组大鼠死亡率高,故选用低剂量环磷酰胺构造卵巢功能不全的模型;（2）模型组大鼠的血清雌激素E2水平较对照组在化疗结束后3天有所下降,在化疗结束后2周明显下降;（3）模型组大鼠的血清AMH较对照组在化疗结束后2周明显下降,而FSH水平较对照组在化疗结束后2周明显上升;（4）模型组及对照组大鼠在化疗开始前均有规律的动情周期,化疗开始后1周,模型组约54%的大鼠出现异常的动情周期,化疗结束后1周模型组仍有46%的大鼠表现为异常的动情周期,而此过程对照组大鼠均有正常的动情周期;（5）环磷酰胺给药后卵巢组织损伤明显,卵巢纤维化明显,模型组较对照组窦前卵泡、窦卵泡明显减少,而闭锁卵泡显着增加。结论低剂量环磷酰胺经腹腔注射（D1 50mg/kg,D2-D15 8mg/kg）,可以建立稳定的环磷酰胺所致大鼠卵巢损伤的模型。第三部分 hAECs修复大鼠卵巢卵巢功能不全的有效性研究目的探究h AECs修复环磷酰胺所致大鼠卵巢损伤的有效性及对生育力的影响,并初步探究h AECs治疗的机制。方法选用PHK26荧光染料成功标记第1代h AECs,用于h AECs移植的体内追踪。将8-10周龄的SD大鼠纳入实验,将大鼠随机分为4组,以第1次腹腔注射环磷酰胺或生理盐水记为第1天（D1）。对照组（D1-15腹腔注射0.9%生理盐水,D16尾静脉注射PBS,双卵巢原位注射PBS）;模型组（D1-15腹腔注射环磷酰胺,D16尾静脉注射PBS,双卵巢原位注射PBS）;h AECs经尾静脉移植组（D1-15腹腔注射环磷酰胺,D16尾静脉注射h AECs,双卵巢原位注射PBS）;h AECs经卵巢原位移植组（D1-15腹腔注射环磷酰胺,D16尾静脉注射PBS,双卵巢原位注射h AECs）。（1）实验中观察大鼠一般状态,称取大鼠体重及卵巢重量;（2）卵巢组织冰冻切片后观察细胞移植后24小时及2周后PKH26标记的h AECs在卵巢中的存活与分布情况;（3）Elisa检测血清中AMH及FSH水平,分析h AECs移植对大鼠内分泌功能的影响;（4）阴道涂片检测大鼠动情周期改变,了解h AECs移植对下丘脑-垂体-性腺轴的完整性的作用;（5）HE染色观察卵巢组织学改变及卵泡计数,评估h AECs修复大鼠卵巢组织结构的效果;（6）免疫组化检测AMH、FSHR及Klotho蛋白在卵巢的分布及表达情况,初步探究h AECs移植修复卵巢损伤可能的机制;（7）大鼠合笼实验探究并记录大鼠胚胎的数量,评估h AECs移植对大鼠生育力的作用。结果（1）PKH26标记的h AECs可以向损伤的卵巢迁移,在细胞移植后24小时、2周均可以观察到红色荧光,移植的h AECs主要分布于卵巢间质区;（2）h AECs移植后可以在一定程度上提高损伤大鼠的体重及卵巢重量;（3）与模型组相比,h AECs移植可以升高损伤大鼠血清AMH水平,并降低血清FSH水平,改善卵巢功能不全大鼠的内分泌功能;（4）h AECs移植可降低损伤大鼠的异常动情周期,降低环磷酰胺所致的卵巢毒性作用;（5）h AECs移植使窦前卵泡、窦卵泡数量增加,闭锁卵泡数量减少,对卵巢组织有修复作用;（6）与模型组相比,h AECs移植可使卵巢组织AMH、FSHR及Klotho蛋白的表达水平上调;（7）h AECs尾静脉移植组、h AECs原位注射组及模型组大鼠的胚胎数量较对照组显着减少,尾静脉移植细胞组大鼠合笼后胚胎数较模型组明显增加,原位注射细胞组大鼠的胚胎数量较模型组略有增加。结论h AECs移植可以修复损伤的卵巢功能和结构,增加窦前及窦卵泡的数量,减少闭锁卵泡的数量;h AECs静脉移植可以显着改善受损大鼠的生育力功能;h AECs移植可以使卵巢组织AMH、FSHR及Klotho蛋白的表达水平上调,可能与抑制原始卵泡过度激活、促进生长卵泡发育、成熟及调节颗粒细胞的功能有关。第四部分 hAECs修复大鼠卵巢功能不全的机制研究目的h AECs修复大鼠卵巢功能不全的可能机制,希望为化疗引起的卵巢损伤的治疗提供相关理论基础,为临床上修复损伤的卵巢功能提供新的思路和策略。方法在已经证实h AECs在修复环磷酰胺所致大鼠卵巢损伤的可行性后,本实验选用RNA SEQ进行三组卵巢组织的测序,每组含3例卵巢组织。三组分别为h AECs尾静脉移植组、h AECs原位注射组及模型组,在h AECs移植后2周取卵巢组织进行测序及进一步验证。（1）卵巢组织的总RNA提取、逆转录、合成双链c DNA、扩增及测序,生物信息学分析h AECs治疗组与模型组的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,对差异表达基因的GO（Gene Ontology）及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析,了解差异基因的功能及可能涉及的通路;（2）RT-q PCR验证部分差异表达基因,进一步明确差异基因的表达水平;（3）免疫组化及Western Blot验证显着富集的类固醇激素合成通路的蛋白表达水平,从基因及蛋白表达水平探究h AECs治疗的潜在机制。结果（1）m RNA测序发现h AECs尾静脉移植组和模型组共有783个表达差异的基因,其中有619个上调的差异基因及164个下调的差异基因。而原位注射h AECs组与模型组之间有168个差异表达基因,其中116个上调的差异基因和52个下调的差异基因;（2）GO分析显示,h AECs尾静脉移植组与模型组的DEGs主要富集于离子通道活性和跨膜转运蛋白活性,而原位注射h AECs组与模型组的DEGs显着富集类固醇激素生物合成过程和类固醇激素代谢过程。KEGG分析显示,h AECs尾静脉移植组与模型组的DEGs在核糖体、蛋白消化和吸收通路、神经活动配体-受体相互作用通路及c AMP信号通路显着富集;而原位注射h AECs组与模型组的DEGs主要参与类固醇激素生物合成通路;（3）绘制维恩图发现尾静脉注射细胞组与原位注射细胞组相对于模型组共同差异表达的基因共有4个,包括2个上调和2个下调的基因。在进一步的q PCR验证中,2个上调差异基因IRF7（regulatory factor 7）与Mx1（Mx dynamin-like GTPase 1）表达与测序结果一致,即IRF7与Mx1在尾静脉注射细胞组与原位注射细胞组的表达均显着增加,相对于模型组卵巢组织的表达。而另两个下调差异基因MFAP31（microfibril-associated glycoprotein 3-like）及CITED2（c AMP-responsive element-binding protein（CREBBP）/p300-interactingtrans-activator 2 with glutamic acid（E）and aspartic acid（D）-rich tai）在q PCR的验证中,三组无显着差异;（4）KEGG分析显示原位注射组与模型组间DEGs主要富集于类固醇激素生物合成通路,进一步q PCR发现,Msmo1、SQLE、NSDH1、FDFT1、TM7SF2在原位注射组显着上调,而其他三个基因DHCR24,CYP51,HSD17B7仍然高于模型组,这与测序结果比较一致;m RNA测序结果显示,与模型组相比,原位注射h AECs组中与合成雌激素和黄体酮的关键酶如Star、Cyp11a1、Cyp19a1和Hsd17b1的表达值（FPKM值）也升高。此外,我们还观察分析了3组中血管内皮生长因子受体1（Vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR1）、VEGFR2和VEGFR3的表达。VEGFR1（原位注射h AECs组）和VEGFR2（静脉移植h AECs组）的表达分别较模型组显着升高（P<0.05）,而VEGFR3在3组间无差异;（5）免疫组化和western blotting分析发现,原位注射细胞组与模型组之间DEGs显着富集的类固醇激素生物合成通路的其中2个酶角鲨烯单加氧酶（Squalene monooxygenase,SQLE）和法尼基二磷酸法尼基转移酶1（Farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1,FDFT1）主要在卵巢黄体组织的颗粒细胞中表达,原位注射组的表达较模型组显着升高（P<0.01）。结论h AECs移植可能通过上调AMH表达,减少原始卵泡的过度激活;增加FSHR及KL蛋白表达,维持生长卵泡的发育及促进卵泡成熟;高通量测序结果显示h AECs移植对核糖体、蛋白消化、蛋白吸收、神经活性配体-受体相互作用、c AMP信号通路、甾体生物合成通路等均有影响,促进类固醇激素合成、卵泡发育和排卵;此外,h AECs移植还可通过上调促血管及抗炎因子IRF7、Mx1、VEGFR1及VEGFR2,促进血管生成,减少炎症等发挥修复作用。
方量[7]（2020）在《HP-1在保护肾功能和抗肾细胞癌方面的作用及机制研究》文中指出第一部分HP-1减弱CP引起的肾毒性反应保护肾功能研究背景:随着人们生活水平和健康意识的不断提高,很多以前未被发现的癌症患者,通过定期的健康查体被筛查确诊。美国癌症协会发布的数据展示,2018年全球有新增癌症病人1810万例,而其中因癌致死人数大约有960万人。抗癌药物的使用成为肿瘤治疗的必须手段,顺铂（CP）又称为顺氯氨铂,一种金属铂类络合物,因其抗肿瘤效果显着、癌谱广、价格便宜,为临床癌症治疗中用药比较广泛的化学物质。顺铂可与细胞核内的DNA结合,造成DNA损伤、破坏DNA的转录复制,并且高剂量时也可抑制RNA合成、蛋白质的装配。癌细胞较正常细胞代谢迅速因此对CP较为敏感,但CP治疗的无差别性往往也导致正常细胞受损,而引起诸多不良反应。尤其是肾脏损伤,因为顺铂主要通过肾脏排泄,大量累积于肾脏尤其是肾小管中,引起急性肾功能障碍,严重时肾小管坏死导致无尿。有文献报道,这些不良反应与顺铂治疗导致的炎症反应和细胞线粒体损伤有密切关系。中国中药疗法不良反应小、简单易接受、辅助治疗效果显着等特性,获得学界的广泛关注。槐耳,广泛见于我国华北地区多年生乔木树干上,是一种具有食用和药用价值的真菌,在中国可追溯的应用历史有上千年。在最近几十年的研究中,槐耳被证明具有潜在的抗肿瘤,提高系统免疫力的作用,因此被关注并应用于临床的辅助治疗。有报道发现,槐耳水提取物（主要成分为槐耳多糖,HP-1）通过其特异性免疫调节作用,减少炎性细胞渗出改善细胞生存环境,保护细胞线粒体功能。因此,在本文的论述开始我们通过提出假设,并依次开展基础实验来验证HP-1是否能减弱CP化疗引起的氧化应激反应,维护线粒体功能完整性保护细胞功能,减少炎性因子渗出改善细胞生存环境,从而能够保护肾功能减少肾损伤的作用。为此我们进行了大量的研究,希望在分子水平上探索可能存在的HP-1拮抗顺铂毒副作用的机理,希望为未来减轻CP的不良反应,提供可靠的参考策略。研究目的:1、评估体内环境下HP-1是否能减轻肾脏损伤。2、检测HP-1对CP引起细胞自噬激活和线粒体功能的障碍的影响。3、研究HP-1减弱CP诱导氧化应激压力的机制4、探索HP-1减弱CP导致肾脏炎症浸润机理。5、探讨HP-1能够减少CP细胞凋亡和周期抑制的生物学作用。6、探寻HP-1通过何种信号通路调节CP引起的不良反应。研究方法:1、CP诱导建立急性肾损伤的小鼠模型,并使用不同浓度的HP-1治疗。通过小鼠血清BUN、Cr浓度,评估小鼠肾功能,HE染色验证HP-1保护肾功能的效果。并通过western实验检测KIM-1蛋白水平,确定有无肾脏损伤。其次,通过电子透射显微镜（TEM）观察小鼠肾脏细胞的超微结构,镜下直观观察肾损伤的程度。2、电子透射显微镜观察小鼠肾脏细胞中自噬小泡数量、线粒体微细结构,评价HP-1拮抗CP引起细胞自噬和线粒体损伤的效果。通过western实验检测CP诱导后RTECs细胞中LC3-Ⅱ水平,并利用CCK-8实验评估体外细胞在HP-1应用后细胞活力的变化。同时,使用免疫荧光实验定性体外细胞中HP-1处理后LC3-Ⅱ的水平,以佐证体内LC3-Ⅱ的实验结果。3、利用western实验检测氧化应激相关蛋白的表达情况,并同时测定氧化应激相关指标MDA、ROS和GSH的水平,分析HP-1减弱CP诱导氧化压力的机制。4、首先,使用免疫组织化学,评估小鼠肾脏组织在HP-1治疗前后炎症代表因子TNF-α的表达水平。其次,使用western实验在分子水平检测HP-1治疗对炎症相关蛋白TNF-α、COX-2、IL-8、p-NF-K B的影响。最后,使用ELISA实验获得小鼠血清中TNF-α和IL-1 β的浓度。结合体内外实验找寻HP-1减少肾脏炎性浸润的机理。5、经免疫组织化学检测小鼠肾脏组织中Bax的表达水平,以鉴定小鼠肾脏细胞凋亡情况,经western实验测定与凋亡和周期有关联的蛋白表达水平。使用TUNEL检测体外细胞在HP-1处理后对CP诱导的拮抗作用,与western和流式细胞术互为佐证,使用流式细胞术验证western实验结果,证明HP-1减轻CP导致的凋亡损伤。6、经Western实验验证PI3K-AKT-mTOR信号通路相关蛋白表达情况。同时使用LY294002特异性PI3K通路抑制剂,证明HP-1通过PI3K-AKT通路调节CP引起的肾损伤的假设。7、使用人肾小管上皮正常细胞HK-2,按上述实验步骤验证,HP-1在人体细胞同样有对抗CP引起肾损伤的作用。研究结果:1、HP-1应用后显着改善肾功能,BUN、Cr水平虽未达到正常水平但较CP组相比已有回落。HE显示较CP组相比,HP-1治疗后肾小管和肾小球损伤减轻,蛋白质管型减少,KIM-1蛋白表达水平也减少,说明肾损伤减轻。TEM也观察到HP-1治疗后,细胞趋于正常,绒毛结构改善。同时未发现HP-1治疗对重要脏器造成毒副作用。2、电镜下自噬小体减少、线粒体质膜结构改善损伤减轻,自噬相关蛋白表达减少,说明HP-1治疗减轻了 CP引起的自噬和线粒体功能障碍。体外CCK-8实验选取合适的CP诱导和HP-1治疗浓度,并获得药物细胞活力数据。也通过免疫荧光实验证明HP-1治疗后,细胞自噬减少。3、与CP组相比,western实验证实HP-1处理后氧化应激相关蛋白表达水平具有所降低。氧化应激因子ROS和MDA水平也在HP-1治疗后被拉低,同时抗氧化应激因子GSH水平有所回升。这都标志着氧化应激得到有效控制,细胞功能得到改善。4、免疫组化证实HP-1能明显减少组织中炎症因子的表达,western也验证了相关炎症蛋白在使用HP-1后减少。同时,ELISA实验结果与western结果相同,认为HP-1通过减少炎症蛋白和炎症因子的表达减少炎症浸润。5、从体内、体外两个角度说明:一、小鼠肾脏组织中凋亡减少;二、流式细胞术和TUNEL都证明体外细胞凋亡数目在使用HP-1后减少;三、western结果显示凋亡起始蛋白和主要凋亡参与蛋白表达量降低,同时细胞周期进展相关蛋白表达恢复。说明HP-1使用后,无论体内还是体外细胞凋亡数目减少,且同时细胞周期得以恢复,个体功能得以更新和改善。6、HP-1通过减少PI3K、AKT、mTOR蛋白的磷酸化,阻滞信号通路上调控信号的传递,保护细胞免于药物引起的恶性凋亡。并通过增多GSK-3 β的表达,解除对细胞周期的抑制。并使用LY294002进一步验证PI3K-AKT-mTOR在HP-1治疗CP引起损伤中的功用。7、从人体细胞角度出发,证明在HP-1对人体细胞环境,同样起到减少氧化应激、减弱炎症反应、减少细胞凋亡的作用。研究结论:1、HP-1能够减轻CP诱导的急性肾功能损伤,改善肾功能。2、HP-1不具有器官毒性。3、HP-1减少CP诱导引起的细胞自噬。4、HP-1减弱CP导致的线粒体功能损伤。5、HP-1恢复细胞活力,并无明显的体外细胞毒性。6、HP-1阻滞药物导致的病理性氧化应激反应,减少相关炎症因子的浸润。7、HP-1减少炎性因子浸润和炎性蛋白表达,从而改善细胞生存环境。8、HP-1通过减少药物引起的病理性凋亡,修复受阻的周期进程,从而留存更多的器官功能。9、HP-1通过PI3K-AKT-mTOR信号传导途径减弱CP化疗引起的肾损伤。10、HP-1的治疗作用在人体细胞HK-2中获得相同的结果。第二部分HP-1抗肾细胞癌的生物学作用及机制研究研究背景:随着物质社会的发展和前进,人口素质的不断提高,公民健康意识逐渐增强,一部分肿瘤因普通查体被发现。例如肾癌,随着国家65岁以上老年人免费查体政策的实施,越来越多的病人因为主动筛查而被发现。在全世界范围内,肾癌大约占所有恶性肿瘤发病率的3%,并以每年2%的速度增长。同时,临床生活中肾癌也是泌尿外科最常见的实性病变,大约占肾恶性肿瘤的80%。在性别差异上,男女比例为1.5:1,男性多于女性,且发病年龄趋于老年化,以60-70年龄段最多。在病理学和遗传学上,具有不同的组织分型和遗传变异,其中尤以肾透明细胞癌（ccRCC）占比最高,大约占肾癌的80%。导致ccRCC的生物学基础中,最重要的一项可能是VHL的突变或功能缺失,从而导致了下游转录调节因子HIF-α的大量积蓄,进而转录上调VEGF等多种活性因子,激活一些列的激酶依赖性信号通路,如PI3K-AKT-mTOR通路。目前针对于ccRCC首选的治疗方式为手术切除,而对于终晚期患者已失去手术意义,需根据自身情况选择合适治疗方案。近年来针对于某些目标基因和目标蛋白,开发的靶向药物是终晚期肾癌患者的新希望,如人源化抗VEGF因子的单克隆抗体,小分子酪氨酸激酶抑制剂和mTOR抑制剂。舒尼替尼（Sunitinib）是一种可口服,多靶点的受体酪氨酸激酶抑制剂,其作用主要表现为抑制肿瘤血管生成,从而使瘤组织失去血液供应,致使养分不足达到“饿死”肿瘤细胞的效果。研究表明,在肾细胞癌治疗中,该药主要阻断VEGF和PDGF信号通路下游的几种受体发挥抗癌作用,其中包括:PDGFR,VEGFR。但随着药物的应用,其副作用和肿瘤的药物抵抗性逐渐显现出来,进而限制了它的临床应用。中药槐耳是一种大型真菌,主要生长在中国华北地区的多年生乔木树干上,具有食用和药用价值,同时槐耳及其水提取物HP-1有提高机体免疫力、保护器官功能完整性的功效;还具有抑制氧化反应、减少炎性浸润、增强某些药物的治疗敏感性和主动激活免疫系统的防御能力等作用。我们采用CCK-8实验、集落形成实验、划痕实验和Transwell实验证明,HP-1可有效减缓肿瘤进展过程。并且在HP-1与Sunitinib结合使用时,通过诱导凋亡和细胞周期阻滞,增强了Sunitinib的抗肿瘤特性。HP-1的一系列作用,是通过依赖于下调CIP2A的表达和镇压上皮细胞-间充质转换（EMT）来实现的。而且,实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验显示,HP-1与Sunitinib联合治疗后CIP2A下调尤为明显,并且认为与EMT被抑制有关。此外,HP-1使用后PI3K/AKT/VEGFR通路多种主要蛋白表达水平下调,如p-AKT,而p-AKT的下调使这条轴线上一些列的蛋白激活受到抑制,从而使诸如凋亡等细胞活动被激活,在整体上表现为癌细胞的死亡,并且这种趋势在HP-1与Sunitinib联用时也有增强的效果。在体内异种移植的小鼠模型中也观察到,HP-1使用后瘤体的无论是生长速度还是瘤体体积都较Control组受抑制,最为显着的差异表现在联合用药组,说明与Sunitinib联用增强了 Sunitinib抗肿瘤生长的作用。综上所述,提示HP-1具有一定抗肾细胞癌（RCC）的作用,并且能够增强Sunitinib的治疗效果。研究目的:1、评估HP-1是否能够抑制肿瘤细胞的活力,并增强肾癌细胞对Sunitinib的敏感性。2、评估HP-1、HP-1联合Sunitinib抑制肿瘤细胞增殖的效果。3、观察HP-1、HP-1联合Sunitinib使用时对786-0和A498运动能力的影响。4、观察HP-1、HP-1联合Sunitinib使用时786-0和A498侵袭的能力的变化。5、通过对肾癌细胞周期的检测,探索HP-1、HP-1联合Sunitinib应用影响周期的机制。6、通过对肾癌细胞凋亡的检测,探讨HP-1、HP-1联合Sunitinib如何诱导细胞凋亡。7、探寻HP-1及药物联用是否通过调控CIP2A基因和其对应蛋白表达,影响肾癌细胞活力和转移侵袭能力。8、研究HP-1及联合用药时,经EMT和PI3K-AKT-VEGFR通路抑制肿瘤细胞生长的分子学机制。9、体内实验探索HP-1及与Sunitinib联合应用时对肿瘤生长的抑制机制。研究方法:1、CCK-8测定不同浓度HP-1、HP-1与Sunitnib联合应用时,肿瘤细胞的细胞活力变化;集落形成检测测定药物处理后,786-0和A498增值能力的变化;显微镜下观察786-0和A498在药物处理后形态学变化。2、划痕实验测定药物处理后,对786-0和A498活动能力的影响;Transwell实验测定HP-1及联合Sunitnib应用后,对786-0和A498转移和侵袭能力的影响。3、流式检测药物处理后,786-0和A498细胞周期的分布情况;western测定药物处理后,786-0和A498蛋白表达变化情况。4、流式检测786-0和A498在药物处理前后凋亡比列情况;western检测对应凋亡蛋白的表达。5、PCR测定CIP2A转录水平,并结合western检测CIP2A蛋白的翻译水平,同时IF定性分析补充说明。过表达CIP2A测定HP-1、HP-1及Sunitinib联合应用时,对细胞活力、运动能力的影响。6、HP-1、HP-1 与 Sunitinib 联合应用后,western 实验测定 EMT 及 PI3K-AKT-VEGFR通路主要蛋白的表达情况。7、体内实验验证HP-1及联合用药对肿瘤生长的抑制,并使用PCR和western分析其内在的生物学机制。研究结果:1、HP-1降低肾癌细胞的活力,在Sunitinib联合HP-1使用时比单独用Sunitinib对细胞活力抑制更强,且都存在药物的时间和浓度依赖性。同时,药物联合应用肾癌细胞集落形成的能力更弱,且细胞的形态学变化明显。2、HP-1处理减弱786-0和A498运动能力,抑制了细胞增殖和侵袭。在Sunitinib合用HP-1后,Sunitinib抑制肿瘤效果更显着。3、联合用药较单独用药使更多的细胞阻滞在G1期,且周期进展蛋白cyclin-D、cyclin-E表达减少而周期抑制有关蛋白p21 Cip1、p27 Kip1表达增多。4、凋亡相关蛋白caspase-3、Bax表达增多,且流式细胞术显示HP-1、HP-1及Sunitinib联合使用都诱导了细胞凋亡,但联合用药比单独用药效果显着。5、药物处理后肾癌细胞活力减弱、增殖和侵袭受到抑制,是CIP2A基因表达受到抑制、CIP2A蛋白表达减少的结果。6、药物处理后EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug表达减少,E-cadherin表达增多。有生物活性的PI3K、AKT减少,GSK-3β、VEGFR蛋白在药物处理后表达水平也降低。7、较Control组相比,小鼠异种移植瘤在HP-1处理后体积减小,且Sunitinib联合HP-1处理后所获瘤体最小。PCR分析显示,药物处理后肿瘤中CIP2A基因表达减少。Western实验展示了细胞周期、细胞凋亡、EMT过程、PIEK-AKT-VEGFR信号通路相关蛋白的表达情况,蛋白表达整体上说明癌细胞生物进程被抑制。研究结论:1、HP-1能抑制了肾癌细胞活性,减弱肿瘤细胞增殖和侵袭的能力。2、HP-1通过诱导肾癌细胞凋亡、阻滞肾癌细胞周期进展达到抑制肿瘤的效果。3、HP-1通过对CIP2A转录水平的调控,影响其后蛋白的合成,增强了癌细胞对药物的敏感性。4、HP-1能够通过调控EMT、PI3K-AKT-VEGFR/GSK-3β等多条信号通路,逆转EMT过程、激活癌细胞主动凋亡、阻滞肿瘤异常血管的增生。5、体内环境下,HP-1通过减少CIP2A表达,逆转EMT过程,诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期和降低PI3K-AKT-VEGFR通路活性,减缓裸鼠瘤的生长速度。6、在Sunitinib与HP-1联合应用时,Sunitinib药物效果较单独使用时更好,说明HP-1增强了肿瘤细胞对Sunitinib的药物敏感性。
张会苑[8]（2020）在《基于ZIF-8金属有机框架材料的多功能纳米给药系统的设计及抗肿瘤研究》文中进行了进一步梳理近年来,恶性肿瘤已经成为世界范围内严重威胁人类生命安全与健康的重大公共卫生问题。因此,实现安全有效的抗肿瘤治疗是医药工作者亟待解决的严峻任务。目前,临床治疗肿瘤的主要手段包括了放射治疗、手术治疗和化学疗法。其中,基于药物的化学治疗可以通过抑制肿瘤细胞增殖或杀伤肿瘤细胞实现抗肿瘤疗效。但是传统的化疗药物在应用中表现出诸多弊端:1)体循环中的不稳定性;2)体内非特异性分布;3)药物的毒副作用;4)肿瘤细胞的多药耐药性等。理想的纳米药物载体具有体循环时间长、改善药物的药动学和药效学、持续性释放药物和毒副作用小的优点,在抗肿瘤治疗领域已得到广泛的关注。一般来讲,纳米载体主要包括了有机材料载体、无机材料载体以及由有机组分和无机组分构成的杂化材料载体。常规的有机或无机药物纳米载体可能存在严重缺点,例如低的药物装载能力和不可控的药物释放。金属有机框架材料（MOFs）是一类由金属簇或金属离子和有机配体通过配位作用生成的有机、无机杂化材料,具有较大的孔径体积、高比表面积和易于调节的骨架结构,可以实现高载药量。沸石咪唑酯骨架材料-8（ZIF-8）是一种由锌离子和2-甲基咪唑构建的无毒且具有生物相容性的MOFs,在中性的生理条件下结构稳定,但是可以在肿瘤细胞内pH值较低的环境下降解。因此,ZIF-8可以被用作有潜力的抗肿瘤药物载体实现高载药量和肿瘤部位pH响应性药物释放。然而,目前基于MOFs的纳米药物递送系统的研究较少,并且相关研究未能充分发挥MOFs的优势解决抗肿瘤治疗中存在的问题。例如,由于肿瘤细胞高表达药物主动外排转运蛋白（例如P-糖蛋白）,肿瘤细胞会对化疗药物产生耐药性,从而引起抗肿瘤化学治疗疗效降低;此外,单独的化学治疗疗效有限,难以完全清除肿瘤,一旦停止治疗,可能会出现预后不良的问题,伴随有肿瘤的复发和转移。而MOFs在药物递送的生物应用中也表现出一定的局限性,目前主要有两种方法被用于实现基于MOFs的药物荷载和药物递送:1)MOFs合成后吸附药物,该方法适用于分子结构比MOFs空隙小的药物分子,在载药后的清洗过程中容易引起药物泄漏,从而导致载药量低和药物突释的问题。2)在MOFs的构建过程中通过“一步法”原位荷载药物,这种方式可以通过在MOFs中生成缺陷实现对具有较小或较大分子结构的药物的装载,避免载体降解前药物的泄漏;但是,对于这种情况,药物分子和MOFs之间的强相互作用是实现高载药量和可控性药物释放的必要条件,到目前为止,仅有少数具有特殊官能团的药物分子可以被成功荷载。因此,合理设计、构建可以普适性递送多种药物分子的多功能MOFs纳米平台对于增强抗肿瘤治疗具有重要意义。本课题构建了三种基于MOFs的主动靶向纳米药物递送平台用于多模式抗肿瘤治疗,针对性地解决了肿瘤治疗面临的主要问题和MOFs作为药物载体的应用局限性问题,并对构建的各制剂进行了体外基础表征和体内、外抗肿瘤评价。主要研究内容和实验结果如下:基于MOFs纳米载体的盐酸多柔比星/盐酸维拉帕米共给药系统用于克服肿瘤多药耐药性、实现靶向抗肿瘤治疗研究在水溶液中通过原位“一锅煮”方法合成荷载盐酸多柔比星（DOX）和盐酸维拉帕米（VER）两种药物的ZIF-8药物共递送纳米粒,并通过配位作用实现聚乙二醇-叶酸（PEG-FA）在纳米粒表面的修饰,构建肿瘤细胞主动靶向纳米粒PEG-FA/（DOX+VER）@ZIF-8。对合成的 PEG-FA/（DOX+VER）@ZIF-8 进行体外基础表征,考察其晶体结构、热稳定性、纳米粒形态、粒径分布和Zeta电势。X射线粉末衍射结果显示PEG-FA/（DOX+VER）@ZIF-8具有良好的晶型,热重分析结果证实制剂具有较高的热稳定性,相关结果可以验证ZIF-8金属有机框架结构的成功合成。透射电子显微镜（TEM）图片显示PEG-FA/（DOX+VER）@ZIF-8纳米粒为均匀类球形,动态光散射（DLS）测定纳米粒粒径约为185.0 nm（PDI=0.005）,满足 EPR 效应要求。PEG-FA/（DOX+VER）@ZIF-8 纳米粒在水溶液中的Zeta电势为-（34.50±7.43）mV。通过紫外分光光度法测定（DOX+VER）@ZIF-8的载药量,其中DOX和VER的载药量分别为8.9%和32.0%。选择pH值为5.0和7.4的PBS作为释放介质进行体外释放实验,在相同时间内,浸没于pH=5.0的PBS中的（DOX+VER）@ZIF-8相比浸没于pH=7.4的PBS中的样品释放出更多的DOX和VER,验证了（DOX+VER）@ZIF-8的pH响应性释药行为。选取高表达FA受体的MCF-7细胞和耐药的MCF-7/ADR细胞,评价制剂的细胞摄取情况。荧光倒置显微镜图片和流式细胞术结果共同说明了细胞对PEG-FA/（DOX+VER）@ZIF-8具有较高的摄取行为。并通过对比实验验证了 FA受体介导的内吞作用和VER介导的逆转多药耐药作用对化疗药物DOX摄取的改善。采用噻唑蓝比色法（MTT法）研究制剂对多种肿瘤细胞的体外细胞毒性,实验结果显示,与 DOX 原料药和制剂 DOX@ZIF-8 相比,PEG-FA/（DOX+VER）@ZIF-8可以导致更高的肿瘤细胞生长抑制率。通过近红外荧光活体成像法监测制剂在荷瘤小鼠体内的生物分布情况,相关结果表明,PEG-FA/ZIF-8可以作为肿瘤主动靶向药物载体延长药物在体内的循环、增加药物在肿瘤部位蓄积。在体内抗肿瘤评价中,比较了不同制剂的体内抗肿瘤疗效和毒副作用,PEG-FA/（DOX+VER）@ZIF-8具有最高的抑瘤率,此外,苏木精和伊红（H&E）染色结果验证了该制剂对小鼠的主要脏器具有较低的系统毒性。基于普适性前药策略构建载阿糖胞苷-新吲哚菁绿前药的ZIF-8纳米粒及其在化疗-光热治疗联合抗肿瘤治疗的应用以6-氨基己酸作为连接链合成阿糖胞苷-新吲哚菁绿（Ara-IR820）小分子前药并采用硅胶柱色谱法提纯产物。使用核磁共振氢谱法（1HNMR）和质谱法（MS）对中间产物和最终产物进行化学结构鉴定,证明合成成功。通过原位“一锅煮”方法合成荷载Ara-IR820小分子前药的ZIF-8药物递送纳米粒,最后实现透明质酸（HA）在Ara-IR820@ZIF-8纳米粒表面的修饰,制得肿瘤主动靶向纳米粒HA/Ara-IR820@ZIF-8。对合成的HA/Ara-IR820@ZIF-8进行体外表征,考察纳米粒形态、粒径分布和体外升温性能。TEM结果显示HA/Ara-IR820@ZIF-8纳米粒为均匀类球形形态,DLS测定纳米粒水动力学粒径约为132.0nm（PDI=0.086）,满足EPR效应要求。通过紫外分光光度法测定HA/Ara-IR820@ZIF-8的载药量,其中Ara-IR820的载药量约为39.8%。通过体外升温实验考察制剂光热性能,在等浓度下,HA/Ara-IR820@ZIF-8体外升温效果优于IR820水溶液,在5分钟1 W/cm2的激光照射后,HA/Ara-IR820@ZIF-8（cIR820=118 μM）水溶液温度可以升高 26.7℃。考察 HA/Ara-IR820@ZIF-8 在 pH=5.0 和 pH=7.4 的 PBS 中的药物释放行为,结果验证了制剂的pH响应性释药特性。通过溶血实验对HA/Ara-IR820@ZIF-8作为静脉给药制剂的生物相容性和安全性进行初步评估,结果显示制剂溶血率低于5%,基本满足静脉注射给药的要求。选取高表达HA受体CD44的4T1细胞考察制剂的细胞摄取行为。荧光倒置显微镜图片和流式细胞术结果共同说明了细胞对HA/Ara-IR820@ZIF-8具有较高的摄取。通过竞争性抑制实验验证了 CD44介导的内吞作用诱导肿瘤细胞对制剂的主动靶向摄取能力。采用MTT法验证HA/Ara-IR820@ZIF-8对肿瘤细胞的化疗疗效和光热治疗（PTT）疗效,结果显示,制剂可以通过化疗联合PTT表现出强大的细胞毒性。通过近红外荧光活体成像法监测制剂在荷瘤小鼠体内的生物分布情况,结果证实了 HA/Ara-IR820@ZIF-8优异的肿瘤靶向蓄积能力,并确定了最佳光照时机用于荧光成像指导的PTT。构建小鼠皮下荷瘤模型,考察制剂的体内升温效果、抗肿瘤能力和系统毒性。HA/Ara-IR820@ZIF-8表现出高效的体内升温性能,可用于抗肿瘤PTT。体内抗肿瘤实验中,HA/Ara-IR820@ZIF-8可以极大程度地抑制肿瘤的生长,且对于治疗的小鼠具有较低的毒副作用。任务特异性MOFs混合纳米粒用于肿瘤细胞靶向治疗和树突细胞靶向免疫调节协同增强抗肿瘤免疫治疗的研究通过原位“一锅煮”方法分别合成了荷载IR820或共载咪喹莫特（R837）和1-甲基色氨酸（1MT）的ZIF-8纳米粒。HA修饰于IR820@ZIF-8表面进行功能化制得肿瘤细胞主动靶向纳米粒（HA/IR820@ZIF-8）。甘露聚糖（MAN）修饰于共载R837和1MT的ZIF-8纳米粒表面制得树突细胞（DCs）主动靶向纳米粒（MAN/（R837+1MT）@ZIF-8）。对制 备 的 HA/IR820@ZIF-8 和MAN/（R837+1MT）@ZIF-8进行体外表征,考察其晶体结构、纳米粒形态、水溶液中的粒径分布和Zeta电势。TEM 图像显示HA/IR820@ZIF-8和MAN/（R837+1MT）@ZIF-8均为粒径分布相对均匀的类球形形态。DLS测定HA/IR820@ZIF-8 和 MAN/（R837+1MT）@ZIF-8 的水动力学粒径分别为 120.0 nm（PDI=0.119）和 221.0nm（PDI=0.185）。紫外分光光度法测得 HA/IR820@ZIF-8的载药量为34.4%,MAN/（R837+1MT）@ZIF-8中R837和1MT的载药量分别为8.9%和10.7%。体外升温实验验证了 HA/IR820@ZIF-8优越的光热性能,具有应用于 PTT 的潜力。通过测定 HA/IR820@ZIF-8 和 MAN/（R837+1MT）@ZIF-8 混合制剂的溶血毒性,初步判定制剂满足用于静脉注射给药的可行性。细胞摄取实验显示出B16F10细胞对HA/IR820@ZIF-8较高的细胞摄取并验证了 HA介导的肿瘤细胞主动靶向药物递送。此外,考察了 B16F10细胞对HA/IR820@ZIF-8的摄取动力学,在给药4小时后,肿瘤细胞对纳米粒的摄取达到较高水平,可以进行激光照射用于PTT。采用MTT法和细胞凋亡实验研究制剂HA/IR820@ZIF-8对肿瘤细胞的暗毒性和光毒性。在未经激光照射时,制剂对B16F10细胞的细胞毒性较低,而在激光照射条件下,HA/IR820@ZIF-8表现出较高的肿瘤细胞光毒性,并可以诱导严重的细胞凋亡。对HA/IR820@ZIF-8引起肿瘤细胞免疫原性死亡（ICD）的能力进行评价,通过免疫荧光染色法检测钙网蛋白（CRT）的表达,实验结果证明,基于HA/IR820@ZIF-8的PTT可以有效地引发肿瘤细胞ICD,触发抗肿瘤免疫反应。通过细胞摄取实验考察骨髓来源树突细胞（BMDCs）对MAN/（R837+1MT）@ZIF-8的细胞摄取行为,并验证了 MAN介导的DCs主动靶向药物递送。考察了 MAN/（R837+1MT）@ZIF-8或1MT培养后DCs培养基中犬尿氨酸（kyn）的含量,结果显示 1MT原料药和MAN/（R837+1MT）@ZIF-8制剂对kyn均具有较高的抑制率,可以有效地抑制免疫抑制性吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）通路。通过检测树突细胞表面CD80和CD86的表达以及细胞培养基中代表性细胞因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）的浓度,验证了 MAN/（R837+1MT）@ZIF-8和PTT后的肿瘤细胞残渣对 DCs 成熟的刺激作用。结果证明了由 HA/IR820@ZIF-8 和MAN/（R837+1MT）@ZIF-8构成的混合制剂可以有效地激活抗肿瘤免疫反应。建立小鼠单边荷黑色素瘤模型,考察制剂的体内分布情况、升温效果、抗肿瘤能力和系统毒性。通过活体成像确定给药6小时后进行激光照射,HA/IR820@ZIF-8可以表现出高效的体内升温性能。体内抗肿瘤实验中,HA/IR820@ZIF-8或MAN/（R837+1MT）@ZIF-8均可以在一定程度上抑制肿瘤的生长,而由HA/IR820@ZIF-8和MAN/（R837+1MT）@ZIF-8构成的混合制剂表现出最高的抑瘤率。为阐明混合制剂在增强抗肿瘤免疫治疗中的作用和机制,体内药效实验后,解剖小鼠的肿瘤,采用免疫荧光染色法和流式细胞术分析淋巴细胞中CD4+T细胞、CD8+T细胞和免疫调节性T细胞（Tregs）的比例。结果证实混合制剂可以有效增加效应T细胞（CD8+/CD4+T细胞）与Tregs的比值,增强抗肿瘤免疫治疗活性。此外,通过分析脾脏中CD4+T细胞、CD8+T细胞、Tregs和记忆T细胞的比例验证了制剂对机体全身免疫力的增强和免疫记忆效应的产生。建立小鼠双边荷黑色素瘤实验模型,考察制剂的远位抗肿瘤效应。结果显示,HA/IR820@ZIF-8和MAN/（R837+1MT）@ZIF-8的混合制剂不仅对激光照射的原位肿瘤具有杀伤作用,并且可以抑制未经激光照射的远位肿瘤的生长。通过分析远位肿瘤淋巴细胞中CD8+T细胞、CD4+T细胞以及Tregs的比例,研究了制剂的远位抗肿瘤免疫机制。综上,本课题设计构建了三种基于MOFs的主动靶向纳米药物递送平台用于多功能抗肿瘤治疗,针对性地解决了肿瘤化学治疗多药耐药问题、MOFs载药局限性问题以及抗肿瘤免疫治疗中多靶点、疗效低的问题。本研究不仅提供了新型、高效及多功能的抗肿瘤纳米平台,在肿瘤治疗领域具有广阔应用前景,并为MOFs这类重要载体材料在生物医药领域的应用提供了新思路。
贺宜春[9]（2020）在《自噬流损伤介导Caspase-8非经典活化增加神经胶质瘤细胞替莫唑胺敏感性的机制研究》文中研究指明背景:目前,神经胶质瘤的治疗原则是手术治疗,同时辅以放化疗,化学治疗仍是神经胶质瘤的主要治疗手段之一。替莫唑胺（TMZ）是神经胶质瘤的一线化疗药物,但是由于药物敏感性随治疗过程逐步下降,TMZ治疗可以延长胶质母细胞瘤中位生存期3-5个月。因此,如何增加神经胶质瘤细胞TMZ敏感性成为影响化疗效果的瓶颈问题。既往研究发现,在TMZ干预下,自噬起到促死亡和促存活两种看似相悖的作用,但是其潜在机制尚不明晰,为精准判断自噬在治疗中的作用并靶向自噬提高TMZ疗效带来了困难。目前研究已经表明,许多自噬相关蛋白参与凋亡调控,自噬流状态被认为是决定自噬作用的关键因素。因此,在不同自噬流背景下,探讨自噬在凋亡调控及TMZ敏感性调节中的作用,为靶向自噬提高TMZ敏感性,提高胶质瘤患者生存期提供理论依据。自噬（Autophagy）是一个高度动态,多步骤的生物进程,包括起始,自噬膜形成与延伸,自噬体成熟闭合,与溶酶体融合以及溶酶体降解。自噬的这一完整过程称之为自噬流（Autophagic Flux）,用来反应自噬水平的高低。既往研究证明,TMZ作用下,在不同步骤干扰自噬流会导致不同的细胞命运,提示TMZ作用下,自噬流状况决定的自噬底物的堆积状态可能是决定自噬促生存或促死亡作用的关键因素,进而决定细胞命运。SQSTM1,也叫做p62,是选择性自噬的特异性底物,也是自噬体膜的重要组成成分。实验室早期研究发现,p62的基础性高表达和通畅的自噬流赋予肿瘤细胞对治疗更高的耐受性。当应用氯喹（chloroquine,CQ）或巴弗洛霉素A1（Bafilomycin A1,Baf A1）在自噬流晚期阻断自噬流后,凋亡敏感性显着升高。同时,敲除ATG4C基因可有效阻断自噬流量,导致p62和LC3-II的堆积性表达增高,增加TMZ的细胞毒性作用。这些证据提示,p62作为关键蛋白决定自噬的促生存或促死亡作用。但是,单纯依靠p62的表达并不能准确反映自噬流状态以及鉴别自噬在TMZ诱导细胞死亡中的作用。因此,在不同自噬流背景下,揭示p62在TMZ诱导的细胞死亡中的作用机制是一个亟需解决的任务。研究提示,p62可通过介导Caspase-8激活或降解影响细胞命运。Caspase-8作为外源性凋亡途径中的关键蛋白,尽管其在GBM中表达上调,但是其凋亡活性并未激活。由此,激活Caspase-8的凋亡活性可能是一个提高TMZ敏感性的有效策略。而自噬体膜可作为细胞内死亡诱导信号复合体（i DISC）平台,进而导致不依赖于死亡受体的Caspase-8激活。因此,从i DISC的形成与降解角度探究Caspase-8与p62的相互作用可能有利于揭示自噬流对凋亡的精确调控机制,提供一个精准判断TMZ作用下自噬作用的参考指标。本研究以不同自噬流量的SHG44和U87MG胶质瘤细胞系为研究模型,利用胶质瘤组织芯片、细胞模型及裸鼠皮下异体移植瘤模型,采用免疫共沉淀、间接免疫荧光等分子生物学技术,探讨自噬流量调节i DISC形成与降解影响自噬在TMZ治疗中的作用,为精准靶向自噬,提高TMZ敏感性,改善患者预后提供理论基础。方法:（1）利用生物信息学大数据及胶质瘤组织芯片分析胶质瘤级别与p62和Caspase-8表达之间的关系,结合对应的临床资料,分析p62及Caspase-8对患者预后影响。（2）利用MTT法检测TMZ,CQ对胶质瘤细胞的细胞活性抑制情况;（3）Western Blotting检测p62和LC3表达,m RFP-GFP-LC3双标腺病毒感染细胞评价自噬流量。（4）利用Caspase-8和Caspase-3活性检测试剂盒,TUNEL法、Annexin-V/PI双染、Western Blotting检测凋亡蛋白来检测TMZ和CQ诱导的凋亡发生情况。（5）利用间接免疫荧光及免疫共沉淀来检测p62、Caspase-8之间的空间共定位以及自噬体膜对Caspase-8的招募情况。（6）通过p62敲除、过表达p62及UBA和LIR截短突变体,检测Caspase-8活性并使用Western检测蛋白剪切情况,评价p62及其结构域对Caspase-8活化的影响。（7）利用裸鼠胶质瘤皮下异体移植瘤模型,给予TMZ灌胃,CQ腹腔注射处理,体内验证CQ与TMZ的联合作用;检测处理后异体移植瘤的p62、Caspase-8的表达及活性变化。结果:（1）生物信息学及胶质瘤组织芯片结果显示,自噬及溶酶体相关基因在胶质瘤中高表达,自噬特异性底物p62和Caspase-8的表达具有相关性,且p62高表达的情况下,Caspase-8高表达的患者预后较好。（2）筛选出低自噬流量的SHG44和高自噬流量的U87MG,替莫唑胺显着提高胶质瘤细胞的自噬起始及自噬流量。CQ阻断自噬流量后,p62显着堆积性表达增高,同时增加替莫唑胺诱导的Caspase-8活化以及凋亡。（3）CQ阻断自噬可增加p62和Caspase-8的相互作用以及自噬体膜对Caspase-8的招募。敲除p62降低TMZ和CQ联合应用导致的Caspase-8活化。p62过表达可增加TMZ诱导的Caspase-8活化。而与野生型p62相比,UBA和LIR结构域截短突变体显着抑制了Caspase-8的活化。（4）体内实验证明CQ有效增加TMZ对肿瘤生长的抑制。CQ增加异体移植瘤的p62堆积和Caspase-8活化。结论:（1）高级别胶质瘤的基础自噬流量显着高于低级别胶质瘤,并且较高的基础自噬流量预示着不良预后。（2）阻断自噬流或自噬起始大于自噬相关溶酶体降解能力将导致p62的堆积,进而介导Caspase-8激活。自噬流量调控i DISC的形成与降解,调控Caspase-8活化,进而参与胶质瘤对替莫唑胺的敏感性调节。（3）i DISC介导的Caspase-8激活依赖于p62的UBA和LIR结构域。（4）Caspase-8可辅助p62判断胶质瘤自噬流量的大小;p62/Caspase-8表达模式具有成为更精准的胶质瘤预后指标的可能。
初秋博[10]（2020）在《基于免疫调控的贞芪扶正颗粒促造血及抗结直肠癌活性的研究》文中研究说明贞芪扶正颗粒（ZQFZ）是以我国传统医学理论为基础,将现代医学中的药理研究和临床实践的经验与传统的扶正祛邪相结合而成的复方方剂,其主要组分为黄芪和女贞子。贞芪扶正的方子在中国已经使用了数千年,并在辅助疗法中发挥了重要作用,方中应用黄芪补气,女贞子滋阴补肾,通过扶正固本,增强机体免疫系统功能,保护机体骨髓与肾上腺皮质功能,在临床上经常用于治疗由各种疾病所引起的虚损,可以配合放射线治疗、化学治疗和手术治疗使用以促进机体正常功能的恢复,从而纠正患者的气虚证候,具有潜在的抗肿瘤活性。目前国内外对于ZQFZ的研究主要侧重在化学成分分析、免疫调节功效与协同抗肿瘤活性的临床研究,而有关ZQFZ参与免疫调节提升造血功能活性和抗结直肠癌活性的研究还未见报道。本论文以ZQFZ为研究对象,检测其代表性成分,初步探究其对健康小鼠的影响,再结合体外细胞实验和体内动物模型探究ZQFZ的免疫调节、造血提升和抗结直肠癌作用,初步阐明ZQFZ对化疗损伤小鼠免疫、造血系统功能修复以及对结直肠癌小鼠免疫系统修复起到抗肿瘤作用的主要分子学机制,得到以下结论:ZQFZ中含有红景天苷3.948 mg/g、毛蕊异黄酮苷0.145 mg/g、女贞苷0.179mg/g、芒柄花苷0.032 mg/g、槲皮素0.071 mg/g和芒柄花素0.027 mg/g。本论文首先考察了ZQFZ对健康小鼠的影响。ZQFZ灌胃给药4周后,检测小鼠的体重、脏器（胸腺、脾脏、肝脏和肾脏）指数、小鼠动物行为学指标和氧化应激相关因子水平,揭示ZQFZ对健康小鼠的作用。结果显示,与空白对照组相比,ZQFZ对健康小鼠的体重、脏器指数、组织切片结果和自主活动实验无明显影响,ZQFZ可以提高小鼠耐力跑、转棒和力竭游泳的时间,显着降低健康小鼠血清和肝脏中活性氧（ROS）的含量,起到抗氧化、抗疲劳的作用。表明ZQFZ有抗氧化、抗疲劳活性,而且对健康小鼠没有明显的毒副作用,提示ZQFZ可能具有免疫调节作用。本论文考察了ZQFZ对环磷酰胺（CTX）诱导的免疫抑制模型小鼠免疫系统功能的影响。免疫抑制小鼠在经过ZQFZ灌胃治疗4周后,通过对小鼠的体重、脏器指数（脾脏和胸腺）、NK细胞杀伤活性以及免疫相关细胞因子的表达情况的检测,揭示ZQFZ发挥免疫调节作用的分子机制。结果显示,与模型组相比,经ZQFZ治疗4周后,小鼠的体重、脾脏与肝脏指数均得到了显着的回升,NK细胞的杀伤活性明显增强。此外,ZQFZ还可以促进免疫抑制小鼠血清中的免疫球蛋白G（Ig G）、Ig A、Ig M、白介素2（IL-2）、IL-6、IL-10和干扰素（IFN）-α的合成,并且抑制IL1-β的表达。病理切片证实ZQFZ减轻了免疫抑制小鼠脾脏内多核巨细胞现象,表明ZQFZ能够有效缓解CTX诱导的免疫抑制可能与细胞因子的淋巴细胞调节作用有关,提示ZQFZ可能具有调节造血功能和抗肿瘤活性。为探究ZQFZ对于造血功能的调控作用,我们首先通过体外细胞实验,利用XTT法与流式细胞术考察ZQFZ对两种造血细胞（K562细胞和CHRF细胞）的细胞活力和凋亡情况的影响,采用联苯胺染色考察ZQFZ对K562细胞分化能力的影响。实验结果显示,ZQFZ能够促进K562和CHRF细胞的细胞活力并对两种细胞的凋亡水平无明显影响,提示ZQFZ无明显的细胞毒性,ZQFZ可以增强K562细胞向红系细胞分化的能力,并且能够上调K562和CHRF细胞中造血细胞增殖分化相关蛋白磷酸化p90核糖体S6激酶（P-RSK1p90）、ETS转录因子（ELK1）和c-Myc的表达,提示ZQFZ可能通过上调转录因子的表达进而促进造血细胞的增殖分化。之后,我们在体内建立了由CTX诱导的骨髓抑制小鼠模型,探究ZQFZ能否促进骨髓抑制小鼠骨髓造血功能的重建,揭示ZQFZ重建骨髓造血功能的分子机制。实验结果显示,经ZQFZ治疗4周后,骨髓抑制小鼠体重与脏器指数明显恢复,脏器（肝脏和脾脏）肿胀情况得以缓解,外周血血象中淋巴细胞（LY）、平均血红蛋白含量（MCH）、血红蛋白（HGB）和中性粒细胞（NE）显着升高,单核细胞百分率（MO）降低。此外,ZQFZ能够改善骨髓抑制小鼠受损的骨髓内形态结构,缓解脾脏多核巨细胞增多和肝脏炎性浸润现象,显着促进骨髓细胞中B淋巴细胞生成并提高幼稚细胞的增殖能力,提示ZQFZ对造血功能的调控可能与其免疫调节活性有关。结合抗体芯片、ELISA检测结果与western-blot实验结果,结果显示,ZQFZ能够显着提高血清和脾脏中IL-2和IL-5、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的表达水平,抑制IFN-γ、肿瘤坏死因子（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1、MCP-5和重组人趋化因子CCL3（MIP-1α）的分泌,同时抑制骨髓抑制小鼠脾脏中ROS表达,显着上调了小鼠脾脏中M-CSF、超氧化物歧化酶（SOD）-1、SOD-2、血红素加氧酶1（HO-1）、核转录因子2（Nrf2）和磷酸化核转录因子B（P-NF-κB）的蛋白表达丰度,在小鼠骨髓单核细胞（BMMNCs）中验证相关蛋白的表达水平,发现ZQFZ显着下调了P-p38的蛋白表达丰度,上调了SOD1、SOD2、HO-1、Nrf2、磷酸化细胞外调节蛋白激酶（PERK）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（P-m TOR）、磷酸化IκB激酶α+β（PIKKα+β）和P-NF-κB的蛋白表达丰度,而且P-RSK1p90、ELK1、c-Myc、Nrf2、P-NF-κB和M-CSF的蛋白表达丰度在加入Nrf2-si RNA的K562细胞中被显着上调,证明Nrf2/NF-κB信号通路上调M-CSF水平的途径可能是ZQFZ促进化疗损伤小鼠造血功能重建的主要分子学机制。我们建立了小鼠结直肠癌模型,探究ZQFZ对结直肠癌小鼠肿瘤抑制活性的影响,揭示ZQFZ抗结直肠癌活性的机制。结果表明,经ZQFZ灌胃给药8周后,结直肠癌小鼠的体重、脾脏指数和胸腺指数显着回升,结直肠重量与长度比显着下降,结直肠中肿瘤形成数量减少。此外ZQFZ促进结直肠癌小鼠血象中白细胞（WBC）、LY和粒细胞（GR）水平提升、NK细胞增殖和CD3+CD28+双阳细胞生成,修复受损的脾脏形态,减轻肝脏中空泡变形,减轻肺脏与结直肠的炎性浸润现象,并能够恢复结直肠中腺体结构。ZQFZ能够显着提高结直肠癌小鼠血清和结直肠中IL-2、IL-12、TNF-α和IFN-γ水平,进一步证实,ZQFZ可能通过调节免疫体系功能达到抑制结直肠癌的作用。总之,以上实验研究表明:（1）ZQFZ对健康小鼠的抗疲劳抗氧化活性有一定的促进作用;（2）ZQFZ对免疫抑制小鼠的免疫功能有明显的促进作用,其机制可能与免疫因子的淋巴细胞调节有关;（3）ZQFZ对骨髓抑制小鼠的造血功能有明显的改善作用,其机制可能与Nrf2/NF-κB信号转导通路提高M-CSF的表达有关;（4）ZQFZ对结直肠癌小鼠的抗肿瘤活性有明显的改善作用,其机制可能与ZQFZ免疫调节活性有关。本课题的提出有助于进一步促进ZQFZ的开发与推广,也将为开发能够缓解由长期化疗导致的免疫抑制及骨髓抑制作用的抗肿瘤药物提供新思路。
二、40种化学治疗药物使用说明书的分析及临床指导（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、40种化学治疗药物使用说明书的分析及临床指导（论文提纲范文）
（1）石斛提取物毛兰素对人结直肠癌细胞的干预作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 实验研究 |
| 第一章 实验材料 |
| 第二章 实验方法 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 1 毛兰素对于细胞活性及增殖的作用影响 |
| 2 毛兰素对于细胞周期以及凋亡的作用影响 |
| 3 毛兰素对于细胞Wnt/β-catenin信号通路及其靶基因的作用影响 |
| 4 毛兰素对CD47的表达以及巨噬细胞吞噬效果影响 |
| 5 毛兰素对免疫缺陷小鼠及其体内移植瘤的作用研究 |
| 结论 |
| 不足与展望 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）食管鳞癌和贲门腺癌中拷贝数扩增基因的筛选及功能研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 VAV2基因在食管鳞状细胞痛进展中的作用机制研究 |
| 前言 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 材料和方法 |
| 参考文献 |
| 第二部分 贲门腺痛拷贝数扩增相关基因的筛选及研究 |
| 前言 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 材料和方法 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 文献综述 食管鳞痛基因组学和表观基因组学研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（3）养阴解毒方联合化疗对NSCLC患者血清中β3GnT8、CD147表达影响的临床研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 综述一 养阴解毒法治疗非小细胞肺癌的研究进展 |
| 1. 中医学对肺癌的认识 |
| 1.1 肺癌产生的病因病机 |
| 1.2 肺癌的中医辨证分型 |
| 2. 阴虚毒热证的中医病机 |
| 3. 养阴解毒法 |
| 3.1 养阴解毒法治疗NSCLC的理论依据 |
| 3.2 养阴解毒法在中药单药中的研究 |
| 3.3 养阴解毒法在方剂及成药中的研究 |
| 4. 结语 |
| 综述二 糖基化异常与恶性肿瘤诊治的生物学价值研究 |
| 1. O-糖基化、N-糖基化异常与肿瘤发生发展 |
| 1.1 O-糖基化与肿瘤 |
| 1.2 N-糖基化与肿瘤 |
| 2. 糖基转移酶或糖苷酶异常与肿瘤 |
| 3. 糖基化异常的相关蛋白与肿瘤 |
| 3.1 RAGE蛋白 |
| 3.2 CD73蛋白 |
| 4. 糖基化与肿瘤治疗 |
| 4.1 与化学治疗药物 |
| 4.2 与靶向治疗药物 |
| 4.3 与免疫治疗药物 |
| 4.4 新型药物研究 |
| 5. 讨论 |
| 第二部分 临床研究 养阴解毒方联合化疗对NSCLC患者血清中β3GnT8、CD147表达影响的临床研究 |
| 1. 临床观察及研究方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 疗效评价标准 |
| 1.4 统计分析方法 |
| 2. 临床观察结果 |
| 2.1 疾病组与健康组血清中β3GnT8、CD147的表达 |
| 2.2 晚期NSCLC患者血清中β3GnT8、CD147表达水平与疾病转移 |
| 2.3 临床疗效观察 |
| 2.4 安全性评估 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 现代医学β3GnT8、CD147的研究进展 |
| 3.2 “癌毒致病”学说的启示 |
| 3.3 组方分析 |
| 3.4 研究结果分析 |
| 3.5 存在的问题及未来展望 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1: 英文缩略词表(ABBREVIATIONS) |
| 附表2: KPS评分 |
| 附表3: 肺癌中医临床证候积分表 |
| 附表4: 知情同意书 |
| 附表5: 伦理审查批件 |
| 附表6: 病例报告表 |
| 攻读学位期间取得的成果 |
| 致谢 |
（4）新型pH响应的含金属纳米平台用于肿瘤的安全治疗（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 纳米材料概述 |
| 1.2.1 纳米材料简介 |
| 1.2.2 纳米材料分类 |
| 1.3 基于纳米材料的肿瘤治疗 |
| 1.3.1 化学疗法 |
| 1.3.2 光动力疗法 |
| 1.3.3 光热疗法 |
| 1.3.4 化学动力学疗法 |
| 1.3.5 免疫疗法 |
| 1.3.6 协同疗法 |
| 1.4 纳米材料的刺激响应策略在抗肿瘤中的应用 |
| 1.4.1 光响应 |
| 1.4.2 GSH响应 |
| 1.4.3 pH响应 |
| 1.5 立题依据及主要内容 |
| 1.6 参考文献 |
| 第二章 pH敏感的多孔核壳纳米催化剂的构建及抗肿瘤活性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂与仪器 |
| 2.2.2 Cu_2O-PEG NCs的合成 |
| 2.2.3 DOX@Cu_2O-PEG NCs的制备 |
| 2.2.4 Cu和DOX的体外释放检测 |
| 2.2.5 Cu_2O-PEG NCs的降解实验 |
| 2.2.6 溶血现象测定 |
| 2.2.7 ·OH产生介导的MB降解研究 |
| 2.2.8 溶液中的ROS检测 |
| 2.2.9 体外化学动力学活力考察 |
| 2.2.10 细胞摄取评估 |
| 2.2.11 体外毒性研究 |
| 2.2.12 细胞凋亡检测 |
| 2.2.13 活死细胞染色 |
| 2.2.14 线粒体膜电位分析 |
| 2.2.15 细胞划痕实验 |
| 2.2.16 细胞内的H_2O_2检测 |
| 2.2.17 体内生物分布考察 |
| 2.2.18 体内抗肿瘤活性评估 |
| 2.2.19 体内生物安全性研究 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 合成与表征 |
| 2.3.2 pH响应的释放行为 |
| 2.3.3 ·OH产生与细胞外的ROS检测 |
| 2.3.4 细胞内化 |
| 2.3.5 化学动力学活力与细胞毒性 |
| 2.3.6 体内生物分布与抗肿瘤活性 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 参考文献 |
| 第三章 pH激活的自催化纳米反应器的构建及抗肿瘤活性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂与仪器 |
| 3.2.2 DMONs的制备 |
| 3.2.3 COOH-DMONs的合成 |
| 3.2.4 GOx-DMONs的制备 |
| 3.2.5 HT@GOx-DMONs的合成 |
| 3.2.6 Cu和GOx的体外释放评估 |
| 3.2.7 ·OH产生测定 |
| 3.2.8 GSH消耗检测 |
| 3.2.9 催化活力评估 |
| 3.2.10 细胞内化实验 |
| 3.2.11 体外化学动力学活力研究 |
| 3.2.12 线粒体膜电位检测 |
| 3.2.13 细胞毒性评估 |
| 3.2.14 细胞内的GSH和 H_2O_2水平检测 |
| 3.2.15 细胞凋亡检测 |
| 3.2.16 体内抗肿瘤效果 |
| 3.2.17 生物安全性考察 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 合成与表征 |
| 3.3.2 pH响应的·OH产生 |
| 3.3.3 细胞摄取 |
| 3.3.4 化学动力学活力与体外毒性 |
| 3.3.5 体内抗肿瘤活性 |
| 3.4 本章小结 |
| 3.5 参考文献 |
| 第四章 pH触发CD44 靶向的核壳纳米药物的构建及抗肿瘤活性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂与仪器 |
| 4.2.2 PDANPs的合成 |
| 4.2.3 PVP-PDANPs的制备 |
| 4.2.4 NH_2-MIL@PDANPs的合成 |
| 4.2.5 HG-MIL@PDANPs的制备 |
| 4.2.6 溶血现象检测 |
| 4.2.7 光热转换性质测定 |
| 4.2.8 Fe和GOx体外释放实验 |
| 4.2.9 ·OH产生检测 |
| 4.2.10 GSH消耗测定 |
| 4.2.11 催化活力研究 |
| 4.2.12 细胞摄取评估 |
| 4.2.13 体外化学动力学活力 |
| 4.2.14 细胞内的GSH与GSSG比例测定 |
| 4.2.15 细胞内的pH水平 |
| 4.2.16 细胞内的H_2O_2含量测定 |
| 4.2.17 体外毒性评估 |
| 4.2.18 体内成像与抗肿瘤活力研究 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 合成与表征 |
| 4.3.2 体外光热性质 |
| 4.3.3 pH诱发近红外强化的释放 |
| 4.3.4 细胞外·OH产生 |
| 4.3.5 靶向识别 |
| 4.3.6 细胞内的ROS产生与细胞毒性 |
| 4.3.7 体内生物分布与光热效应 |
| 4.3.8 体内抗肿瘤活性 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 本文总结 |
| 5.2 展望 |
| 博士期间科研成果 |
| 致谢 |
（5）鹰嘴豆芽素A基于PI3K/AKT信号通路缓解PM10致急性肺细胞损伤机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 PM_(10)概述 |
| 1.1.1 PM_(10)概念、成分及来源 |
| 1.1.2 PM_(10)对人体健康的影响 |
| 1.1.3 PM_(10)致急性肺细胞损伤的机理研究 |
| 1.2 鹰嘴豆芽素A概述 |
| 1.2.1 鹰嘴豆芽素A概念 |
| 1.2.2 鹰嘴豆芽素A生物活性 |
| 1.2.3 鹰嘴豆芽素A分子作用机制 |
| 1.3 PI3K/AKT信号通路概述 |
| 1.3.1 PI3K/AKT信号通路的传导与调节 |
| 1.3.2 PI3K/AKT信号通路的组成 |
| 1.3.3 PI3K/AKT信号通路调控氧化应激、炎症与免疫 |
| 1.3.4 PI3K/AKT信号通路抑制剂 |
| 1.4 DNA碱基切除修复途径(BER)概述 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 1.6 研究内容和技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第2章 天津市PM_(10)形态学与化学组成成分分析 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验试剂与耗材 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 颗粒物样品采集 |
| 2.2.2 颗粒物粒径分析 |
| 2.2.3 颗粒物中无机元素测定 |
| 2.2.4 颗粒物中水溶性离子测定 |
| 2.2.5 颗粒物中有机化合物测定分析 |
| 2.2.6 天津市PM_(10)颗粒物形态分析 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 天津市PM_(10)粒径分析与确定 |
| 2.3.2 颗粒物中无机元素的测定分析 |
| 2.3.3 天津市PM_(10)颗粒物中水溶性离子测定分析 |
| 2.3.4 颗粒物中有机化合物分析 |
| 2.3.5 天津市PM_(10)形态学分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 PM_(10)诱导因素与呼吸系统损伤相关性分析 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.1.1 PM_(10)成分信息收集 |
| 3.1.2 Chem View DB& ToxRef DB数据库评估PM_(10)成分 |
| 3.1.3 呼吸系统损伤的界定方法 |
| 3.1.4 呼吸系统损伤终点统计分析 |
| 3.1.5 Tox Cast DB数据库评估 |
| 3.1.6 基因分数计算 |
| 3.1.7 二模网络可视化 |
| 3.1.8 生物信息分析 |
| 3.2 实验结果与讨论 |
| 3.2.1 Chem View DB& ToxRef DB数据库评估PM_(10)成分 |
| 3.2.2 致呼吸系统损伤化学成分Tox Cast DB生物活性分析 |
| 3.2.3 PM_(10)诱导因素-呼吸系统损伤二模网络可视化 |
| 3.2.4 Tox Cast?分子靶点生物信息学分析评价 |
| 3.3 本章小结 |
| 第4章 PM_(10)致急性肺细胞损伤研究 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 实验试剂与耗材 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 PM_(10)颗粒物采集 |
| 4.2.2 PM_(10)颗粒物样品的制备 |
| 4.2.3 细胞培养 |
| 4.2.4 染毒母液的制备 |
| 4.2.5 细胞模型构建及处理 |
| 4.2.6 MTT试验 |
| 4.2.7 LDH试验 |
| 4.2.8 DCFH-DA荧光标记细胞内活性氧测定 |
| 4.2.9 氧化损伤相关指标的测定 |
| 4.2.10 炎症因子/介质的测定 |
| 4.2.11 基因表达测定 |
| 4.2.12 数据统计与分析 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 PM_(10)致急性肺细胞损伤作用评价 |
| 4.3.2 BCA安全作用剂量考察 |
| 4.3.3 PM_(10)暴露-BCA保护体外细胞模型的建立 |
| 4.3.4 DCFH-DA细胞内活性氧测定 |
| 4.3.5 BCA抗氧化作用评价 |
| 4.3.6 BCA抗炎作用评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 BCA缓解PM_(10)致急性肺细胞损伤作用机制研究 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.1.1 细胞株 |
| 5.1.2 实验试剂与耗材 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞培养、模型构建及处理 |
| 5.2.2 CRISPR-CAS9 法构建XRCC1 基因敲除BEAS-2B细胞模型 |
| 5.2.3 基因表达测定 |
| 5.2.4 细胞总蛋白提取 |
| 5.2.5 蛋白浓度测定及变性处理 |
| 5.2.6 蛋白质免疫印迹试验 |
| 5.2.7 数据统计与分析 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 BCA抑制PM_(10)致急性肺细胞损伤的生物标志蛋白表达 |
| 5.3.2 BCA调控PI3K/AKT信号通路 |
| 5.3.3 XRCC1 干扰PI3K/AKT信号通路 |
| 5.3.4 BCA介导DNA碱基切除修复BER信号通路 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 全文总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.1.1 全文结论 |
| 6.1.2 论文创新点 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（6）人羊膜上皮细胞修复大鼠卵巢功能不全的实验研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第1章 hAECs的分离、培养、鉴定与生物学特性分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第2章 环磷酰胺诱导大鼠卵巢损伤模型的建立 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第3章 hAECs修复大鼠卵巢功能不全的体内实验 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第4章 hAECs修复大鼠卵巢功能不全的机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 综述 |
| 1 综述一化学治疗引起卵巢功能损伤的机制与治疗措施 |
| 2 综述二羊膜上皮细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）HP-1在保护肾功能和抗肾细胞癌方面的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 一、肾细胞癌的部分研究现状与治疗进展 |
| 二、中药提取物在临床应用中的价值分析 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HP-1减弱CP引起的肾毒性反应保护肾功能 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 HP-1抗肾细胞癌的生物学作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| SCI PaperⅠ |
| SCI PaperⅡ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）基于ZIF-8金属有机框架材料的多功能纳米给药系统的设计及抗肿瘤研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1. 恶性肿瘤与化学治疗 |
| 2. 逆转多药耐药 |
| 3. 光热治疗 |
| 4. 抗肿瘤免疫治疗 |
| 5. 金属有机框架材料 |
| 6. 主动靶向药物递送 |
| 6.1 肿瘤细胞主动靶向药物递送 |
| 6.2 树突细胞主动靶向药物递送 |
| 7. 课题设计与研究内容 |
| 本实验用到的主要材料 |
| 本实验用到的主要仪器 |
| 第一章 基于MOFs纳米载体的盐酸多柔比星/盐酸维拉帕米共给药系统用于克服肿瘤多药耐药、实现靶向抗肿瘤治疗研究 |
| 第一节 基于ZIF-8的肿瘤靶向DOX/VER共给药系统的构建和表征 |
| 一、实验方法 |
| 1. PEG-FA/(DOX+VER)@ZIF-8的制备 |
| 2. PEG-FA/(DOX+VER)@ZIF-8的结构表征 |
| 3. (DOX+VER)@ZIF-8载药量测定 |
| 4. (DOX+VER)@ZIF-8体外释放行为研究 |
| 5. 溶血实验 |
| 二、结果与讨论 |
| 1. PEG-FA/(DOX+VER)@ZIF-8的结构表征 |
| 2. (DOX+VER)@ZIF-8载药量测定 |
| 3. (DOX+VER)@ZIF-8体外释放行为研究 |
| 4. 溶血实验 |
| 三、本节小结 |
| 第二节 基于ZIF-8的肿瘤靶向DOX/VER共给药系统体内、外抗肿瘤评价 |
| 一、实验方法 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. 体外细胞摄取实验 |
| 3. 体外细胞毒性实验 |
| 4. 小鼠黑色素瘤模型的建立 |
| 5. 小鼠体内药物分布研究 |
| 6. 体内抗肿瘤评价 |
| 7. 组织病理学评价 |
| 二、结果与讨论 |
| 1. 体外细胞摄取实验 |
| 2. 体外细胞毒性实验 |
| 3. 小鼠体内药物分布研究 |
| 4. 体内抗肿瘤评价 |
| 5. 组织病理学评价 |
| 三、本节小结 |
| 第一章 小结 |
| 第二章 基于普适性前药策略构建载阿糖胞苷-新吲哚菁绿前药的ZIF-8纳米粒及其在化疗-光热治疗联合抗肿瘤治疗的应用 |
| 第一节 载阿糖胞苷-新吲哚菁绿前药的ZIF-8纳米给药系统的构建和表征 |
| 一、实验方法 |
| 1. Ara-IR820的合成 |
| 2. IR820-COOH和Ara-IR820的结构鉴定 |
| 3. HA/Ara-IR820@ZIF-8的制备 |
| 4. HA/Ara-IR820@ZIF-8的结构表征 |
| 5. HA/Ara-IR820@ZIF-8载药量测定 |
| 6. HA/Ara-IR820@ZIF-8体外光热性能研究 |
| 7. HA/Ara-IR820@ZIF-8体外释放行为研究 |
| 8. 溶血实验 |
| 二、结果与讨论 |
| 1. IR820-COOH和Ara-IR820的合成 |
| 2. HA/Ara-IR820@ZIF-8的结构表征 |
| 3. HA/Ara-IR820@ZIF-8载药量测定 |
| 4. HA/Ara-IR820@ZIF-8体外光热性能研究 |
| 5. HA/Ara-IR820@ZIF-8体外释放行为研究 |
| 6. 溶血实验 |
| 三、本节小结 |
| 第二节 载阿糖胞苷-新吲哚菁绿前药的ZIF-8纳米给药系统体内、外抗肿瘤评价 |
| 一、实验方法 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. 体外细胞摄取实验 |
| 3. 体外细胞毒性实验 |
| 4. 小鼠荷4T1瘤模型的建立 |
| 5. 小鼠体内药物分布研究 |
| 6. 小鼠体内升温实验 |
| 7. 体内抗肿瘤评价 |
| 8. 组织病理学评价 |
| 二、结果与讨论 |
| 1. 体外细胞摄取实验 |
| 2. 体外细胞毒性实验 |
| 3. 小鼠体内药物分布研究 |
| 4. 小鼠体内升温实验 |
| 5. 体内抗肿瘤评价 |
| 6. 组织病理学评价 |
| 三、本节小结 |
| 第二章 小结 |
| 第三章 任务特异性MOFs混合纳米粒用于肿瘤细胞靶向治疗和树突细胞靶向免疫调节协同增强抗肿瘤免疫治疗的研究 |
| 第一节 任务特异性金属有机框架给药系统的构建和表征 |
| 一、实验方法 |
| 1. HA/IR820@ZIF-8的制备 |
| 2. MAN/(R837+1MT)@ZIF-8的制备 |
| 3. HA/IR820@ZIF-8和MAN/(R837+1MT)@ZIF-8的结构表征 |
| 4. HA/IR820@ZIF-8载药量测定 |
| 5. MAN/(R837+1MT)@ZIF-8载药量测定 |
| 6. HA/IR820@ZIF-8和IR820体外光热性能研究 |
| 7. 溶血实验 |
| 二、结果与讨论 |
| 1. HA/IR820@ZIF-8和MAN/(R837+IMT)@ZIF-8的结构表征 |
| 2. HA/IR820@ZIF-8载药量测定 |
| 3. MAN/(R837+1MT)@ZIF-8载药量测定 |
| 4. HA/IR820@ZIF-8和IR820体外光热性能研究 |
| 5. 溶血实验 |
| 三、本节小结 |
| 第二节 任务特异性金属有机框架给药系统的体外评价 |
| 一、实验方法 |
| 1. B16F10细胞培养 |
| 2. B16F10细胞对HA/IR820@ZIF-8纳米粒的摄取实验 |
| 3. HA/IR820@ZIF-8对B16F10细胞的细胞毒性实验 |
| 4. B16F10细胞凋亡实验 |
| 5. B16FI0细胞ICD检测 |
| 6. 小鼠骨髓来源树突细胞(BMDCs)的分离和培养 |
| 7. BMDCs细胞摄取实验 |
| 8. MAN/(R837+1MT)@ZIF-8的IDO抑制能力 |
| 9. 体外DCs刺激成熟实验 |
| 二、结果与讨论 |
| 1. B16F10细胞对HA/IR820@ZIF-8纳米粒的摄取实验 |
| 2. HA/IR820@ZIF-8对B16F10细胞的细胞毒性实验 |
| 3. B16F10细胞凋亡实验 |
| 4. B16F10细胞ICD检测 |
| 5. BMDCs细胞摄取实验 |
| 6. MAN/(R837+1MT)@ZIF-8的IDO抑制能力 |
| 7. 体外DCs刺激成熟实验 |
| 三、本节小结 |
| 第三节 基于任务特异性金属有机框架混合纳米给药系统体内抗肿瘤评价 |
| 一、实验方法 |
| 1. 体内单边抗肿瘤实验 |
| 2. 体内双边抗肿瘤实验 |
| 二、结果与讨论 |
| 1. 体内单边抗肿瘤实验 |
| 2. 体内双边抗肿瘤实验 |
| 三、本节小结 |
| 第三章 小结 |
| 全文总结与展望 |
| 一、全文总结 |
| 二、创新 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
| 一、已发表论文 |
| 二、申请专利 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（9）自噬流损伤介导Caspase-8非经典活化增加神经胶质瘤细胞替莫唑胺敏感性的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 神经胶质瘤的病理分型及治疗进展 |
| 2.1.1 神经胶质瘤概述 |
| 2.1.2 神经胶质瘤病理分型 |
| 2.1.3 神经胶质瘤的治疗 |
| 2.2 胶质瘤与自噬 |
| 2.2.1 自噬概述 |
| 2.2.2 自噬的在胶质瘤中的促癌作用 |
| 2.2.3 自噬在胶质瘤中的抑癌作用 |
| 2.3 胶质瘤与Caspase-8 |
| 2.3.1 Caspase-8 结构 |
| 2.3.2 Caspase-8 在胶质瘤中的表达和功能 |
| 2.3.3 Caspase-8 作为治疗靶点 |
| 2.4 p62与Caspase-8 的交互在胶质瘤中的作用 |
| 2.4.1 p62 的结构及功能 |
| 2.4.2 p62与Caspase-8 介导的凋亡 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 实验用细胞系 |
| 3.1.4 实验用质粒 |
| 3.2 实验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 细胞复苏 |
| 3.3.2 细胞培养与传代 |
| 3.3.3 细胞冻存 |
| 3.3.4 质粒提取 |
| 3.3.5 细胞转染 |
| 3.3.6 RNA提取 |
| 3.3.7 RNA逆转录 |
| 3.3.8 qPCR |
| 3.3.9 总蛋白提取 |
| 3.3.10 蛋白浓度测定 |
| 3.3.11 蛋白样品制备 |
| 3.3.12 Western Blotting |
| 3.3.13 免疫共沉淀 |
| 3.3.14 间接免疫荧光 |
| 3.3.15 细胞自噬流量测定 |
| 3.3.16 Caspase-8 活性检测 |
| 3.3.17 Caspase-3 活性检测 |
| 3.3.18 免疫组化染色 |
| 3.3.19 TUNEL凋亡染色 |
| 3.3.20 实验动物体内验证实验 |
| 3.3.21 统计学方法 |
| 第4章 实验结果 |
| 第一部分 自噬相关蛋白p62及Caspase-8 的表达与神经胶质瘤患者预后相关 |
| 4.1.1 自噬流相关基因以及Caspase-8 在胶质瘤中高表达,并且与不良临床预后相关 |
| 第二部分 自噬流阻断引起p62 介导Caspase-8 活化增加胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性 |
| 4.2.1 筛选不同基础自噬流胶质瘤细胞系 |
| 4.2.2 TMZ诱导Caspase-8 激活并抑制胶质瘤细胞活性 |
| 4.2.3 TMZ显着增加胶质瘤细胞的自噬流量 |
| 4.2.4 CQ阻断自噬流量增加TMZ诱导的凋亡和增殖抑制 |
| 第三部分 堆积的自噬体膜提供平台促进p62 活化Caspase-8 |
| 4.3.1 自噬流阻断促进p62和Caspase-8 的相互作用 |
| 4.3.2 自噬流阻断促进Caspase-8 在自噬体膜的定位 |
| 4.3.3 Caspase-8 的激活依赖于p62的UBA及 LIR结构域 |
| 第四部分 体内实验中CQ增加TMZ对胶质瘤组织的生长抑制 |
| 4.4.1 体内验证CQ增加TMZ对胶质瘤的抑制作用及机制 |
| 4.4.2 不同自噬流情况下TMZ诱导的自噬在胶质瘤死亡中的作用机制模式图 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）基于免疫调控的贞芪扶正颗粒促造血及抗结直肠癌活性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词索引表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 中成药的研究现状 |
| 1.1.1 中成药的简要概述 |
| 1.1.2 中成药的生物学功能 |
| 1.2 贞芪扶正颗粒的研究现状 |
| 1.3 中成药在免疫调控中的应用 |
| 1.3.1 中成药对免疫器官的影响 |
| 1.3.2 中成药对免疫细胞的影响 |
| 1.3.3 中成药对细胞因子的影响 |
| 1.4 现代医学对化疗后骨髓抑制的概述 |
| 1.4.1 化疗诱导的骨髓抑制及发病机制 |
| 1.4.2 骨髓抑制疾病模型的建立方法 |
| 1.4.3 氧化应激对骨髓造血的影响 |
| 1.4.4 骨髓中幼稚细胞对骨髓造血的影响 |
| 1.4.5 造血微环境对骨髓造血的影响 |
| 1.4.6 免疫调控与骨髓造血的关系 |
| 1.5 结直肠癌概述 |
| 1.6 本课题研究目的、意义及内容 |
| 1.6.1 研究背景、目的及意义 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 第二章 贞芪扶正颗粒代表性成分检测 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 色谱条件 |
| 2.3.2 对照品的配制 |
| 2.3.3 样品溶液的配制 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 ZQFZ中红景天苷含量 |
| 2.4.2 ZQFZ中毛蕊异黄酮苷含量 |
| 2.4.3 ZQFZ中女贞苷含量 |
| 2.4.4 ZQFZ中芒柄花苷含量 |
| 2.4.5 ZQFZ中槲皮素含量 |
| 2.4.6 ZQFZ中芒柄花素含量 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 贞芪扶正颗粒对健康小鼠机体功能的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验仪器与材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 动物的给药方案 |
| 3.3.2 小鼠体重及脏器指数 |
| 3.3.3 自主活动实验 |
| 3.3.4 抗疲劳转棒实验 |
| 3.3.5 小鼠耐力跑实验 |
| 3.3.6 负重游泳实验 |
| 3.3.7 生化指标检测 |
| 3.3.8 小鼠脏器病理学分析 |
| 3.3.9 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 ZQFZ对小鼠的体重和脏器指数的影响 |
| 3.4.2 ZQFZ对小鼠动物行为学的影响 |
| 3.4.3 H&E染色对脏器病理学变化的观察 |
| 3.4.4 生化指标的测定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 贞芪扶正颗粒在免疫抑制小鼠中提升免疫力功能的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器与材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 细胞及抗体 |
| 4.2.4 实验动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.2 动物模型的建立及治疗方案 |
| 4.3.3 ZQFZ免疫调节活性的研究 |
| 4.3.4 ZQFZ对免疫相关因子水平的检测 |
| 4.3.5 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 ZQFZ对免疫抑制小鼠体重和脏器指数的影响 |
| 4.4.2 ZQFZ对免疫抑制小鼠NK细胞杀伤活性的影响 |
| 4.4.3 ZQFZ对免疫抑制小鼠脾脏形态结构的影响 |
| 4.4.4 ZQFZ对免疫抑制小鼠血清中免疫球蛋白水平的影响 |
| 4.4.5 ZQFZ对免疫抑制小鼠血清中细胞因子水平的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 基于免疫调控的贞芪扶正颗粒在骨髓抑制小鼠中促造血功能的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验仪器与材料 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验材料 |
| 5.2.3 细胞及抗体 |
| 5.2.4 试剂的配制 |
| 5.2.5 实验动物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 ZQFZ体外造血功能活性的研究 |
| 5.3.2 ZQFZ促骨髓抑制小鼠造血功能修复的研究 |
| 5.3.3 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 ZQFZ对体外造血细胞功能活性的影响 |
| 5.4.2 ZQFZ对骨髓抑制小鼠造血功能活性的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 基于免疫调控的贞芪扶正颗粒抑制结直肠癌生长的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验仪器与材料 |
| 6.2.1 实验仪器 |
| 6.2.2 实验材料 |
| 6.2.3 抗体 |
| 6.2.4 实验动物 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 动物模型的建立及治疗方案 |
| 6.3.2 血液及组织样本收集 |
| 6.3.3 脏器指数 |
| 6.3.4 外周血细胞计数 |
| 6.3.5 小鼠血液细胞的分离 |
| 6.3.6 小鼠组织病理学观察 |
| 6.3.7 ELISA检测 |
| 6.3.8 统计学分析 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 ZQFZ对结直肠癌小鼠体重和脏器指数的影响 |
| 6.4.2 ZQFZ对结直肠癌小鼠外周血细胞数的影响 |
| 6.4.3 ZQFZ对结直肠癌小鼠血液中T淋巴细胞的影响 |
| 6.4.4 ZQFZ对结直肠癌小鼠血液中NK细胞的影响 |
| 6.4.5 ZQFZ对小鼠结直肠肿瘤形成的影响 |
| 6.4.6 ZQFZ对结直肠癌小鼠结直肠和脏器组织形态的影响 |
| 6.4.7 ZQFZ对结直肠癌小鼠血清和结直肠中细胞因子表达水平的影响 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 本章小结 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 展望 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、40种化学治疗药物使用说明书的分析及临床指导（论文参考文献）
- [1]石斛提取物毛兰素对人结直肠癌细胞的干预作用及机制研究[D]. 孙一涵. 长春中医药大学, 2021(01)
- [2]食管鳞癌和贲门腺癌中拷贝数扩增基因的筛选及功能研究[D]. 郭文佳. 北京协和医学院, 2021
- [3]养阴解毒方联合化疗对NSCLC患者血清中β3GnT8、CD147表达影响的临床研究[D]. 翟韵怡. 南京中医药大学, 2021(01)
- [4]新型pH响应的含金属纳米平台用于肿瘤的安全治疗[D]. 吴鸿帅. 东南大学, 2020
- [5]鹰嘴豆芽素A基于PI3K/AKT信号通路缓解PM10致急性肺细胞损伤机制研究[D]. 王君宇. 天津大学, 2020(02)
- [6]人羊膜上皮细胞修复大鼠卵巢功能不全的实验研究[D]. 张玉林. 重庆医科大学, 2020(01)
- [7]HP-1在保护肾功能和抗肾细胞癌方面的作用及机制研究[D]. 方量. 山东大学, 2020(10)
- [8]基于ZIF-8金属有机框架材料的多功能纳米给药系统的设计及抗肿瘤研究[D]. 张会苑. 山东大学, 2020(10)
- [9]自噬流损伤介导Caspase-8非经典活化增加神经胶质瘤细胞替莫唑胺敏感性的机制研究[D]. 贺宜春. 吉林大学, 2020(08)
- [10]基于免疫调控的贞芪扶正颗粒促造血及抗结直肠癌活性的研究[D]. 初秋博. 吉林大学, 2020(08)