一、利用IgA蛋白酶β结构域为骨架构建细菌表面展示随机肽库（论文文献综述）
黄艳[1]（2021）在《Hc-nas-33参与捻转血矛线虫蜕皮过程的功能及其分子机制初步研究》文中研究指明捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是一种寄生于牛、羊、骆驼等反刍动物皱胃中的吸血性寄生虫,在我国呈广泛性流行,给中国的畜牧业造成重大经济损失。抗蠕虫药物对于捻转血矛线虫病有良好的治疗效果,但近年来耐药株频繁出现,增加了该病防治的难度。线虫生命调控关键基因作为新型药物靶点的筛选及抗蠕虫药物开发是目前捻转血矛线虫病防控的重要研究方向。蜕皮是线虫生长发育过程中必经的生命过程,当该过程发生障碍时,可影响虫体的正常发育,降低活动能力,甚至导致幼虫死亡,因此探明蜕皮作用机制及相关基因的生物学功能,对于该病的防控至关重要。本研究从已公布的捻转血矛线虫转录组数据库中筛选了 3种线虫虾红素样蛋白基因（Nematode astacin,NAS）,扩增获得了 Hc-nas-5、Hc-nas-31和Hc-nas-33基因全长,并对其结构域和分子进化关系进行了预测分析;在HEK 293T细胞、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和捻转血矛线虫中观察了 HcNASs的表达特性;利用转录特性分析和RNA干扰试验探究了Hc-nas-33在捻转血矛线虫生长发育过程中发挥的功能;构建了捻转血矛线虫酵母cDNA文库,并筛选得到Hc-NAS-33的候选互作蛋白鸟嘌呤核苷酸结合蛋白 β 亚基-1（Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-1,GPB-1）,验证了两者的互作关系;并对Hc-GPB-1在蜕皮过程中的功能进行了研究。实验结果为深入研究捻转血矛线虫蜕皮机制奠定了基础,同时也为新药开发提供了潜在的药物靶点。1.捻转血矛线虫HcNASs基因特性分析通过扩增获得捻转血矛线虫3个虾红素样蛋白基因Hc-nas-5、Hc-nas-31和Hc-nas-33的全长DNA及mRNA序列,利用生物信息学软件预测分析基因结构、蛋白功能和分子进化关系;并构建原核表达载体获得重组蛋白,制备多克隆抗体。实验结果表明,3个HcNASs均有典型的锌金属蛋白酶结构域,此外Hc-NAS-31还具有1个CUB结构域和1个SXC结构域,Hc-NAS-33具有1个EGF结构域和1个CUB结构域;Hc-NAS-5和Hc-NAS-31具有C端信号肽。利用pET原核表达系统成功表达了 HcNASs重组蛋白,通过免疫实验动物获得了特异性较好的多克隆抗体。本研究扩增得到3种HcNASs基因对其进行了生物信息学分析,制备了多克隆抗体,可用于后续蛋白表达特性分析。2.HcNASs表达特性分析为了全面分析HcNASs的表达特性,本研究首先通过构建真核表达载体,转染HEK293T细胞,分析其在真核细胞中的定位情况;构建异源表达质粒,通过显微注射获得重组转基因虫株,探究在秀丽隐杆线虫中的表达情况;利用制备的多克隆抗体,通过幼虫间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence,IFA）和L4及成虫免疫组织荧光（Immunohistofluorescence,IHF）分析在捻转血矛线虫中的表达特性。实验结果显示3种HcNASs均表达于HEK 293T细胞质中;在秀丽隐杆线虫中,Hc-NAS-5只表达于咽部和尾部极少数细胞中,Hc-NAS-31不能表达,Hc-NAS-33表达于咽部与肠道内;在捻转血矛线虫中,Hc-NAS-5和Hc-NAS-31定位于L3上皮合胞体,而在成虫中Hc-NAS-5和Hc-NAS-31表达模式缺乏特异性,广泛分布于多种虫体组织,Hc-NAS-33特异性表达于肠道与肌肉接触面、子宫膜和未成熟虫卵外周。本研究明确了 HcNASs的表达特性,为后续的功能研究指明了方向。3.Hc-nas-33在捻转血矛线虫蜕皮发育过程中的功能研究为了探究Hc-nas-33是否参与捻转血矛线虫蜕皮过程,本研究利用实时荧光定量 PCR（Quantitative real time PCR,qRT-PCR）分析了Hc-nas-3在不同时段内的转录特性,同时也进行了秀丽隐杆线虫同源基因的比较性研究,其次运用RNA干扰方法探究Hc-nas-33沉默后对捻转血矛线虫生长发育的影响。转录特性分析结果显示,Hc-nas-33转录水平在捻转血矛线虫L1-L2蜕皮过程中呈振荡变化,且在中后期达到峰值,Ce-nas-33基因在蜕皮过程中同样表现振荡转录特性;RNA干扰后,幼虫正常生长发育受到严重影响,虫体出现发育迟缓、活动力下降、畸形及蜕皮功能障碍等表型。上述结果证明Hc-nas-33为捻转血矛线虫蜕皮相关基因,为后续研究捻转血矛线虫蜕皮机制、开发新药物奠定了基础。4.捻转血矛线虫酵母cDNA文库构建及Hc-nas-33互作蛋白的筛选鉴定为了进一步探索Hc-nas-33参与蜕皮过程的分子机制,本研究构建了捻转血矛线虫酵母cDNA文库,并利用酵母双杂交系统筛选与Hc-NAS-33存在相互作用的候选蛋白;通过pull down、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,CO-IP）与真核细胞共定位验证Hc-NAS-33与互作蛋白之间关系。酵母文库筛选发现了 6种可能与Hc-NAS-33存在相互作用的候选蛋白;利用昆虫细胞杆状病毒系统成功表达 GST-Hc-NAS-33 重组蛋白,通过 pull down 验证了 Hc-NAS-33 与 Hc-GPB-1存在相互作用,与免疫共沉淀结果相符,且Hc-NAS-33在HEK 293 T细胞中能与Hc-GPB-1共定位。本研究成功筛选得到Hc-NAS-33的互作蛋白,为后续研究其在捻转血矛线虫蜕皮过程中的功能奠定了基础,有助于更好的了解线虫蜕皮分子机制。5.Hc-NAS-33与Hc-GPB-1参与蜕皮过程的机制研究本研究借助秀丽隐杆线虫表达系统,分析Hc-NAS-33和Hc-GPB-1在线虫中的共定位情况,同时利用RNA干扰技术研究Hc-GPB-1在捻转血矛线虫生长发育过程中发挥的功能。结果表明,在秀丽隐杆线虫中异源表达的Hc-NAS-33和Hc-GPB-1存在部分共定位;Hc-gpb-1沉默后,幼虫同样出现发育迟缓、活动性下降及蜕皮功能障碍等表型,且降低Hc-gpb-1表达水平使得虫体新皮的厚度受到影响,表皮、皮下与肌肉之间的紧密连接出现缝隙,相关基因的qRT-PCR进一步验证了以上结果。本研究发现在蜕皮过程中Hc-NAS-33与Hc-GPB-1均参与了新皮的合成,这为进一步阐明捻转血矛线虫蜕皮机制提供了重要依据,同时也为捻转血矛线虫药物研发提供了新的候选药物靶标。综上所述,本研究扩增得到了 3种捻转血矛线虫HcNASs基因,并对其进行生物信息学分析,明确了其蛋白表达特性。通过转录特性分析和RNA干扰实验对Hc-nas-33进行深入研究,发现该基因参与捻转血矛线虫的蜕皮过程;利用酵母双杂交系统筛选获得6种Hc-NAS-33的候选互作蛋白,并验证了与Hc-GPB-1的互作关系;通过异源表达和RNA干扰对Hc-NAS-33及其互作蛋白Hc-GPB-1在捻转血矛线虫蜕皮过程的发挥的生物学功能进行了研究。上述结果为捻转血矛线虫蜕皮机制研究奠定了基础,同时为捻转血矛线虫病的防治提供了新的思路。
黎素焕[2]（2020）在《DCTN4与PD-L1的结合及其对DLD1细胞增殖、迁移、集落形成的影响研究》文中指出细胞程序性死亡配体-1（Programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1）是一种免疫检查点蛋白,肿瘤细胞表面的PD-L1与T细胞表面的细胞程序性死亡受体-1（Programmed cell death protein 1,PD-1）的结合帮助肿瘤细胞逃避免疫监察。通过PD-1或PD-L1抗体来阻断PD-1与PD-L1的结合,重新激活T细胞免疫功能,是一种重要的癌症免疫治疗策略,为大量癌症患者提供了显着的生存优势。目前,已有多种靶向PD-1/PD-L1的抗体被FDA批准用于癌症的临床治疗,但对PD-L1调控机制的了解仍然有限,限制了此类免疫疗法临床疗效的提升。本研究旨在通过预测PD-L1的结合蛋白,发现PD-L1的新调控机制。本研究以寻找PD-L1的结合蛋白为出发点,利用噬菌体表面展示技术筛选与PD-L1结合的多肽,并根据多肽序列进行比对,寻找可能与PD-L1结合的蛋白。经过筛选,获得了5个与PD-L1结合的含有12个氨基酸残基的多肽。经过NCBI数据库检索后发现,多肽D4与动力蛋白激活蛋白亚基4（Dynactin 4,DCTN4）匹配。经研究发现,D4融合溶酶体分选信号表达时,使PD-L1的表达水平明显下调,提示PD-L1结合D4融合多肽后被靶向溶酶体降解,D4具有作为靶向PD-L1的治疗性药物的潜力。此外,我们利用外源表达的DCTN4与PD-L1进行Co-IP分析,证实了DCTN4与PD-L1可以在细胞内形成复合体,且DCTN4至少有两个结构域可能参与了与PD-L1胞内复合体的形成。DCTN4在人体多种正常组织中广泛表达,如脑、肾、肝等,具有重要生理功能。经过检测,我们发现DCTN4在肿瘤细胞DLD1、DKS8、HKE3、HCT-116、Hep3B、PLC、5637及MGC-803中均有表达。同时,我们在DLD1稳转细胞系中探究了DCTN4过表达对DLD1细胞增殖、迁移、集落形成的影响,发现DCTN4过表达不影响DLD1细胞的集落形成能力,但却能够明显抑制DLD1细胞的增殖和迁移能力。表明DCTN4对DLD1细胞的部分细胞功能有调控作用,但是否通过与PD-L1形成复合体而发挥作用还有待进一步探究。本研究将为发现靶向PD-L1的多肽类药物以及PD-L1的调控机制提供方向,同时也为发现癌症治疗新方法奠定基础。
林平[3]（2019）在《噬菌体展示技术筛选双环肽配体》文中指出双环肽是非常具有吸引力的骨架分子,可以用于设计有效的蛋白结合配体以及新型的多肽治疗药物。双环肽主要包括自然界中富含二硫键的多肽以及通过有机小分子交联的合成肽。虽然近年来基于自然界富含二硫键的多肽骨架开发了许多蛋白结合配体,但是由于天然多肽序列的保守性,因此在针对新的靶标蛋白发展结合配体时具有一定的难度。而体外通过有机小分子交联的双环肽的结构刚性随着序列长度的增加而显着降低,特别是那些缺乏α螺旋、β折叠二级结构以及疏水核心的多肽,这不利于得到与蛋白具有高亲和力的双环肽配体。因此,具有有序的空间结构并且耐受序列改造的新型双环肽骨架分子对于设计有效的蛋白结合配体具有重要的意义。本论文通过噬菌体展示技术针对靶标蛋白MDM2筛选后得到了一类具有有序但不规则二级结构的双环肽骨架分子。这些多肽具有保守的半胱氨酸/脯氨酸框架结构,可以指导多肽氧化折叠形成具有一个310螺旋和四个不规则转角的熔环型双环肽。本论文共分为三章,主要内容如下:第一章:首先介绍了多肽在靶向蛋白质-蛋白质相互作用界面中的潜力、环肽限制性结构带来的优势以及环肽药物的发展。其次综述了自然界富含二硫键的多肽的结构特点以及药理活性。然后主要介绍了两种发展新型环肽结合配体的方法:基于自然界富含二硫键的多肽骨架的表位嫁接;构建噬菌体展示随机肽库针对感兴趣的靶标进行亲和筛选。最后在相关研究背景基础上提出本论文的研究思路和意义。第二章:通过噬菌体展示双环肽库（骨架序列:GCXCX5CX5C）针对靶标蛋白MDM2进行筛选,实验组单克隆菌落基因测序后得到了一组具有保守序列的多肽。随机挑选部分序列进行体外合成,氧化折叠后通过荧光偏振竞争实验测定双环肽产物与MDM2的结合活性。结果发现这组含有四个半胱氨酸的多肽可以精准配对,生成单一的折叠产物（产率>90%）,双环肽产物与靶标蛋白的亲和力都在纳摩尔级别（Ki=62～1450 nM）。第三章:氨基酸突变实验和NMR结构表征揭示了序列中规则嵌入的脯氨酸对半胱氨酸残基的精准配对和最终刚性有序的双环结构具有关键作用。pb-13和pb-18的NMR实验结果表明它们的结构中含有一个310螺旋以及4个不规则的转角。两条双环肽具有相似的构象并展示出整体的结构刚性,刚性结构主要通过两对二硫键,四个主链氢键和保守的脯氨酸共同驱动。最后,对本文的研究内容进行了总结和展望。
朱鸿运[4]（2019）在《葡聚糖接枝型四肽仿生层析介质的制备与抗体分离纯化的研究》文中认为近年来,随着上游抗体细胞表达技术的提高和培养规模的扩大,以及抗体药物的高纯度要求和分离纯化工艺的复杂性,蛋白A亲和层析作为下游抗体捕获的平台技术,因价格昂贵、洗脱苛刻、介质利用率低等不足限制了其在抗体大规模分离纯化的应用。短肽仿生亲和层析作为一种新型的抗体分离层析技术,因其低成本、高稳定性、低免疫原性、高选择性和洗脱条件温和等优点,是潜在的蛋白A亲和层析的替代技术,具有良好的应用前景。为了进一步提高短肽仿生层析介质的动态结合载量,引入葡聚糖接枝制备高载量的葡聚糖接枝型短肽亲和层析介质以提高介质对目标蛋白的平衡吸附容量和传质速率是改善介质性能的新途径。本文主要研究了葡聚糖接枝型四肽仿生层析介质的制备及其抗体吸附性能和分离性能,并对比非接枝四肽仿生层析介质的实验结果,分析葡聚糖接枝对短肽仿生层析的影响,为短肽仿生层析介质的改进提供新思路。本文的主要研究内容和取得的结果如下:首先以Ac-YFRH为功能配基,交联葡聚糖琼脂糖基质Bestarose XL为基质,采用HATU法制备了不同配基密度的葡聚糖接枝型四肽仿生层析介质Ac-YFRH-XL,考察了介质对hIgG、BSA和Fc融合蛋白的静态吸附性能。实验结果表明Ac-YFRH-XL介质对hIgG的吸附是疏水相互作用和静电相互作用共同主导,在pH 9.0时吸附容量可达133 mg/g介质,在pH 5.0无吸附,同时对氯化钠和辛酸钠表现出较好的耐盐性。Ac-YFRH-XL介质对BS A的吸附主要基于静电相互作用,在pH 5.0时非特异性吸附最高。相同配基密度的Ac-YFRH-XL介质对Fc融合蛋白比hIgG有更高的吸附容量和结合能力,符合前期基于配基和抗体Fc片段间主要结合位点的计算机模拟结果。引入葡聚糖接枝可以增加介质的配基偶联密度从而提高其对抗体的吸附容量和结合能力,较非接枝四肽层析介质有优势。接着考察了葡聚糖接枝型四肽仿生层析介质Ac-YFRH-XL对hIgG和BSA的动态吸附性能。结果表明介质在pH9.0时对hIgG的动态结合载量（Q10%）可达36.8mg/mL,约2.5倍于非接枝Ac-YFRH-4FF介质的14.9 mg/mL,同时该条件下介质对BSA无吸附。Ac-YFRH-XL介质在低盐条件（NaC1≤0.2 M）下对抗体有较好的结合能力,高盐条件下几乎无吸附,耐盐性弱于非接枝层析介质。此外,在高于非接枝介质的最大偶联密度的一定配基密度范围内,葡聚糖接枝Ac-YFRH-XL介质对抗体的结合载量随之增加,显着增加了介质在更大规模分离中的应用潜力。最后探究了葡聚糖接枝Ac-YFRH-XL介质对实际料液体系的分离性能。在pH9.0条件下从混合蛋白（hIgG:BSA=1:4）体系中分离hIgG得到抗体的纯度和收率分别为98.7%和89%;在pH9.0条件下从CHO培养上清液中分离单抗得到单抗纯度和收率分别为93.0%和84.7%,相较于非接枝Ac-YFRH-4FF介质具有相似的分离效率,但葡聚糖接枝Ac-YFRH-XL介质能达到更高的处理量,显示了其在更大规模体系中的分离潜力。
杨颖[5]（2016）在《大肠杆菌Nissle 1917无质粒克隆菌株鞭毛表面展示功能探析》文中研究说明大肠杆菌Nissle 1917 （Escherichia coli Nissle 1917;EcN）是德国医生Alfred Nissle于1917年从一名抗腹泻士兵粪便中首次分离出的一株益生菌,由于肠道内存在该株“强大效能且具有拮抗活性”的大肠杆菌,该士兵免受肠道传染病流行区疾病的侵扰。随后,在德国和其他一些欧洲国家,EcN作为人用药Mutaflor（?）的活性成分,在治疗各种肠道疾病中扮演着重要角色。近年来,EcN表达外源基因作为疾病诊治载体的研究越来越多,其内含的pMUT2、I型分泌系统以及V型分泌系统等皆用于将外源抗原展呈于EcN表面。鞭毛表面展示属于细菌表面展示技术之一,其基于鞭毛蛋白的高变区可容纳外源多肽且组装成鞭毛丝进而实现外源多肽的表面展示。鞭毛表面展示技术较多在报道沙门氏菌中,而未曾在EcN菌株中探索研究。鉴于EcN是强大效能益生菌,本研究首先构建了EcN无质粒克隆菌株EcNc （EcN cured of its two cryptic plasmids pMUT1 and pMUT2; EcNc）,以其鞭毛蛋白高变区为切入点来探讨EcNc鞭毛表面展示。EcN中含有pMUT1、pMUT2两个隐秘大质粒,且2个质粒在传代中很稳定,不易丢失；pMUT1带有ColE1类型复制系统,pMUT2含有类ColE2复制系统,然而对这2个隐秘大质粒的生物学意义了解较少。有研究报道大肠杆菌的致病性受到质粒的调控,且部分大肠杆菌菌株的抗性基因也可能与其隐秘质粒有关。为减少上述隐秘质粒对外源性重组质粒转化和基因组DNA操作带来的不便,同时考虑EcN作为载体菌时其隐秘质粒对人和宿主动物可能产生的副作用,本试验使用限制性内切酶Sph I将携带sacB的自杀性质粒载体pRE112分别与隐秘质粒pMUT1、pMUT2连接,构建重组质粒载体pMUT1-pRE112和pMUT2-pRE112,进一步应用竞争性抑制分别去除EcN自身携带的隐秘质粒,基于自杀性质粒sacB基因的特性,在含10%蔗糖的培养基平板上实施自杀质粒自身消除,最后获得EcN无质粒克隆菌株即EcN△pMUT1△ApMUT2,命名为EcNc （EcN cured of its twocryptic plasmids pMUT1 and pMUT2）对无质粒菌株EcNc生长状况、生化试验、电镜观察以及体外细胞黏附检测,试验结果表明去除两个隐秘大质粒后的EcNc,其生长、生化特性、血清学、形态学特征、体外细胞黏附与原型EcN一致,利用获得的EcNc菌株,将更加方便质粒的转化和遗传相关生物学操作。基于编码EcN菌株鞭毛蛋白的fliC基因序列,利用λ噬菌体Red同源重组系统对EcNc菌株的fliC基因进行敲除。首先纯化回收含有fliC基因同源臂片段和氯霉素抗性基因（cat）表达盒的PCR扩增产物,电转化至已携带pKD46质粒的EcNc菌株中,在Red同源重组酶Gam、Exo、Beta的作用下,PCR回收片段通过两翼同源序列与染色体对应靶基因序列同源重组,在氯霉素抗性平板上筛选到一次同源重组菌株EcNc △fliC::cat。再将质粒pCP20电转化EcNc △fliC::cat菌株,通过其在42℃C表达的Flp重组酶消除PCR片段中FRT位点之间的氯霉素抗性基因。经过PCR鉴定和DNA测序证明二次重组菌,即fliC缺失菌株EcNc △fliC构建成功。将pBR322-fliC电转化EcNc △fliC构建了回补菌株EcNc △fliC/pBR322-fliC。同时,以构建好的pU18-fliC重组质粒为模板,通过反向PCR分别构建了鞭毛蛋白基因859-888位、829-858位缺失的片段fliC1、fliC2,双酶切后连接到自杀载体pRE112中,构建重组自杀载体pRE 112-fliC1、pRE112-fliC2,将其分别导入EcNc菌株中,通过一次重组、二次重组及DNA测序筛选到EcNc鞭毛蛋白基因部分高变区缺失的菌株EcNcfliC1、EcNcfliC2。上述EcNc、EcNc △fliC、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1、EcNc fliC2的成功构建,旨在进一步探索鞭毛蛋白高变区序列改变对EcNc性状的影响。测试EcNc、EcNc △fliC、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1、EcNcfliC2的生长性能、运动性、鞭毛的抗原性、鞭毛形成以及体外细胞黏附、体内肠道定植能力。结果显示,各株细菌生化特性一致,生长性能没有差异变化；EcNc △fliC在半固体培养基上无运动性能,Western blot检测不到鞭毛蛋白的表达,且电镜下观察不到鞭毛形态,其对IPEC-J2的黏附能力相对于EcNc则下降64%（p=0.002）、相对于EcNc fliC1下降52%（p=0.018）、相对于EcNc fliC2下降50%（p=0.01）。EcNc △fliC回补菌株EcNc △filC/pBR322-fliC与EcNc的特性相一致,对IPEC-J2的黏附能力恢复到EcNc的黏附水平；用Western blot能检测到EcNc fliC1、EcNc fliC2鞭毛蛋白的表达,电镜下亦能观察到鞭毛丝,但它们在半固体培养基上几乎不能运动,EcNc fliC1、EcNc fliC2对IPEC-J2的黏附能力相对于EcNc则分别下降26%（p=0.124）,29%（p=0.586）,差异不显着；但EcNc fliC1对IPEC-J2的黏附能力比EcNc △fliC高52%（p=0.018）,EcNc fliC2对IPEC-J2的黏附能力比EcNc △fliC高50%（p=0.01）。在体内肠道定植试验中,接种后第1 d、第3 d、第7d取样检测,各组细菌在同一肠段（回肠、盲肠或结肠）的定植能力无显着差异；但各组细菌在盲肠的定植数量高于各自在回肠和结肠的定植,尤其是接种后第1 d, EcNc/pBR322、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1/pBR322、EcNc filC2/pBR322在盲肠的定植显着高于其各自在回肠的定植数量。EcNc还具有F1A、F1C和卷曲菌毛等黏附因子,他们也共同介导和促进细菌在动物体内的定植,使得EcNc △filC/pBR322也能在小鼠肠道有效定植。EcNc鞭毛蛋白高变区分别缺失287-296位或者277-286位10个氨基酸后亦能表达鞭毛蛋白并形成鞭毛丝,且不影响重组菌在小鼠体内的定植能力,说明EcNc鞭毛蛋白高变区能容许部分氨基酸的缺失。随后本研究尝试以鞭毛基因高变区表面展示外源基因。以重组质粒pUC18-fliC为模板,设计两对含六聚组氨酸肽（6His）基因的反向PCR引物,反向PCR产物经Dpn I、 Exnase TM Ⅱ重组环化,分别获得含有嵌合鞭毛基因片段（fliC01、fliC02）的重组质粒pUC18-fliC01、pUC18-fliC02, fliC01、fliC02这两个片段为将六聚组氨酸肽（6His）基因分别插入EcNc fliC高变区774-775位和792-811位碱基之间的序列。将fliC01、fliC02片段分别插入自杀性载体pRE1 12,获得重组质粒pRE112-fliC01、pRE112-fliC02,再将其分别转化EcNc。通过一次重组和二次重组将嵌合鞭毛基因整合入EcNc基因组中,最终获得无抗性筛选盒的重组菌株EcNc fliC01、EcNc fliC02。对重组菌株生长状况、鞭毛形成以及体外细胞黏附试验和小鼠体内定植试验分析,结果表明EcNc fliC01、EcNc fliC02的生长未受影响,表达的嵌合鞭毛蛋白能被H1多抗或His-Tag单抗识别并且能组装形成鞭毛丝；EcNc fliC01、EcNc fliC02对IPEC-J2细胞的黏附能力及小鼠肠道定植能力与EcNc相比无显着性差异。EcNc鞭毛蛋白插入6His后能将其展呈于菌体表面。在利用EcNc鞭毛成功展示6His后,本研究以重组质粒pUC18-fliC为模板,设计两对分别含有BVDV （Bovine viral diarrhea virus） NADL毒株E2蛋白B、T细胞表位基因的反向PCR引物,反向PCR产物经Dpn Ⅰ、ExnaseTM Ⅱ重组环化,分别获得含有嵌合鞭毛基因片段（fliCB、fliCT）的重组质粒pUC18-fliCB、pUC18-fliCT, fliCB、fliCT片段为将B细胞表位、T细胞表位基因分别插入fliC基因792-811位碱基之间构建的嵌合鞭毛基因片段。将fliCB、fliCT片段分别插入自杀性载体pRE112,获得重组质粒pRE112-fliCB、 pRE112-fliCT,再将其分别转化EcNc。通过一次重组和二次重组将嵌合鞭毛基因整合入EcNc基因组中,筛选获得无抗性筛选盒的重组菌株EcNc fliCB、EcNc fliCT。两株重组菌株生长、鞭毛形成以及体外细胞黏附试验与EcNc无显着差异；在半固体平板上,EcNc fliCB无运动性,而EcNc fliCT具有运动性。将EcNc、EcNc fliCB、EcNc fliCT灌胃免疫SPF BALB/c小鼠,二免后一周收集血液和肠道,检测小鼠体内产生抗B、T细胞表位的特异性抗体IgA、IgG,结果表明,免疫重组菌株EcNc fliCB能够刺激机体产生抗B细胞表位的IgG抗体（0.552±0.027）,免疫EcNc fliCT同样能够刺激机体产生抗T细胞表位IgG抗体（0.515±0.049）,空白对照组（免疫EcN）未检测出针对相应包被蛋白的IgG抗体。免疫EcNc fliCB小鼠肠道能检测出针对B细胞表位的IgA抗体（0.367±0.030）,与空白对照组差异显着（0.040±0.017；p=0.040）；免疫EcNc fliCT小鼠肠道能检测出针对T细胞表位的IgA抗体（0.371±0.034）,与空白对照组差异显着（0.024±0.010;p=0.025）。EcNc fliCB、EcNc fliCT能诱导B、T细胞表位抗原特异的体液及黏膜免疫应答。上述试验结果证明EcNc鞭毛蛋白不同高变区能携带一定大小的外源抗原并较好展呈于菌体表面,为优质益生菌EcN更好的潜在应用研究奠定了基础。
申燕[6]（2015）在《利用鸡IL-2增强NDV-F抗原表位及其作为疫苗的免疫效果的研究》文中进行了进一步梳理新城疫（Newcastle disease,ND）是对畜禽危害最大的A类传染病之一,它是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的一种具有高度传染性的禽类急性传染病。F蛋白是NDV主要的免疫保护性抗原和致病相关性抗原,在机体产生保护性抗体和免疫应答过程中有重要作用,已成为人们研究ND疫苗的首选抗原。单克隆抗体技术的愈加广泛的应用使得F蛋白的抗原优势表位逐渐被认识。针对抗原变异日趋复杂的NDV来说,通过选择最佳和最具免疫保护率的表位以解决不同病毒株间因抗原差异引起的免疫失败问题已显得至关重要。近年来还发现,白细胞介素2（Interleukin-2,IL-2）作为一种有效的免疫刺激因子可使DNA疫苗的免疫效应得到调节和增强。但是鸡IL-2的研究十分滞后,本研究拟进一步探讨鸡重组IL-2对NDV表位疫苗的免疫调节作用。本课题以免疫刺激细胞因子鸡IL-2、NDV F抗原以及利用生物信息学软件综合预测的F抗原表位Fs和Fy为目的基因,分别克隆至具有CMV启动子和VSVGED、WPRE、ITRs调控元件的假型杆状病毒pLMI转移载体中,通过Bac-to-Bac系统获得重组Bacmid DNA,将其转染Sf9昆虫细胞来获得重组杆状病毒。利用获得的重组杆状病毒直接作为疫苗进行鸡体免疫,使其有效地刺激机体产生特异性保护抗体与较强的细胞免疫应答,筛选出免疫效果较好的主要保护性抗原表位基因,为进一步研究NDV F蛋白的抗原表位奠定基础;同时利用BV-LMI-IL-2表达的IL-2蛋白作为免疫刺激因子,比较分析对不同抗原表位疫苗免疫效果的影响,为研究增强NDV保护性抗原蛋白免疫效果奠定基础。本研究成功构建了重组杆状病毒BV-LMI-F、BV-LMI-Fs、BV-LMI-Fy和BV-LMI-IL-2,用获得的重组杆状病毒侵染鸡胚成纤维细胞,通过SDS-PAGE和Western blotting可检测到抗原表位Fs与Fy蛋白、鸡IL-2蛋白以及F蛋白均已成功表达。间接免疫荧光检测结果表明:VSV-GED蛋白可在Sf9昆虫细胞中成功表达,并展示在了杆状病毒表面使杆状病毒的转导效率得到增强。F的抗原多肽Fs、Fy两个重组杆状病毒及F重组杆状病毒与鸡IL-2重组杆状病毒以不同组合分别免疫SPF鸡,并设置商品化疫苗、PBS对照组和空载体对照组。免疫试验结果显示:重组杆状疫苗组免疫保护率最高达100%,Fs和Fy免疫组免疫保护率分别达到50%和62.5%,而对照组免疫保护率仅达到12.5%,差异显着（P<0.05）。而Fs+IL-2免疫组和Fy+IL-2免疫组免疫保护率分别达到了62.5%和75%,说明IL-2可以作为免疫刺激因子来提高疫苗的免疫效果。利用ELISA试剂盒检测不同免疫天数鸡血清中IgG、IL-2、IL-4、IFN-γ、CD4+分子和CD8+分子含量,同时检测免疫血清中的中和抗体水平和鸡外周血淋巴细胞刺激指数来综合比较不同重组杆状病毒疫苗的免疫效果。抗原F、Fs和Fy重组杆状病毒疫苗以及与鸡IL-2共同免疫组F+IL-2、Fs+IL-2和Fy+IL-2重组杆状病毒疫苗血清抗体水平显着高于空载体组和PBS对照组（P<0.05）,在42天时,F+IL-2试验组抗体水平达到最高,分别是（1:1452）,与F试验组抗体水平（1:1247）差异显着（P<0.05）;在42天时,IL-2、IL-4、CD4+分子和CD8+分子含量达到峰值,分别达到73.46 pg/mL、136.33pg/mL、79.83 ng/mL及45.62 ng/mL。IFN-γ与血清IgG水平在56天分别达到峰值68.52 pg/mL与1.846,表明重组杆状病毒疫苗可以刺激鸡体使其产生较强的细胞免疫与体液免疫应答。综上,本研究成功构建了具有F、Fs、Fy和IL-2抗原基因的重组杆状病毒,并可在鸡胚成纤维细胞中高效的表达,构建的重组杆状病毒具有较高的转导效率,并且在机体内的表达时间比商业化疫苗Lasota有明显提高;在与IL-2联合免疫时,机体产生了更强的免疫效果,说明了IL-2可作为免疫佐剂使用;对于变异的病毒毒株,可根据变异病毒株的抗原基因快速构建重组杆状病毒疫苗,比商业化疫苗Lasota具有更强的适用性。本研究将为筛选确定更有效的NDV保护性抗原基因研究奠定基础,同时表明鸡IL-2具有良好的佐剂活性,是一个有潜在应用前景的分子免疫佐剂,为新型新城疫疫苗的研制开创了新的思路。
张庆明[7]（2013）在《阻断水貂肠炎细小病毒感染F81细胞的多肽筛选与验证》文中进行了进一步梳理水貂肠炎细小病毒（MEV）是细小病毒科，细小病毒属成员，该病毒能够使水貂患上急性、烈性、高度接触性的病毒性肠炎，临床症状主要表现为剧烈腹泻。1949年该病最早由Schofield报道发生于加拿大，1952年Wills从病料中分离得到该病原，并命名为MEV。随后该病传播到美国、丹麦、芬兰、挪威、瑞士、英国和日本。我国有关MEV的最早报道是在1974年。目前，病毒性肠炎己经成为危害水貂养殖的重要疫病之一，给水貂养殖业带来巨大的经济损失。噬菌体随机肽库是将大量随机合成的寡核苷酸片段克隆到噬菌体外壳蛋白基因中，从而把各种随机多肽表达展示于噬菌体的表面的一种工具。噬菌体随机肽库现在已经成为筛选有效的抗病毒多肽的重要分子生物学工具。本实验旨在以纯化的完整病毒粒子为靶分子，用以淘选噬菌体随机肽库，以期获得能够与MEV特异性结合并且能够抑制病毒侵染宿主细胞的多肽，为研制新型的抗病毒制剂或者饲料添加剂奠定基础。本研究从患出血性肠炎的病死水貂中分离鉴定得到一株水貂肠炎细小病毒，经PCR鉴定，病原确定无误。对该病毒的主要衣壳蛋白VP2基因克隆到pMD18-T载体上进行了测序，并且将其与已知的MEV的VP2基因进行了同源率分析和氨基酸突变分析，结果表明该病毒的328位氨基酸残基由疏水性丙氨酸突变为亲水性苏氨酸。构建进化树结果表明，该病毒与近几年在中国流行的MEV毒株亲缘关系较近。随后对该病毒进行了大量培养，通过PEG沉淀的方法对其进行了浓缩和纯化，为噬菌体随机肽库的筛选打下了较好的基础。利用纯化的MEV病毒颗粒对噬菌体随机肽库进行筛选。三轮筛选后，噬菌体出现了明显的富集。利用ELISA对三轮筛选过后随机挑选的30个噬菌体单克隆的亲和力进行了进一步的鉴定，获得了12个高亲和力的噬菌体单克隆。对这12个噬菌体的体外抗病毒能力进行了检测，发现阳性克隆的抗病毒能力及其与MEV的亲和力不呈平行关系。提取这12个噬菌体单克隆的基因组，测序获知其所展示的相应多肽的序列，对多肽的序列进行了同源性分析，利用在线数据库软件预测分析了多肽特性和功能，最终确定序列Pr和Pl作为进一步活性验证的对象。人工化学合成了多肽Pr和Pl，首先测定了其对F81细胞的细胞毒性，确定了其无毒浓度。在无毒浓度的范围下，对多肽的抗病毒能力进行了检测，通过测定病毒的TCID50表明，两个多肽具有很好的抑制病毒繁殖的能力。通过不同时期将多肽和病毒液混合的方法，证明了多肽的作用方式是阻滞病毒与宿主细胞的结合或阻止病毒向宿主细胞内侵入，而对于病毒吸附后的复制过程没有明显的抑制作用。最后对多肽的特异性进行了检测，发现多肽对CPV和FPV亦具有一定的抗病毒作用，但是对CDV却没有抗病毒作用。本研究成功地分离得到一株MEV病毒，并利用噬菌体随机十二肽库技术筛选得到两个多肽，验证了其抗病毒能力和作用方式，为实现利用多肽预防或治疗MEV感染奠定了实验基础。
张薇薇[8]（2013）在《基于锌指文库的Ni2+等重金属离子结合肽筛选与微生物作用研究》文中研究表明社会经济的快速发展,一方面极大地提高了人们的物质生活水平,同时也给我们的生存环境带来了重大的压力与挑战,因重金属污染带来的环境事故与危害,也已引起社会的高度关注和重视。微生物修复技术,作为环境重金属治理的一种重要途径,近年来得到广泛地研究与进展,而基因工程改造的微生物（GMO）是微生物修复技术的主要发展方向。其中的难点和要点是获得高亲和力的重金属结合肽（结合分子）以及筛选和获得高富集及耐受能力的环境微生物。锌指蛋白作为生物体内存在的重要转录因子,一方面参与了胞内DNA转录相关的多种生理生化过程,同时也为Zn2+、Ni2+等重金属结合肽的获得提供了重要的生物来源。而重金属矿区同时也为重金属富集及耐受微生物菌株的获得提供了天然了菌种资源库。本研究是基于实验室在前期工作中已经构建好的C2H2型锌指蛋白为基本骨架构建的细菌限制性肽库,利用Percoll密度梯度离心分离和筛选Zn2+、Ni2+重金属结合肽并测定其序列,然后利用生物信息学软件对测得的序列进行多重序列比对,进一步确定Zn2+、Ni2+的高亲和力结合肽的序列特征；再通过亲和力反筛测定以及重金属吸附含量测定等方法进一步确认筛选得到的重金属结合多肽对Zn2+、Ni2+的高效或专一性结合特性。然后在以上工作的基础上,再分别对Zn2+和Ni2+的金属结合肽序列进行氨基酸成分分析,以找到这些金属结合肽所共有的性质和规律。同时我们从镍矿尾矿中分离筛选得到Ni高耐受菌株,并利用相关的分子生物学技术—16SrDNA鉴定方法结合其生理生化特性对得到的菌株进行菌种鉴定。C2H2型锌指蛋白细菌限制型随机肽库的筛选的目的是期望能从中获得Ni等高亲和力结合肽,而从矿区土壤中筛选耐Ni微生物是为进一步工程菌的改造和重金属修复提供基础。主要研究结果：1.从实验室前期工作中已构建好的C2H2型锌指蛋白细菌限制性肽库中筛选得到了19条Zn2+和Ni2+结合肽。2.经4轮筛选得到的Zn2+结合肽以及Ni2+结合肽与金属离子的结合能力随筛选轮数递增而增加,P/N值分别可高达94.6和141.0。通过PAGE电泳测得融合蛋白的大小约为75KD。对P/N值较大的（P/N>10）展示菌进行重金属吸附测定,发现展示菌6#和16#对重金属Ni的吸附能力较好,吸附率均可以达到50%左右,展示菌5#,17#对重金属的吸附效果未能达到理想的效果。3.经过对Zn2+和Ni2+结合肽序列进行生物信息学分析后发现具有以下共有序列特征：-H-X4-H-、-F-X-F-。其中氨基酸Ala、Thr、Trp、Val、Ser、Iie含量较高。4.从镍矿尾矿中筛选得到4株Ni2+耐受菌,在固体培养基中Ni2+耐受能力为550mg/L,在液体培养基中耐Ni2+浓度为300mg/L以上。经过鉴定得出它们分别为：芽孢杆菌,鞘氨醇杆菌,门多萨假单胞菌和施氏假单胞菌。门多萨假单胞菌Ni平均吸附率达23%。
郭红光,吴海江,茆灿泉[9]（2009）在《蛋白骨架在随机肽库构建及靶分子筛选中的应用》文中研究说明自然界有着丰富的蛋白骨架来源。选择适宜的蛋白骨架和展示、筛选方法,可构建基于合理蛋白骨架结构的优化限制性随机肽库。与非限制性随机肽库相比,可望获得针对靶分子具有新功能的蛋白结构或更高亲和力的配体分子。目前,骨架蛋白限制的随机肽库已在高效靶分子筛选、基础研究、临床诊断和医学治疗等方面显示出巨大的潜在应用价值。以S-S限制性骨架、抗体分子、锌指蛋白、Z结构域、FN3结构域等为主要代表,综合介绍了蛋白骨架的结构基础、分类、基于蛋白骨架的限制性随机肽库构建及近年来在靶分子筛选等方面的应用最新进展。
李宏,江澜[10]（2009）在《土壤重金属污染的微生物修复研究进展》文中研究说明从利用微生物降低重金属的毒性、微生物展示技术用于土壤重金属污染的治理、生物表面活性剂去除土壤重金属、植物根际宜生菌对重金属的修复等方面对土壤重金属污染微生物修复的研究进行了综述,以期为同类研究提供参考。
二、利用IgA蛋白酶β结构域为骨架构建细菌表面展示随机肽库（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用IgA蛋白酶β结构域为骨架构建细菌表面展示随机肽库（论文提纲范文）
（1）Hc-nas-33参与捻转血矛线虫蜕皮过程的功能及其分子机制初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 捻转血矛线虫病简介 |
| 1 捻转血矛线虫形态与生活史 |
| 2 临床症状 |
| 3 诊断 |
| 4 药物治疗与耐药性 |
| 5 疫苗 |
| 第二章 线虫蜕皮研究进展 |
| 1 蜕皮的生物学意义 |
| 2 线虫表皮层结构特征 |
| 3 表皮、上皮及肌肉之间的连接 |
| 4 线虫蜕皮过程 |
| 5 线虫蜕皮机制研究进展 |
| 第三章 线虫虾红素样蛋白 |
| 1 虾红素蛋白 |
| 2 线虫虾红素样蛋白 |
| 3 寄生性线虫虾红素样蛋白研究进展 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第四章 捻转血矛线虫HcNASs基因特性分析、原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 捻转血矛线虫HcNASs基因的获得与结构分析 |
| 2.2 捻转血矛线虫HcNASs蛋白功能预测及进化关系分析 |
| 2.3 HcNASs基因全长CDS扩增 |
| 2.4 原核蛋白诱导表达及纯化 |
| 2.5 多克隆抗体特异性检测 |
| 3 讨论 |
| 第五章 HcNASs表达特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HcNASs在HEK 293T细胞中的表达特性 |
| 2.2 启动子活性分析 |
| 2.3 HcNASs在秀丽隐杆线虫中的表达模式 |
| 2.4 过表达HcNASs对秀丽隐杆线虫的影响 |
| 2.5 L3幼虫间接免疫荧光定位 |
| 2.6 L4及成虫IHF分析 |
| 3 讨论 |
| 第六章 Hc-nas-33在捻转血矛线虫蜕皮发育过程中的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Hc-nas-33基因各时期转录情况qRT-PCR检测 |
| 2.2 Hc-nas-33基因在捻转血矛线虫蜕皮过程中的转录水平检测 |
| 2.3 秀丽隐杆线虫同源基因在蜕皮过程中发挥功能的比较研究 |
| 2.4 RNA干扰实验 |
| 3 讨论 |
| 第七章 捻转血矛线虫酵母cDNA文库构建及Hc-nas-33互作蛋白的筛选鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 捻转血矛线虫cDNA文库的建立 |
| 2.2 诱饵质粒构建 |
| 2.3 诱饵质粒毒性与自激活检测 |
| 2.4 Hc-GBP-1与Hc-NAS-33相互作用验证 |
| 3 讨论 |
| 第八章 Hc-NAS-33与Hc-GPB-1参与蜕皮过程的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 pCe-gpb-1启动子活性分析 |
| 2.2 Hc-NAS-33与Hc-GPB-1在秀丽隐杆线虫中的共定位分析 |
| 2.3 Hc-nas-33与Hc-gpb-1干扰后对捻转血矛线虫的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 研究展望 |
| 附录Ⅰ 常用溶液配制 |
| 附录Ⅱ 实验涉及引物序列 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的主要成果 |
| 致谢 |
（2）DCTN4与PD-L1的结合及其对DLD1细胞增殖、迁移、集落形成的影响研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1 PD-L1 |
| 1.1 PD-L1 概述 |
| 1.2 PD-1/PD-L1 途径 |
| 1.3 PD-L1 在肿瘤细胞中的表达 |
| 1.4 PD-L1 在肿瘤细胞中的调控 |
| 2 DCTN4 |
| 2.1 细胞质动力蛋白 |
| 2.2 动力蛋白激活蛋白 |
| 2.3 DCTN4 概述 |
| 3 噬菌体表面展示技术 |
| 4 研究目的及意义 |
| 第一章 实验材料与方法 |
| 第一节 实验材料 |
| 1.1.1 细胞 |
| 1.1.2 菌株与质粒 |
| 1.1.3 慢病毒载体 |
| 1.1.4 噬菌体库 |
| 1.1.5 主要仪器及耗材 |
| 1.1.6 主要试剂及试剂盒 |
| 1.1.7 试剂配制 |
| 1.1.8 引物序列 |
| 第二节 实验方法 |
| 1.2.1 载体的构建 |
| 1.2.2 噬菌体表面展示技术筛选与PD-L1 结合的多肽 |
| 1.2.3 Western Blot |
| 1.2.4 Co-IP |
| 1.2.5 细胞转染 |
| 1.2.6 DCTN4 过表达稳转细胞系的构建 |
| 1.2.7 DOX诱导稳转细胞Tet-on系统表达及效果的验证 |
| 1.2.8 多肽结合PD-L1 并靶向溶酶体实验 |
| 1.2.9 细胞总RNA提取 |
| 1.2.10 逆转录 |
| 1.2.11 实时定量PCR |
| 1.2.12 细胞功能学实验 |
| 第二章 实验结果 |
| 2.1 利用噬菌体表面展示技术筛选与PD-L1 结合的多肽 |
| 2.1.1 利用噬菌体表面展示技术筛选得到与PD-L1 结合的多肽 |
| 2.1.2 利用多肽序列检索可能结合PD-L1 的蛋白 |
| 2.2 细胞内D4 与溶酶体分选信号融合多肽将PD-L1 靶向溶酶体降解 |
| 2.3 DCTN4与PD-L1 的结合关系 |
| 2.3.1 DCTN4与PD-L1 结合 |
| 2.3.2 DCTN4 截断体与PD-L1 结合 |
| 2.4 可诱导DCTN4 过表达DLD1 稳转细胞系的构建 |
| 2.4.1 DCTN4 基因在肿瘤细胞中的表达 |
| 2.4.2 可诱导DCTN4 过表达的DLD1 稳转细胞系的构建 |
| 2.5 DCTN4 过表对DLD1 细胞功能的影响 |
| 2.5.1 DCTN4 过表达对DLD1 细胞增殖能力的影响 |
| 2.5.2 DCTN4 过表达对DLD1 细胞迁移能力的影响 |
| 2.5.3 DCTN4 过表达对DLD1 细胞集落形成能力的影响 |
| 第三章 分析与讨论 |
| 3.1 噬菌体表面展示技术筛选结合PD-L1 的多肽 |
| 3.2 结合PD-L1 的蛋白对PD-L1 的影响 |
| 3.3 靶向PD-L1 的治疗 |
| 第四章 结论 |
| 附录1 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）噬菌体展示技术筛选双环肽配体（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 自然界富含二硫键的多肽 |
| 1.2.1 二硫键桥连的双环肽 |
| 1.2.2 动物防御素 |
| 1.2.3 具有半胱氨酸结基序的环肽 |
| 1.3 基于自然界环肽骨架的分子嫁接 |
| 1.3.1 分子嫁接提高稳定性 |
| 1.3.2 分子嫁接增强亲和力 |
| 1.3.3 分子嫁接促进胞内递送 |
| 1.3.4 分子嫁接改善口服活性 |
| 1.4 噬菌体展示技术 |
| 1.4.1 噬菌体展示技术的概述 |
| 1.4.2 噬菌体展示单环肽库 |
| 1.4.3 噬菌体展示双环肽库 |
| 1.4.4 噬菌体展示天然环肽库 |
| 1.5 研究思路 |
| 第二章 噬菌体展示双环肽库针对靶标蛋白MDM2进行筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 溶液配制 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 MDM2蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.2 以MDM2为靶标蛋白的噬菌体筛选 |
| 2.3.3 ELISA实验鉴定噬菌体单克隆与MDM2的结合 |
| 2.3.4 单克隆菌落的基因测序 |
| 2.3.5 多肽氧化折叠 |
| 2.3.6 荧光偏振竞争实验测定双环肽与MDM2的亲和力 |
| 2.4 本章小结 |
| 第二章 附录 |
| 第三章 双环肽的性质表征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 pb-13和pb-18脯氨酸突变肽的氧化折叠 |
| 3.3.2 pb-13和pb-18双环肽结构的表征 |
| 3.3.3 鉴定脯氨酸对多肽构象的影响 |
| 3.3.4 序列分析 |
| 3.4 小结 |
| 第三章 附录 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表文章及奖励 |
| 致谢 |
（4）葡聚糖接枝型四肽仿生层析介质的制备与抗体分离纯化的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 抗体 |
| 1.2.1 抗体的结构 |
| 1.2.2 抗体的应用 |
| 1.3 抗体的分离纯化方法 |
| 1.3.1 层析法 |
| 1.3.2 非层析分离方法 |
| 1.4 短肽仿生层析 |
| 1.4.1 蛋白A替代配基 |
| 1.4.2 短肽仿生配基的设计和筛选 |
| 1.5 聚合物接枝层析介质 |
| 1.5.1 葡聚糖接枝 |
| 1.5.2 聚乙烯亚胺接枝 |
| 1.5.3 小分子单体聚合物接枝 |
| 1.6 本文研究思路和研究内容 |
| 第二章 葡聚糖接枝型四肽仿生层析介质的制备和静态吸附性能评价 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 葡聚糖接枝型四肽仿生亲和层析介质的制备 |
| 2.2.3 氨基密度测定 |
| 2.2.4 四肽配基密度测定 |
| 2.2.5 2eta电位测定 |
| 2.2.6 吸附等温线测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 氨基活化密度和四肽配基密度测定 |
| 2.3.2 Zeta电位测定 |
| 2.3.3 吸附等温线 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 葡聚糖接枝型四肽仿生亲和层析介质的动态吸附性能评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 葡聚糖接枝型四肽仿生亲和层析介质的制备 |
| 3.2.3 动态结合载量测定 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 pH和流速对动态吸附性能的影响 |
| 3.3.2 盐浓度对动态吸附性能的影响 |
| 3.3.3 配基密度对动态吸附性能的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 葡聚糖接枝型四肽仿生层析介质的分离性能评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 葡聚糖接枝型四肽仿生亲和层析介质的制备 |
| 4.2.3 Ac-YFRH-XL层析柱中抗体的洗脱 |
| 4.2.4 混合蛋白中分离hIgG |
| 4.2.5 细胞培养上清液中分离单抗 |
| 4.2.6 SEC-HPLC分析 |
| 4.2.7 还原SDS-PAGE分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 Ac-YFRH-XL层析柱中抗体的洗脱 |
| 4.3.2 混合蛋白中分离hIgG |
| 4.3.3 细胞培养上清液中分离单抗 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）大肠杆菌Nissle 1917无质粒克隆菌株鞭毛表面展示功能探析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 大肠杆菌Nissle 1917研究进展 |
| 1.1 大肠杆菌益生菌株Nissle 1917的特征 |
| 1.2 大肠杆菌益生菌株Nissle 1917的临床应用 |
| 1.3 大肠杆菌益生菌株Nissle 1917作为基因工程载体的应用 |
| 1.4 参考文献 |
| 第二章 细菌鞭毛表面展示 |
| 2.1 鞭毛的结构 |
| 2.2 细菌鞭毛展示 |
| 2.3 参考文献 |
| 下篇 试验研究 |
| 第三章 EcN无质粒克隆菌株的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 参考文献 |
| 第四章 EcN无质粒克隆菌株fliC缺失突变株和fliC高变区部分缺失突变株的构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 参考文献 |
| 第五章 EcN无质粒克隆菌株鞭毛蛋白部分高变区功能初步研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 参考文献 |
| 第六章 EcN无质粒克隆菌株鞭毛展示6His标签的构建及相关生物学特性分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 参考文献 |
| 第七章 EcN无质粒克隆菌株鞭毛展示BVDV E2蛋白B细胞表位、T细胞表位的构建及诱导小鼠产生免疫反应 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 参考文献 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
（6）利用鸡IL-2增强NDV-F抗原表位及其作为疫苗的免疫效果的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩略语 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 新城疫病毒的分子生物学研究进展 |
| 1.1.1 ND的流行 |
| 1.1.2 NDV的基因组结构特征 |
| 1.1.3 NDV基因编码的主要蛋白F及其功能研究 |
| 1.1.4 NDV基因编码的F蛋白抗原表位基因研究 |
| 1.2 新城疫基因工程疫苗研究进展 |
| 1.2.1 亚单位疫苗 |
| 1.2.2 活载体疫苗 |
| 1.2.3 DNA疫苗 |
| 1.2.4 表位疫苗 |
| 1.3 抗原表位研究概况 |
| 1.3.1 抗原表位的概念 |
| 1.3.2 抗原表位的分类 |
| 1.3.3 抗原表位的筛选方法 |
| 1.4 IL-2的研究进展 |
| 1.4.1 鸡IL-2的结构与特点 |
| 1.4.2 IL-2的产生 |
| 1.4.3 鸡IL-2基因作为免疫刺激细胞因子研究进展 |
| 1.5 杆状病毒表达系统 |
| 1.5.1 杆状病毒表达载体的优越性 |
| 1.6 提高杆状病毒对哺乳动物细胞转导效率策略的研究 |
| 1.6.1 启动子的选择 |
| 1.6.2 利用“VSVGED”使病毒假型化 |
| 1.6.3 添加调控元件“WPRE”和“ITRs” |
| 1.7 本课题研究的目的和意义 |
| 1.8 本研究的实验技术路线 |
| 1.8.1 重组杆状病毒转移载体的构建策略 |
| 1.8.2 重组杆状病毒的扩增和外源基因的表达 |
| 1.8.3 重组杆状病毒免疫效果的研究 |
| 1.9 课题资助名称 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 供试菌种和质粒 |
| 2.1.3 扩增引物 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 主要分子生物学及生化试剂 |
| 2.1.6 主要缓冲液及试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 重组转移载体的构建 |
| 2.2.2 重组杆状病毒穿梭载体Bacmid DNA的获得 |
| 2.2.3 重组杆状病毒穿梭载体Bacmid DNA转染Sf9昆虫细胞 |
| 2.2.4 重组杆状病毒的扩增及滴度测定 |
| 2.2.5 重组杆状病毒在鸡胚成纤维细胞中表达 |
| 2.2.6 重组蛋白的SDS-PAGE及其Western-blotting检测 |
| 2.2.7 VSV-GED蛋白的间接免疫荧光检测 |
| 2.2.8 重组杆状病毒的鸡体免疫试验 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 重组转移载体的构建 |
| 3.1.1 重组转移载体p LM-F、p LM-Fs和p LM-Fy的构建 |
| 3.1.2 重组转移载体p LMI-IL-2 的构建 |
| 3.2 重组杆状病毒穿梭载体的鉴定 |
| 3.2.1 重组穿梭转移载体的鉴定 |
| 3.3 重组杆状病毒穿梭载体转染SF9昆虫细胞 |
| 3.3.1 Sf9昆虫细胞生长曲线的绘制 |
| 3.3.2 Sf9昆虫细胞正常及病变形态比较 |
| 3.4 重组杆状病毒的扩增及滴度测定 |
| 3.4.1 重组杆状病毒滴度测定 |
| 3.5 重组杆状病毒介导目的基因在鸡胚成纤维细胞中的表达及分析 |
| 3.5.1 鸡胚成纤维细胞的形态 |
| 3.5.2 重组蛋白的SDS-PAGE及其Western-blotting鉴定 |
| 3.5.3 重组蛋白的Western blotting分析 |
| 3.6 VSV-GED蛋白的间接免疫荧光检测 |
| 3.7 动物免疫—攻毒试验 |
| 3.7.1 免疫和攻毒后各试验组的临床症状及免疫保护率 |
| 3.7.2 病理学观察 |
| 3.7.3 F48E9 强毒株TCID50的测定 |
| 3.7.4 免疫鸡血清中和抗体效价的测定 |
| 3.7.5 免疫鸡血清IgG抗体检测 |
| 3.7.6 免疫鸡淋巴细胞增殖试验 |
| 3.7.7 免疫鸡血清细胞因子检测 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 课题背景 |
| 4.2 攻毒试验免疫保护率的分析 |
| 4.3 编码的抗原基因对重组杆状病毒疫苗免疫原性的影响 |
| 4.4 鸡 IL-2 对新城疫重组杆状病毒疫苗免疫的影响 |
| 4.5 载体对重组杆状病毒疫苗免疫原性的影响 |
| 4.6 免疫剂量和免疫程序的选择 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
（7）阻断水貂肠炎细小病毒感染F81细胞的多肽筛选与验证（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 水貂细小病毒性肠炎的研究进展 |
| 1.1 水貂肠炎细小病毒的生物学特性 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状与组织病理变化 |
| 1.4 疾病的诊断 |
| 1.5 疾病的预防 |
| 1.6 疾病的治疗 |
| 第2章 噬菌体展示技术在抗病毒药物筛选方面的应用 |
| 2.1 噬菌体展示技术简介 |
| 2.2 噬菌体肽库的构建以及筛选方法 |
| 2.3 在抗病毒药物筛选上的应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 水貂肠炎细小病毒的分离鉴定与浓缩纯化 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 噬菌体随机肽库筛选抗病毒肽 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 多肽抗 MEV 感染的体外验证 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）基于锌指文库的Ni2+等重金属离子结合肽筛选与微生物作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题的研究背景和目的 |
| 1.1.1 课题研究背景 |
| 1.1.2 课题研究目的 |
| 1.2 课题的研究内容和意义 |
| 1.2.1 课题研究内容 |
| 1.2.2 课题研究意义 |
| 1.3 论文主要内容和组织 |
| 第2章 基于锌指骨架的细菌限制性随机肽库的重金属高效结合肽筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 锌指骨架细菌限制性随机肽库的Zn~(2+)和Ni~(2+)筛选 |
| 2.3.2 目的蛋白表达PAGE电泳测定 |
| 2.3.3 随机肽库的重金属结合肽序列测定 |
| 2.3.4 锌指随机肽库筛选菌重金属Ni~(2+)吸附测定 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 细菌限制性随机肽库的重金属Zn~(2+)和Ni~(2+)结合肽树脂筛选 |
| 2.4.2 目的蛋白展示PAGE电泳测定 |
| 2.4.3 重金属结合肽序列测定 |
| 2.4.4 随机肽库的重金属结合肽对重金属Ni~(2+)吸附性测定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 重金属高效结合肽序列生物信息分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 主要软件及介绍 |
| 3.2.1 Clustalx(1.81)多序列比对 |
| 3.2.2 MEME软件及介绍 |
| 3.2.3 BioEdit软件及介绍 |
| 3.3 生物信息学分析结果 |
| 3.3.1 多重序列比对结果 |
| 3.3.2 MEME软件寻找模体序列 |
| 3.3.3 BioEdit软件分析结果 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 重金属Ni~(2+)耐受菌的筛选及鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要仪器 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要试剂配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Ni~(2+)高耐受菌株的筛选 |
| 4.3.2 测定高耐受菌株对Ni~(2+)的吸附能力 |
| 4.3.3 采用16S rDNA法鉴定Ni~(2+)高耐受富集菌株 |
| 4.3.4 高耐受菌株生理生化鉴定 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 Ni~(2+)高耐受菌株的筛选 |
| 4.4.2 Ni~(2+)高耐受菌株对Ni的吸附能力的测定 |
| 4.4.3 Ni~(2+)高耐受富集菌株的分子生物学鉴定 |
| 4.4.4 高耐受菌株生理生化鉴定 |
| 4.5 小结 |
| 总结 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（10）土壤重金属污染的微生物修复研究进展（论文提纲范文）
| 1 利用微生物降低重金属的毒性 |
| 2 微生物修复技术对土壤重金属污染的治理 |
| 2.1 细菌表面展示技术 |
| 2.2 噬菌体抗体库技术 |
| 2.3 酵母表面展示技术 |
| 3 生物表面活性剂去除土壤重金属 |
| 4 植物根际宜生菌对重金属的修复 |
| 5 讨论 |
四、利用IgA蛋白酶β结构域为骨架构建细菌表面展示随机肽库（论文参考文献）
- [1]Hc-nas-33参与捻转血矛线虫蜕皮过程的功能及其分子机制初步研究[D]. 黄艳. 浙江大学, 2021
- [2]DCTN4与PD-L1的结合及其对DLD1细胞增殖、迁移、集落形成的影响研究[D]. 黎素焕. 福建师范大学, 2020(12)
- [3]噬菌体展示技术筛选双环肽配体[D]. 林平. 厦门大学, 2019(07)
- [4]葡聚糖接枝型四肽仿生层析介质的制备与抗体分离纯化的研究[D]. 朱鸿运. 浙江大学, 2019
- [5]大肠杆菌Nissle 1917无质粒克隆菌株鞭毛表面展示功能探析[D]. 杨颖. 扬州大学, 2016(02)
- [6]利用鸡IL-2增强NDV-F抗原表位及其作为疫苗的免疫效果的研究[D]. 申燕. 黑龙江大学, 2015(12)
- [7]阻断水貂肠炎细小病毒感染F81细胞的多肽筛选与验证[D]. 张庆明. 吉林大学, 2013(08)
- [8]基于锌指文库的Ni2+等重金属离子结合肽筛选与微生物作用研究[D]. 张薇薇. 西南交通大学, 2013(11)
- [9]蛋白骨架在随机肽库构建及靶分子筛选中的应用[J]. 郭红光,吴海江,茆灿泉. 中国生物工程杂志, 2009(09)
- [10]土壤重金属污染的微生物修复研究进展[J]. 李宏,江澜. 贵州农业科学, 2009(07)