一、全长细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及DNA疫苗的构建（论文文献综述）
许彤[1]（2021）在《表达细粒棘球蚴EG95蛋白重组狂犬病病毒的构建及免疫研究》文中指出背景包虫病（Hydatidosis）是由棘球绦虫的幼虫寄生宿主器官引起的一种人兽共患病。该病主要流行于中国、中亚、中东、南美和欧洲等地区。其中由细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,E.g）寄生引起的囊型包虫病（Cystic echinococcus,CE）在我国广泛流行,导致严重疾病负担及畜牧业损失。牛羊等家畜为细粒棘球绦虫的中间宿主,犬科动物是终末宿主,人作为中间宿主偶发感染。其临床症状是由幼虫感染中间宿主,导致肝肺等脏器实质性病变,损害器官功能,或包囊破裂导致过敏性休克或继发性细菌感染。CE每年导致1.93万例死亡,以及87.1万残疾调整生命年（Disable-adjusted Life-years,DALYs）,每年与该病相关的治疗费用及畜牧业损失约为30亿美元。给中间宿主接种疫苗以切断其生活史发育环节是一种更实用的有效控制细粒棘球绦虫传播的选择。目前由细粒棘球蚴表达的EG95蛋白制成的亚单位疫苗在一些CE流行地区进行实验证明该抗原安全有效。但该疫苗接种程序复杂,多次接种且需要佐剂才能达到预期的免疫保护效果,社会成本高。因此,迫切需要研制更廉价、更高效的细粒棘球绦虫疫苗。同时,狂犬病（Rabies）是一种严重的人兽共患病,由弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）的狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）所引起,所有的温血动物均可感染,病死率几乎为100%。该病呈全球流行,主要发生在发展中国家,严重威胁公共卫生安全。由于犬源狂犬病控制不足和野生动物狂犬病的蔓延,我国边境牧区羊、牛等家畜狂犬病近年来迅速增加,不但造成畜牧业经济损失,而且给农民和兽医带来潜在的感染风险。世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties,OIE）建议在狂犬病流行区对牛羊等进行狂犬病疫苗免疫,并在一些国家成功实施。RABV作为表达外源基因的良好载体,具有独特优势,已有很多研究者以RABV为载体研制多种表达各类外源病毒抗原蛋白的重组疫苗。综上所述,为避免包虫病和狂犬病双重流行对边境牧区牛羊造成严重的经济损失,亟待研制一种安全有效的可以同时预防牛羊细粒棘球绦虫和RABV的二联疫苗。目的1.以狂犬病病毒弱毒株LBNSE为载体表达细粒棘球蚴EG95蛋白,利用反向遗传技术构建重组病毒LBNSE-EG95。2.通过体内和体外实验,评价LBNSE-EG95的生物学特性、致病性、保护性和免疫原性,评估重组病毒LBNSE-EG95作为囊型包虫病和狂犬病的候选二联疫苗的潜力。方法1.重组狂犬病病毒LBNSE-EG95的构建与鉴定。将细粒棘球蚴EG95基因插入LBNSE感染性克隆伪基因区,获得重组感染性克隆,转染BHK-21细胞拯救获得重组病毒LBNSE-EG95。通过RT-PCR、免疫荧光实验（IFA）、流式细胞术和Western blot等鉴定该重组病毒的生物学特性。2.重组病毒LBNSE-EG95的致病性分析。雌性BALB/c小鼠（6-8周）随机分为实验组、对照组、空白组,分别经后肢肌肉免疫重组病毒LBNSE-EG95、亲本毒株LBNSE和DMEM,连续21天观察监测小鼠的体重变化、饮食情况和精神状况等。3.重组病毒LBNSE-EG95诱导小鼠产生特异性保护性抗体能力检测。免疫小鼠后第2、4、8周采集血清,利用荧光抗体病毒中和试验（FAVN）检测RABV中和抗体效价,用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测EG95特异性抗体水平。4.重组病毒LBNSE-EG95的保护性评价。免疫小鼠后4周,经后肢肌肉注射RABV。连续21天观察监测感染后小鼠的存活率、体重变化、饮食情况和临床症状等,评价重组病毒对小鼠的保护作用。5.重组病毒LBNSE-EG95诱导小鼠淋巴结募集/激活DCs能力检测。免疫后第3、6、9天收集小鼠腹股沟淋巴结淋巴细胞,通过流式细胞术检测LBNSE-EG95诱导小鼠淋巴结募集/激活DCs能力。6.重组病毒LBNSE-EG95诱导小鼠淋巴结和外周血募集/激活B淋巴细胞能力检测。免疫后第3、6、9天收集小鼠腹股沟淋巴结淋巴细胞,并且在免疫后第7、14、28天收集外周血,通过流式细胞术检测LBNSE-EG95诱导小鼠募集/激活B淋巴细胞的能力。7.重组病毒LBNSE-EG95诱导小鼠产生分泌IFN-γ和IL-4特异性T细胞能力检测。免疫后第7、14天收集小鼠脾脏淋巴细胞,通过流式细胞术检测在RABV和EG95蛋白特异性刺激下,LBNSE-EG95诱导小鼠产生分泌IFN-γ和IL-4的特异性CD4+和CD8+T细胞的能力。在免疫后第28天分离小鼠脾脏淋巴细胞,利用酶联免疫斑点实验（ELISpot）检测小鼠产生分泌IFN-γ和IL-4特异性T细胞的能力。8.重组病毒LBNSE-EG95诱导小鼠产生的特异性抗体亚型。通过ELISA检测在RABV和EG95特异性抗原刺激下,LBNSE-EG95免疫小鼠4周后诱导产生特异性IgG2a/IgG1的滴度。结果1.重组病毒LBNSE-EG95拯救成功,通过IFA、RT-PCR、流式细胞术和Western blot等实验鉴定表明重组病毒可高效及正确的表达目的蛋白EG95。2.免疫后连续观察21天,与空白组和LBNSE对照组小鼠相比,LBNSE-EG95组小鼠体重无明显差异,且三组小鼠体重都呈现整体上升趋势,且生长状态良好,未出现异常情况。3.抗体检测结果表明,LBNSE-EG95可诱导小鼠产生高效价的RABV的中和抗体和高水平的EG95特异性抗体。4.RABV感染实验表明,LBNSE-EG95与LBNSE组可对RABV的攻击提供完全保护,而空白组小鼠均发病。5.流式细胞实验结果显示,相比空白组,LBNSE-EG95可诱导小鼠体内募集/激活更多DCs。6.流式细胞实验结果显示,相比空白组,LBNSE-EG95可诱导小鼠淋巴结中募集/活化更多B细胞,并在外周血中持续募集活化B细胞。7.流式细胞实验结果显示,LBNSE-EG95诱导小鼠产生更多分泌IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞。ELISpot实验结果显示,LBNSE-EG95组小鼠在EG95蛋白和RABV G蛋白刺激下,可诱导产生更多分泌IFN-γ和IL-4特异性T细胞,明显多于空白组和LBNSE组。8.ELISA实验结果显示,免疫LBNSE-EG95小鼠的免疫应答更倾向于Th1型免疫反应。结论本研究成功构建了表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组狂犬病病毒LBNSE-EG95,该重组病毒安全性高且能诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫和细胞免疫,是预防囊型包虫病和狂犬病的理想候选二联疫苗。
魏玉环[2]（2020）在《西藏阿里地区细粒棘球蚴基因多态性分析及其中间宿主淋巴细胞功能状态的研究》文中研究表明细粒棘球蚴病是由细粒棘球蚴寄生于中间宿主人和偶蹄类家畜等,引起肝、脾、肺等组织脏器的压迫性病变,严重危害人民的健康和畜牧业生产。细粒棘球蚴病是我国重点防治的人兽共患病,有368个细粒棘球蚴病流行县,受威胁人数达6000万,居全球首位。2016年对西藏地区调查资料显示阿里地区家畜感染率（28.8 2%）、家庭自宰率（90.6%）、危险因素OR（56.28）均较高,但该地区细粒棘球蚴病基因多态性和种群扩增情况尚不清楚。细粒棘球蚴感染宿主后引起复杂的免疫反应,具体机制不清,也成为细粒棘球蚴病诊断试剂、药物研制的瓶颈。本研究从病原和宿主两个角度开展研究:1.采用PCR法扩增线粒体基因,利用Contig、BLAST、Clustalx1.83等软件对西藏阿里地区细粒棘球蚴人体分离株基因多态性进行分析,了解该地区流行的细粒棘球蚴基因型及其单倍型;2.研究细粒棘球蚴感染小鼠外周血中淋巴细胞比例及细胞表面PD-1表达的动态变化和细粒棘球蚴病患者、小鼠血清中Th1和Th2类、促炎和抑炎性细胞因子的表达及,初步探讨中间宿主感染细粒棘球蚴后,宿主淋巴细胞的功能状态。本研究为细粒棘球蚴溯源、病原与中间宿主相互作用机制的研究打下良好的实验基础。一、西藏阿里地区细粒棘球蚴人体分离株基因多态性研究目的了解西藏阿里地区细粒棘球蚴的基因多态性及种群扩增情况,为细粒棘球蚴病的溯源提供支持。方法收集阿里地区某医院棘球蚴病患者病灶切除样本,PCR扩增线粒体(细胞色素氧化酶亚单位1基因（cytochrome c oxidase subunit 1,coxl）和细胞色素b基因（cytochrome b,cob）。扩增产物测序后用 Contig 拼接,BLAST、Clusta1x1.83和MEGA7.0等软件进行系统发育分析;利用DnaSP6和NetWork软件分析及制作单倍型网络图;下载全国细粒棘球蚴人体分离株的cox1基因序列,分析并制作单倍型网络图。结果本研究共收集阿里地区79例细粒棘球蚴人体分离株样本,年龄从6-76岁,细粒棘球蚴病患者女性49人,男性30人。根据样本分布阿里地区的细粒棘球蚴病例由高至低依次为:革吉（29）、改则（14）、日土（10）、普兰（9）、措勤（7）、札达（6）、噶尔（4）。西藏阿里地区细粒棘球蚴人体分离株基因型有G1、G3、G6和G7四型,其中G3型1例,G6型4例,G7型1例,其余均属于G1型。阿里地区细粒棘球蚴线粒体cob基因检测出8个单倍型,主要的单倍型是Hap-4,单倍型多样性为0.64,核酸多样性 0.0015。cob基因中性检验 Tajima’sD 值为-1.89,P<0.05,Fu’s Fs statistic值为-5.10,P<0.05。阿里地区细粒棘球蚴线粒体cox1基因检测出6个单倍型,主要的单倍型是Hap-1,单倍型多样性为0.36,核酸多样性为0.0012。cox1 基因中性检验 Tajima’sD 值为-1.90,P<0.05,Fu’s Fs statistic 值为-3.53,P<0.05。全国细粒棘球绦虫的cox1线粒体基因检测出40个单倍型,主要的单倍型是Hap-4,单倍型多样性为0.783,核酸多样性为0.040。结论西藏阿里地区人源性细粒棘球蚴基因型和单倍型都很丰富,目前检测出G1、G3、G6、G7四个基因型,以G1型为主,cob和cox1基因单倍型分别是8种和6种,分别以Hap-4和Hap-1为主。中性检验结果显示,阿里地区细粒棘球蚴经历了种群扩增和自然选择的作用。二、细粒棘球蚴感染中间宿主淋巴细胞功能状态的研究目的了解中间宿主感染细粒棘球蚴淋巴细胞的功能状态,为进一步研究细粒棘球蚴与宿主间的相互作用研究奠定基础。方法本研究经腹腔向六周龄BALB/c小鼠注射原头节,建立细粒棘球蚴感染小鼠模型,检测T、B淋巴细胞,CD4+T和CD8+T细胞及其表面抑制性受体PD-1在4、6、8、12和24周的动态变化;通过检测小鼠感染细粒棘球蚴后Th1、Th2类细胞因子、促炎和抑炎性细胞因子在2、3、4、6、8、12和24周动态变化;检测细粒棘球蚴病患者Th1、Th2类细胞因子、促炎和抑炎性细胞因子的表达模式;初步研究细粒棘球蚴感染中间宿主的淋巴细胞功能状态。结果小鼠感染细粒棘球蚴后外周血中,T淋巴细胞在感染后第4周比例显着增高,T淋巴细胞抑制型受体PD-1第6、8周比例显着升高（P<0.05）。B淋巴细胞在感染后第6周比例显着增高,B淋巴细胞抑制型受体PD-1在感染后第6、8、12周显着增高（P<0.05）。小鼠感染细粒棘球蚴后外周血中,CD4+T细胞在感染后第6、8、12、24周比例显着升高,CD4+T细胞抑制型受体PD-1在感染后第6、8、12周比例显着升高（P<0.05）。CD8+T细胞在感染后第6、8周比例显着降低,CD8+T细胞抑制型受体PD-1在感染后第6周显着升高（P<0.05）。小鼠感染细粒棘球蚴后,IL-1β和IL-2水平在第2周显着升高（P<0.05）。IFN-γ、TNF-α、GM-CSF水平在第2、3周显着升高,第4周显着降低（P<0.05）。IL-4水平在第3、12、24周显着升高（P<0.05）。IL-13水平在第24周显着升高（P<0.05）。IL-10水平在第8、12周显着升高（P<0.05）。细粒棘球蚴病人血清中细胞因子IL-17A和IFN-γ水平比未感染的健康对照组显着降低（P<0.05）,IL-4和TGF-β水平比未感染的健康对照组显着升高（P<0.05）。结论细粒棘球蚴感染后2-3周,小鼠处于炎症反应期;4-6周启动特异性免疫应答;6-12周,小鼠呈现免疫抑制状态。细粒棘球蚴病患者呈Th2极化和免疫抑制反应。
王炜烨[3]（2020）在《细粒棘球绦虫TSP8、TSP11基因的原核表达及免疫学初步分析》文中提出目的:细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,E.g）作为包虫病（hydatidosis）的主要病原体,给我国及世界各国造成了不计其数的危害,给人民群众造成了巨大的生命威胁。自了解包虫病以来,各国均采取积极手段研究对其的防治,因此包虫病的免疫预防就成为了当前研究的热点。基于此,研制针对宿主的包虫病长效保护疫苗,将对我国包虫病的防治起到促进作用。而截至目前,四跨膜蛋白（Tetraspanin,TSP）在广泛的细胞活动过程中起到重要作用,并已发现可对寄生虫宿主免疫互作及逃避起到积极作用,已经被发现可作为多种寄生虫宿主疫苗的候选蛋白。本研究将首次对E.g四跨膜蛋白TSP8、TSP11基因进行扩增及原核表达,并对其重组蛋白免疫小鼠体内的细胞因子及抗体水平进行检测,为研究四跨膜蛋白作为细粒棘球绦虫候选疫苗抗原奠定基础。方法:（1）细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11全长基因的克隆及序列分析根据NCBI GeneBank中细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11的全长基因,分别对其设计特异性引物,以细粒棘球绦虫的原头蚴cDNA为PCR模板进行扩增,并将PCR产物克隆至pMD19-T载体,送至测序,通过生物信息学软件分析预测TSP8、TSP11全长基因的结构与功能,并通过SYBR GreenⅠqRT-PCR方法分析TSP8、TSP11基因在E.g原头蚴以及成虫mRNA相对转录情况。（2）细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11主要抗原基因的克隆及原核表达为成功编码表达细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11基因,针对其主要抗原区域序列进行了特异性引物设计,对主要抗原区域片段进行克隆并测序。在测序正确的基础上,将目的片段与表达质粒pET-32a分别进行酶切与连接以及转化,建立pET-32a-TSP重组表达载体,并使用亲和层析柱法对其进行纯化、SDS-PAGE电泳对其进行鉴定及检测、Western blot免疫印迹法对其抗原性进行检测、以及通过免疫定位分析TSP8、TSP11蛋白在虫体的具体定位。（3）细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11免疫学特性分析试验分为4组,重组蛋白TSP8、TSP11组与PBS、佐剂对照组,每组共15只小鼠,分别对试验组进行免疫,以每只小鼠500μg蛋白含量与弗氏佐剂进行等体积混合免疫,每隔15天免疫一次,共免疫4次。第一次免疫为弗氏完全佐剂混合免疫,其余为弗氏不完全佐剂混合免疫。每次免疫后,各组取三只小鼠尾部采血并收集血清,以q-PCR方法测定Th1型（IFN-γ、TNF-β）、Th2型（IL-4、IL-5、IL-6、IL-10）两类免疫反应共6种细胞因子随免疫时间的变化、以及采用ELISA法测定其抗体水平的变化。结果:1、成功克隆到细粒棘球绦虫TSP8基因全长序列,TSP8基因共含有669个核苷酸,编码蛋白含222个氨基酸,相对分子质量为24 KDa。预测TSP8基因共含有2个潜在的N端糖基化位点,包含2个蛋白激酶磷酸化位点。编码TSP8基因的氨基酸序列共含有5个跨膜区域,推测含有4个优势B抗原表位,且qRT-PCR结果显示TSP8基因在E.g原头蚴及成虫阶段均有表达,但在成虫阶段的表达水平较高,具有统计学差异（p<0.05）。2、经克隆获得TSP11全长基因,TSP基因全长765个核苷酸,编码蛋白含254个氨基酸,相对分子质量为29.02KDa,预测其含有3个潜在的N端糖基化位点、5个蛋白激酶磷酸化位点以及1个酪氨酸激酶磷酸化位点。编码TSP11基因的氨基酸序列共含有3个跨膜区域,推测含有7个优势B抗原表位。qRT-PCR显示其在E.g原头蚴及成虫阶段均有表达,无统计学显着差异（P>0.05）。3、重组蛋白Eg-TSP8、Eg-TSP11在免疫小鼠2周时,就可在小鼠血清中检测出特异性IgG抗体,并发现在随后的加强免疫中,血清中的特异性IgG抗体水平逐次升高,表明该重组蛋白能诱导小鼠体内产生特异性的抗体,具有比较好的免疫原性。重组蛋白Eg-TSP8在首免2周后,检测到脾组织中IL-5、IL-10相对于佐剂组与PBS组有较高水平表达（P<0.01）。而重组蛋白Eg-TSP11在第三次加强免疫后,能在脾组织中检测到细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10水平,均比佐剂组与PBS有显着高水平表达（P<0.01）。可见,重组蛋白Eg-TSP11诱导小鼠产生了Th1/Th2免疫反应,而重组蛋白Eg-TSP8主要偏向于Th2免疫反应。结论:重组蛋白Eg-TSP8、Eg-TSP11均具有免疫原性,但Eg-TSP11蛋白相较于Eg-TSP8蛋白能刺激小鼠产生Th1型免疫应答,具有成为包虫病候选疫苗抗原的潜力。
蔡其刚[4]（2019）在《青南儿童棘球蚴病调查分析及AE免疫学诊断、代谢组学研究》文中研究指明棘球蚴病又称包虫病,是由棘球属绦虫的幼虫-棘球蚴寄生于人及其它动物的肝脏、肺脏等组织器官而引起的一种重要的人畜共患寄生虫病。青海省是全国罕见的棘球蚴病的高发区,流行区域主要分布于玉树藏族自治州和果洛藏族自治州各县。两型棘球蚴病（CE/AE）混合流行,且流行程度高、疫情严重。为了摸清青海南部地区儿童棘球蚴病的流行状况和流行特征、青海田鼠Em感染情况及其病原学特征、探索敏感性和特异性的早期诊断技术,本研究对青海南部地区儿童棘球蚴病的感染状况进行了调查分析研究;对青海省果洛藏族自治州久治县的青海田鼠进行了流行病学调查,并进行了Em青海田鼠株的分离、鉴定;利用分离、鉴定的青海田鼠株Em,表达和纯化了EmAgB3和EmAgB3-GGGS-Em18两个蛋白,并利用纯化的这两个蛋白分别进行了ELISA和胶体金免疫试纸条检测方法的探索;利用分离鉴定的Em青海田鼠株构建了Em沙鼠感染模型,并对构建的Em沙鼠感染模型进行了肝脏、脾脏和血浆代谢组学研究。主要研究结论如下:（1）通过采用影像学和血清学诊断方法,对青海南部地区儿童棘球蚴病感染状况进行了调查分析研究,明确了该区域儿童棘球蚴病的流行分布情况和特征。这对患棘球蚴病儿童采取早期诊断和制定最佳治疗方案,保障患病儿童尽早地正常生长发育具有重要的意义。同时,对于健康的儿童,也可以尽早地进行预防、保健及调理。（2）通过对青海省果洛藏族自治州久治县的青海田鼠进行流行病学调查,从捕获的50只青海田鼠中分离、鉴定得到了11株Em,Em感染率为22%。通过对其进行分子生物学分析,确定了Em青海田鼠分离株为亚洲型,且存在不同核苷酸位点的变异。该研究发现进一步确立了青海田鼠作为Em中间宿主在流行病学上的重要地位,这为在该地区通过控制青海田鼠的数量来降低人感染AE的风险提供了一个重要的思路。（3）通过提取Em青海田鼠分离株的基因组DNA,综合利用分子生物学和免疫学技术,克隆、表达和纯化了EmAgB3蛋白和EmAgB3-GGGS-Em18蛋白,获得了高纯度和高浓度的重组蛋白（EmAgB3蛋白的浓度为1.05 mg/mL,EmAgB3-GGGS-Em18蛋白浓度为0.5 mg/mL）。另外,通过利用3C酶酶切的方式,成功将重组EmAgB3蛋白的GST标签进行了切除。进行了纯化和蛋白复性,使其最大程度地恢复了天然EmAgB3蛋白的空间结构和生物学特性,为进一步对其进行更深入的结构、功能和应用研究奠定了物质基础。（4）通过对重组EmAgB3蛋白和重组EmAgB3-GGGS-Em18蛋白进行ELISA和胶体金试纸条技术的包装,分别建立了ELISA和胶体金免疫试纸条的诊断方法。经特异性、敏感性和符合性试验,均具有非常良好的临床诊断应用价值。（5）通过将分离鉴定的Em青海田鼠分离株进行腹腔接种沙鼠的方式,成功构建了Em沙鼠感染模型,感染率高达100%。这为将来进行更深入的针对Em青海田鼠分离株的生物学研究奠定了种子基础。（6）采集了Em沙鼠模型和正常沙鼠对照的肝脏、脾脏和血浆样本,利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析技术,分别对采集的样本进行了非靶标代谢组学研究,筛选获得了数量众多的差异代谢物。肝脏代谢组学分析显示:在肝脏中检测到10493个代谢物,从中筛选出1509个差异代谢物。其中309个代谢物较正常肝脏代谢物上调,1200个代谢物下调;脾脏代谢组学分析显示:在脾脏中检测到8679个代谢物,从中筛选出1111个差异代谢物。其中586个代谢物较正常脾脏代谢物上调,525个代谢物下调;血浆代谢组学分析显示:在血浆中检测到4085个代谢物,从中筛选出316个差异代谢物。其中200个代谢物较正常血浆代谢物上调,116个代谢物下调。这些代谢组学的数据,为将来开展针对特异性代谢物的研究、筛选药物作用靶点和代谢通路提供了参考。
朵红[5]（2016）在《棘球蚴病疫苗研究进展》文中指出棘球蚴病是一种重要的人兽共患病,严重阻碍着畜牧业经济的发展和人民的身体健康,已成为我国西部地区重要的公共卫生问题。长期以来科研工作者在棘球蚴病疫苗研究方面做了大量的工作,已有商品化的疫苗应用于畜牧业生产中。本文对棘球蚴病的基因工程疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗的研究现状和进展进行了综述。
李宏民,娄忠子,李立,李振华,李建秋,闫鸿斌,贾万忠[6]（2014）在《棘球蚴EG95重组蛋白研究进展》文中提出棘球蚴病是一种对人畜危害极为严重的人兽共患寄生虫病,严重威胁我国流行区农牧民身体健康和畜牧业的发展,对该病的预防迫在眉睫。EG95蛋白在细粒棘球蚴发育过程中必不可少、高度保守,是目前为止已发现的最具潜力的疫苗候选抗原之一。国内外学者在EG95重组抗原的构建、表达、应用等方面进行了大量的工作,本文对其进行综述。
李文桂[7]（2014）在《细粒棘球绦虫Eg95疫苗的研制现状》文中认为囊型棘球蚴病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,采用疫苗防治该病是当前研究的热点领域之一。Eg95是一种有效的疫苗候选分子,其疫苗种类有重组抗原、合成肽疫苗、DNA疫苗、重组酵母、重组牛痘病毒疫苗、重组BCG疫苗、转基因苜蓿疫苗和重组双歧杆菌疫苗等。
陈林[8]（2013）在《豆状带绦虫密码子分析与四个功能基因的研究》文中研究指明豆状带绦虫呈世界性分布,成虫寄生于犬、狐狸等终末宿主的小肠,其中绦期幼虫-----豆状囊尾蚴寄生于家兔等兔形目动物的肝脏被膜、肠系膜及大网膜等处,引起家兔的豆状囊尾蚴病。我国是养兔大国,豆状囊尾蚴病流行于24个省区,是家兔的主要寄生虫病之一。本论文在前人研究工作的基础上,进一步对豆状带绦虫生物学、密码子使用情况及功能基因进行了分析和研究,为兔豆状囊尾蚴病诊断试剂及基因工程疫苗的研究提供候选抗原。主要研究内容与结果如下：1、豆状带绦虫生物学研究观察并记录了5只实验犬在人工感染豆状囊尾蚴后的节片排出特征及虫卵感染家兔后豆状囊尾蚴在兔体内的分布特点,结果显示：5只犬在感染豆状囊尾蚴后的第39～57d开始排出节片,最多一天排出158片。孕节中虫卵含量在60～26,480个之间。平均虫卵大小为（41.32±4.53）μm ×（36.23±4.92）μm。虫卵孵化大约需要4～5min。6只健康家兔每只经口感染5000个虫卵,感染后第55d剖杀。检测发现,豆状囊尾蚴主要寄生部位为兔的胃大网膜和直肠浆膜,肝脏被膜数量则较少。2、豆状带绦虫转录组和包括豆状带绦虫在内的43个扁形动物（吸虫和绦虫）线粒体全基因组密码子偏好性分析利用豆状带绦虫转录组数据库中已注释的8118个重构基因进行了同义密码子使用情况的分析,发现：平均GC含量为49.48%；24个密码子被定义为最优密码子,几乎所有的最优密码子（除CGU外）都以G或C结尾；对应分析中,基因在主轴上与对应的第三位密码子GC含量成正相关,同时编码蛋白基因的表达水平、疏水性及芳香性与有效密码子数（ENC）显着相关。对豆状带绦虫等43个扁形动物（吸虫与绦虫）线粒体基因组密码子偏好性分析发现：19个吸虫纲动物的GC3s平均为0.254±0.044；被测绦虫纲动物GC3s平均为0.254±0.044。四重简并密码子家族碱基组成分析表明：第三位密码子U（51.9%）或A（22.7%）的含量要高C（6.3%）或G（19.14%）的含量；包括UUU, UUA及UUG等,24个密码子是高频使用的密码子；ENC-plot图显示,大多数的点分布在期望ENC曲线的下方或周围；在43个扁形动物中,线粒体蛋白编码基因的核酸组成、基因的疏水性和芳香性都与同义密码子的偏好使用有关。3、豆状带绦虫六钩蚴Tp-UBC2基因的原核表达及重组表达蛋白的功能研究从豆状带绦虫六钩蚴的cDNA中扩增了Tp-UBC2基因。Tp-UBC2开放阅读框全长444bp,编码147个氨基酸。构建了其原核表达载体pET32a-Tp-UBC2,表达的重组蛋白分子量为36.63kDa。经免疫印迹检测,该重组蛋白能与家兔豆状囊尾蚴病阳性血清特异性结合。以80μg纯化的Tp-UBC2重组蛋白及皂素佐剂皮下免疫兔,免疫后7d加强1次,第2次免疫后14d用5000枚豆状带绦虫虫卵口服感染,感染后50d剖检,重组蛋白的减虫率为79.3%。以重组蛋白rTp-UBC2作为包被抗原建立的兔豆状囊尾蚴病Dot-ELISA诊断方法,对226份兔血清的检测结果显示有较高的敏感性（83.3～97.6%）和特异性（88.8-98.4%）。4.豆状带绦虫六钩蚴Tpl基因的原核表达及Dot-ELISA诊断方法的建立。采用RACE技术从豆状带绦虫六钩蚴中扩增出了Tpl基因,Tpl基因全长684bp,编码227个氨基酸,构建了pET32a-Tp1原核表达载体,经IPTG诱导获得分子量约为45.8kDa的重组蛋白。该重组蛋白能与家兔豆状囊尾蚴病阳性血清特异性结合。以重组蛋白Tp1作为包被抗原建立的兔豆状囊尾蚴病Dot-ELISA诊断方法对226份兔血清进行了检测,具有较高的敏感性（92.9～97.6%）和特异性（95.2～98.4%）。5.豆状带绦虫六钩蚴Tp-dUTPase基因的原核表达及Dot-ELISA诊断方法的建立采用PCR方法从豆状带绦虫六钩蚴中扩增得到Tp-dUTPase基因,编码区序列长447bp,编码148个氨基酸。构建了pET32a-Tp-dUTPase原核表达载体,表达的重组蛋白分子量为36.20kDa。该重组蛋白能与家兔豆状囊尾蚴病阳性血清特异性结合。以重组蛋白dUTPase作为包被抗原建立了兔豆状囊尾蚴病Dot-ELISA诊断方法,对226份兔血清进行了检测,结果显示有较高的敏感性（85.7～92.9%）和特异性（86.4～88.0%）。6.豆状带绦虫六钩蚴Tp-TSP2基因生物信息学分析采用PCR方法,从豆状带绦虫六钩蚴中扩增了Tp-TSP2基因,并构建了pET32a-Tp-TSP2原核表达载体。Tp-TSP2基因编码区长621bp,编码206个氨基酸。预测该重组蛋白的相对分子量为52.40kDa,pI值为5.18,有2个B细胞抗原表位,与多房棘球绦虫TSP2基因相似度为92.23%。
刘晓霞[9]（2013）在《细粒棘球蚴egG1Y162-1、egG1Y162-2疫苗诱导小鼠保护作用机制的研究》文中研究说明目的:在成功构建egG1Y162-1与egG1Y162-2重组蛋白,并确定其具有良好的抗原性与免疫原性的基础上,将疫苗egG1Y162-1与egG1Y162-2免疫BALB/c小鼠,并用细粒棘球原头呦攻击感染,研究免疫保护作用及其作用机制,为包虫病疫苗的研制提供新的候选分子。方法:（1）动物动物分组方案:选取140只小鼠随机分为A实验组（egG1Y162-1组）、B实验组（egG1Y162-2组）和C对照组（佐剂组）、D对照组（生理盐水对照组）,分别对其进行肢下注射egG1Y162-1、egG1 Y162-2、生理盐水+佐剂和生理盐水,之后进行三次加强免疫。4组均于末次免疫后两周（即第8W）用1000只细粒棘球蚴的原头蚴腹腔攻击感染。在第30w剖杀各组剩余小鼠,分离并称重细粒棘球坳囊,计算囊重抑制率。免疫保护力计算,免疫保护力计算公式:囊重抑制率=1-实验组平均包囊湿重/对照组平均包囊湿重×100%。对小鼠的免疫保护机制进行研究,体液免疫指标抗体水平的测定:从开始按不同的时间点0W（第一次免疫前）、2W（第二次免疫前）、4W（第三次免疫前）、6W（第四次免疫前）、8W（免疫后/感染前）、30W（感染后）,分别对各组小鼠采血,检验血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgE水平的变化;细胞免疫指标细胞因子水平的检测:在0W、8W、30W,分别分组对小鼠采血,进行血清细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-a、IL-4和IL-10的监测;用FCM检测小鼠感染后30W脾细胞CD4+和CD8+、亚群的变化,并检测CD4+CD25+T reg细胞、CD4+CD25+Foxp3+T reg细胞的改变。用CCK-8法检测小鼠8W和30W脾细胞增殖水平的改变;通过采用Annexin V-FITC试剂盒检测30W时脾细胞原液或用Con A刺激培养时细胞凋亡发生率。结果:（1）egGIY162-1、egG1Y162-2疫苗均可以诱导小鼠产生明显免疫保护力。（2）采集血清进行ELISA试验检测血清中抗体IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgE的变化,结果表明IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgE在免疫后实验组不同程度的上升,与对照组相比具有统计学意义。其中IgG、IgG2a、lgG2b和IgE在免疫后8达到最高水平,在感染后期下降;而 IgG1在免疫后升高后在感染后期达到最好水平。血清细胞因子IL-2、IFN-y、TNF-α、IL-4和IL-10的检测结果显示,IL-2和TNF-αα水平在第8W（免疫后）达到最高水平,在第30W（感染后）下降;IFN-γ、IL-4和IL-10在第8W（免疫后）出现增高趋势,在第30W（感染后）达到峰值。实验组与对照组差异均有统计学意义。FCM结果显示在第30W（感染后）实验组脾细胞CD4+和CD8+亚群出现明显升高,CD4+CD25+Treg水平降低。用CCK-8法检测小鼠8W（免疫后）和30W（感染后）显示疫苗组小鼠脾细胞增值情况均高于对照组,同组ConA刺激后增殖又高于疫苗刺激组,感染后同组同样刺激条件下脾细胞增殖水平出现下降。AnnexinV-FITC试剂盒检测脾细胞凋亡发生率,显示egG1Y162-1、egG1Y162-2疫苗组凋亡率低于对照组,而佐剂对照组和生理盐水对照组之间无明显差异。结论:egG1Y162-1与egG1Y162-2为极具应用潜质的疫苗候选分子。对疫苗egG1Y162-1与egG1Y162-2产生的免疫保护性可能机制有,抗体介导的体液免疫,IgG及其亚类IgG2a、IgG2b和IgE介导的体液免疫,在抗细粒棘球蚴感染过程中发挥重要作用;细胞免疫中,细胞因子水平变化显示Th1类免疫应答在疫苗免疫组的保护中占优势作用,有利于机体抵御细粒棘球呦的感染;疫苗egG1Y162-1与egG1Y162-2可诱导感染小鼠增强CD4+T的免疫应答作用,同时可以降低CD4+CD25+T reg的免疫抑制效应;疫苗egG1Y162-1与egG1Y162-2可通过增强感染小鼠的脾T淋巴细胞增殖能力,降低其凋亡抑制率,整体上提高脾T淋巴细胞的免疫功能。该疫苗候选分子的注入使得免疫抑制机制得到了有效地阻遏,有利于机体的抗寄生虫。
李宏民[10]（2012）在《绵羊细粒棘球蚴病病理组织学观察及EG95重组抗原体外表达研究》文中指出细粒棘球蚴病（Echinococcosis）又称囊性包虫病（cystic echinococcosis, CE），是由处于细粒棘球绦虫的幼虫（续绦期）寄生于人体或某些动物体内引起的人畜共患寄生虫病，该病对人畜危害极为严重。细粒棘球蚴病呈全球性分布，主要在牧区、农牧区流行，中国是该病的高发区。细粒棘球蚴病在我国的甘肃、新疆、宁夏、内蒙古、青海、四川、陕西、西藏等西部、西北部省份尤为严重。该病严重威胁牛、羊等家畜以及人的身体健康，导致动物生产性能严重下降，使我国畜牧业每年直接经济损失高达30多亿元，是中国西部和西北部最严重的公共健康问题之一。目前对该病的控制主要以犬驱虫和对牧民的预防教育等综合性防制措施为主，但因种种因素限制，此举措未获得理想效果。通过疫苗预防将是控制该病的理想途径之一。现代分子生物学、生物化学和免疫学新技术的发展及其在寄生虫病疫苗研究中的应用，使棘球蚴病疫苗的研制取得了重大进展，基因工程重组抗原疫苗具有极大的应用价值。众多研究表明，EG95蛋白是目前发现的最具保护作用的抗原，EG95重组基因疫苗也是近年来的研究热点。从青海省某屠宰场搜集患细粒棘球蚴病绵羊，观察内脏器官病变，取寄生虫包囊及其周围肝脏、肺脏组织，进行石蜡切片、HE染色，进行组织病变观察。结果显示，细粒棘球蚴包囊的组织学结构具有典型的寄生虫肉芽肿特征；内侧为红染的板层状结构；外侧为特殊肉芽层，主要由上皮样细胞构成，可见多核巨细胞和少量的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润；而包囊壁最外层则由成纤维细胞及胶原纤维组成，其中有大量淋巴细胞浸润。包囊的形成对器官造成的损伤是多方面的，除包囊占位性病变造成的组织压迫性萎缩外，并见肝脏间质结缔组织及胆管大量增生造成肝硬变，肝脏急性变性、过敏性炎症等损伤性反应。肺脏可见间质增生炎症及囊液外渗引起的过敏性炎症反应。从细粒棘球蚴病病羊的肝脏以及肺脏分离包囊，抽取囊液，离心取沉淀，分离基因组DNA，用PCR方法扩增NADH脱氢酶亚基1（ND1）基因并测序。通过GenBank中BLAST分析，结果显示所获ND1序列与细粒棘球绦虫（G1基因型） ND1序列相似性达99.9%，确定该地区流行的细粒棘球蚴为G1基因型，此法可用于细粒棘球蚴基因型的快速判定。取包囊囊液，沉淀原头蚴，提取总RNA，利用RT-PCR技术从细粒棘球蚴中扩增了EG95基因cDNA，构建了重组克隆载体pGEM-T-EG95cDNA，转化E. co1i JM109感受态细胞，经抗生素筛选获得重组子并测序，结果发现EG95基因cDNA序列与Genebank中公布的EG95基因cDNA序列（AY421719）编码区未出现碱基差异，因而编码的氨基酸未发生改变。通过一系列预测分析软件对EG95基因以及蛋白的相关特性及抗原表位加以预测分析，同时根据分析结果设计引物进行信号肽和疏水区的切除。分别用全长的EG95cDNA、切去信号肽和疏水区的EG95s构建不同的重组表达载体。在E. coli Rosett（aDE3）中诱导表达了预期大小的目的蛋白，其中既有以包涵体形式表达的EG95蛋白也有以可溶形式表达的EG95蛋白。将表达蛋白进行处理后进行SDS-PAGE，然后进行Western-blot检测，结果表明表达蛋白具有良好的抗原特异性。该蛋白的成功表达，为细粒棘球蚴基因工程疫苗的开发生产奠定了基础。
二、全长细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及DNA疫苗的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、全长细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及DNA疫苗的构建（论文提纲范文）
（1）表达细粒棘球蚴EG95蛋白重组狂犬病病毒的构建及免疫研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 结果 |
| 4.1 重组病毒LBNSE-EG95的感染性克隆的鉴定 |
| 4.2 重组病毒LBNSE-EG95的RT-PCR鉴定 |
| 4.3 重组病毒LBNSE-EG95的免疫荧光鉴定 |
| 4.4 重组病毒LBNSE-EG95的流式细胞鉴定 |
| 4.5 重组病毒LBNSE-EG95的Western blot鉴定 |
| 4.6 重组病毒LBNSE-EG95的生长特性 |
| 4.7 重组病毒LBNSE-EG95的动物免疫评价 |
| 4.8 淋巴细胞的激活/募集 |
| 4.9 特异性T细胞反应 |
| 4.10 特异性IgG亚型 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新与不足 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表论文情况 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）西藏阿里地区细粒棘球蚴基因多态性分析及其中间宿主淋巴细胞功能状态的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 西藏地区细粒棘球绦虫基因多态性的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细粒棘球绦虫包囊的获取与保存 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 线粒体基因的PCR扩增 |
| 2.2.3 PCR扩增产物的序列测定及分析 |
| 2.2.4 棘球蚴单倍型网络图 |
| 2.3 伦理批准和患者知情同意 |
| 3 结果 |
| 3.1 细粒棘球蚴病人基本信息分析结果 |
| 3.2 线粒体基因PCR扩增结果 |
| 3.2.1 线粒体电泳图结果 |
| 3.2.2 线粒体比对结果 |
| 3.2.3 线粒体碱基变异结果 |
| 3.2.4 细粒棘球蚴人体分离株基于线粒体基因构建系统发生树结果 |
| 3.2.5 细粒棘球蚴人体分离株基于线粒体基因构建单倍型网络图结果 |
| 3.2.6 细粒棘球蚴人体分离株基于线粒体基因构建全国单倍型网络图结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 细粒棘球蚴感染宿主淋巴细胞功能状态的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 血清的获取与保存 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器和软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原头节的制备及动物感染 |
| 2.2.2 外周血单细胞悬液的制备及流式染色 |
| 2.2.3 细胞因子检测 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 流式检测小鼠淋巴细胞动态结果 |
| 3.1.1 T、B淋巴细胞比例的动态变化 |
| 3.1.2 抑制性受体PD-1在T和B淋巴细胞的表达 |
| 3.1.3 CD4~+T和CD8~+T细胞比例的动态变化 |
| 3.1.4 抑制性受体PD-1在CD4~+T和CD8~+T细胞的表达 |
| 3.2 小鼠血清中细胞因子检测结果 |
| 3.2.1 Th1类细胞因子结果 |
| 3.2.2 Th2类细胞因子结果 |
| 3.2.3 促炎性细胞因子结果 |
| 3.2.4 抑炎性细胞因子结果 |
| 3.3 细粒棘球蚴病人血清中细胞因子检测结果 |
| 3.3.1 Th1与Th2类细胞因子结果 |
| 3.3.2 促炎与抑炎性细胞因子结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表及待发表文章 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）细粒棘球绦虫TSP8、TSP11基因的原核表达及免疫学初步分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 细粒棘球蚴病概述 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 诊断方法 |
| 2 细粒棘球蚴病疫苗研制研究进展 |
| 2.1 细粒棘球绦虫中间宿主疫苗研究进展 |
| 2.2 细粒棘球绦虫终末宿主疫苗研究进展 |
| 3 四跨膜蛋白的研究进展 |
| 3.1 四跨膜蛋白的功能 |
| 3.2 寄生虫四跨膜蛋白研究进展 |
| 4 细粒棘球绦虫免疫学概述 |
| 4.1 细粒棘球绦虫的免疫逃避机制 |
| 4.2 包虫病中不同Th类型细胞因子的作用 |
| 5 展望 |
| 6 结语 |
| 第二章 试验内容 |
| 试验一 细粒棘球绦虫TSP8、TSP11 基因的克隆及序列测序 |
| 1.材料 |
| 1.1 虫株、质粒和菌株 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 原头蚴总RNA的提取 |
| 2.3 反转录及目的基因的PCR扩增 |
| 2.4 RCR产物的回收、克隆以及测序 |
| 2.5 TSP基因的生物信息学分析 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 总RNA质量检测 |
| 3.2 TSP基因的克隆 |
| 3.3 生物信息学分析 |
| 4.讨论 |
| 试验二 细粒棘球绦虫TSP8、TSP11 基因的原核表达 |
| 1.材料 |
| 1.1 质粒和菌株、血清 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 目的基因的PCR扩增 |
| 2.3 RCR产物的回收、克隆以及测序 |
| 2.4 重组表达载体的构建 |
| 2.5 重组蛋白的表达 |
| 2.6 重组蛋白的可溶性分析 |
| 2.7 SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.8 重组蛋白的纯化 |
| 2.9 鼠抗rEg-TSP-IgG的制备 |
| 2.10 免疫印迹分析 |
| 2.11 免疫荧光鉴定 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 TSP基因主要抗原区域的扩增 |
| 3.2 重组p ET32a-TSP质粒的鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的表达与抗原性分析 |
| 4.讨论 |
| 试验三 重组蛋白免疫学初步分析 |
| 1.材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.方法 |
| 2.1 制备特异性抗血清 |
| 2.2 重组蛋白免疫学初步分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 qPCR法检测TSP免疫小鼠体内细胞因子变化 |
| 3.2 ELISA法检测TSP免疫小鼠体内抗体水平变化 |
| 4.讨论 |
| 第三章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（4）青南儿童棘球蚴病调查分析及AE免疫学诊断、代谢组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 棘球蚴病简史 |
| 2 病原体及其特征 |
| 2.1 生物学分类地位 |
| 2.2 棘球属绦虫种类及其形态 |
| 2.2.1 细粒棘球绦虫 |
| 2.2.2 多房棘球绦虫 |
| 2.3 棘球绦虫的生活史 |
| 3 棘球蚴病临床症状 |
| 4 棘球蚴病的流行分布情况 |
| 5 泡型棘球蚴病动物模型构建研究进展 |
| 5.1 理想的Em动物模型应具备的特点 |
| 5.2 动物模型建立的方法 |
| 5.2.1 口服虫卵感染 |
| 5.2.2 经皮肝穿刺法 |
| 5.2.3 开腹肝穿刺法 |
| 5.2.4 切开皮肤经腹壁肌层肝穿刺法 |
| 5.2.5 门静脉分支注射法 |
| 5.2.6 腹腔注射法 |
| 5.3 动物模型评价方法 |
| 5.3.1 剖检法 |
| 5.3.2 影像学方法 |
| 5.3.3 免疫学方法 |
| 6 诊断方法研究进展 |
| 6.1 病原学检测 |
| 6.2 影像学诊断 |
| 6.3 血清免疫学诊断 |
| 6.4 DNA检测 |
| 7 分子生物学研究进展 |
| 7.1 基因组特征 |
| 7.2 棘球蚴代谢组学研究进展 |
| 7.3 棘球蚴蛋白质组学研究进展 |
| 8 棘球蚴病疫苗免疫学研究进展 |
| 8.1 基因工程疫苗 |
| 8.2 核酸(DNA)疫苗 |
| 8.3 多肽疫苗 |
| 9 本研究的目的和意义 |
| 第二章 青南地区儿童棘球蚴病感染状况的调查分析研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 调查区域 |
| 1.2 学校调查 |
| 1.3 超声检查 |
| 1.4 血清学检测 |
| 1.4.1 前期准备 |
| 1.4.2 样品检测 |
| 1.4.3 参考范围 |
| 1.4.4 结果判定 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 儿童棘球蚴病病例的地理分布情况 |
| 2.2 儿童棘球蚴病病例的性别和年龄分布情况 |
| 2.3 儿童棘球蚴病的地域分布情况 |
| 2.4 AE和 CE病变的超声分类 |
| 3 讨论 |
| 第三章 青海田鼠株多房棘球蚴的分离鉴定及系统进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 青海田鼠的捕获 |
| 1.2 捕获青海田鼠解剖及囊液收集 |
| 1.3 包囊HE染色 |
| 1.4 原头蚴分离及镜检 |
| 1.5 PCR分析 |
| 1.6 进化分析 |
| 1.7 Em感染的青海田鼠物种的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 样本收集 |
| 2.2 捕获青海田鼠的解剖特征 |
| 2.3 包囊原头蚴HE染色 |
| 2.4 原头蚴分离及镜检 |
| 2.5 PCR分析 |
| 2.6 进化分析 |
| 2.7 Em感染的青海田鼠物种的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 EmAgB3 蛋白及串联EmAgB3-GGGS-Em18 蛋白的克隆表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 寄生虫 |
| 1.1.2 质粒及菌种 |
| 1.1.3 试剂与仪器 |
| 1.1.4 扩增用引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 EmAgB3及Em18 基因的克隆及序列测定 |
| 1.2.2 EmAgB3和EmAgB3-GGGS-Em18 的基因合成 |
| 1.2.3 载体酶切 |
| 1.2.4 目的片段与载体连接 |
| 1.2.5 转化E.coli DH5α感受态细胞后筛选克隆 |
| 1.2.6 诱导表达融合蛋白 |
| 1.2.7 蛋白的纯化 |
| 1.2.8 纯化蛋白的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmAgB3及Em18 基因的克隆及序列测定 |
| 2.1.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 |
| 2.1.2 PCR产物克隆测序鉴定 |
| 2.2 Bam HI-EmAgB3-Xho I及 Nde I-EmAgB3-GGGS-Em18-Xho I基因生物合成 |
| 2.3 重组载体酶切鉴定 |
| 2.4 融合蛋白诱导结果 |
| 2.5 融合蛋白GST/镍琼脂糖亲和层析纯化 |
| 2.6 EmAgB3 融合蛋白酶切后SDS-PAGE检测 |
| 2.7 EmAgB3 融合蛋白酶切后透析 |
| 2.8 蛋白最终Tricine-SDS-PAGE分析 |
| 2.9 目的蛋白Western blot分析 |
| 2.10 蛋白浓度测定 |
| 3 讨论 |
| 第五章 基于EmAgB3和EmAgB3-GGGS-Em18 重组蛋白的AE ELISA诊断方法的建立及应用. |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗原 |
| 1.1.2 血清 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器耗材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 基本方法 |
| 1.2.2 抗原包被用浓度及阳性血清稀释倍数的筛选 |
| 1.2.3 临界值的确定及判定方法 |
| 1.2.4 特异性检测 |
| 1.2.5 符合性检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 抗原包被用浓度及阳性血清稀释倍数确定 |
| 2.2 临界值的确定 |
| 2.3 特异性交叉检测 |
| 2.4 符合性检测 |
| 3 讨论 |
| 第六章 基于重组蛋白EmAgB3和EmAgB3-GGGS-Em18 的棘球蚴病胶体金试纸条诊断方法的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗原 |
| 1.1.2 血清 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器耗材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 所需溶液配制 |
| 1.2.2 材料准备 |
| 1.2.3 胶体金的制备 |
| 1.2.4 胶体金标记二抗(山羊抗人Ig G Fc)及纯化 |
| 1.2.5 金标垫、样品垫处理 |
| 1.2.6 喷金与划膜 |
| 1.2.7 组装与测试 |
| 1.2.8 特异性试验 |
| 1.2.9 敏感性试验 |
| 1.2.10 符合性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 特异性试验 |
| 2.2 敏感性试验 |
| 2.3 符合性试验 |
| 3 讨论 |
| 第七章 Em沙鼠模型的建立及其代谢组学的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验鼠及寄生虫虫株 |
| 1.1.2 样品 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器耗材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 Em沙鼠模型的建立 |
| 1.2.2 代谢组学研究用样本采集 |
| 1.2.3 代谢物提取 |
| 1.2.4 上机检测 |
| 1.2.5 数据处理 |
| 1.2.6 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Em沙鼠模型的建立 |
| 2.2 沙鼠组织UHPLC-QTOF-MS检测 |
| 2.3 质量控制 |
| 2.3.1 过程质控 |
| 2.3.2 数据质控 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.4.1 肝脏代谢组学变化 |
| 2.4.2 脾脏代谢组学变化 |
| 2.4.3 血浆代谢组学变化 |
| 3 讨论 |
| 第八章 结论与展望 |
| 1 研究结论 |
| 2 创新点 |
| 3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目及发表论文 |
| 导师简介 |
（5）棘球蚴病疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 基因工程疫苗 |
| 2 核酸疫苗 |
| 3 多肽疫苗 |
| 4结语 |
（6）棘球蚴EG95重组蛋白研究进展（论文提纲范文）
| 1 EG95抗原基因的研究 |
| 2 EG95重组蛋白表达技术研究 |
| 2.1 重组EG95蛋白的原核表达 |
| 2.1.1 大肠杆菌表达的EG95重组蛋白 |
| 2.1.2 根瘤农杆菌表达系统表达EG95重组蛋白 |
| 2.1.3 结核分枝杆菌表达的EG95重组蛋白 |
| 2.1.4 重组双歧杆菌表达的EG95重组蛋白 |
| 2.2 重组EG95抗原的真核表达 |
| 2.2.1 用酵母进行表达的EG95重组蛋白 |
| 2.2.2 用杆状病毒-昆虫细胞系统进行表达的EG95重组蛋白 |
| 2.2.3 病毒活载体表达EG95重组蛋白 |
| 2.3 EG95DNA疫苗 |
| 3 EG95人工合成肽 |
| 4 展望 |
（7）细粒棘球绦虫Eg95疫苗的研制现状（论文提纲范文）
| 1 Eg95重组抗原 |
| 2 Eg95合成肽疫苗 |
| 3 Eg95 DNA疫苗 |
| 4 Eg95重组酵母 |
| 5 Eg95重组牛痘病毒疫苗 |
| 6 Eg95重组BCG疫苗 |
| 7 Eg95转基因苜蓿疫苗 |
| 8 Eg95重组双歧杆菌疫苗 |
| 9 结语 |
（8）豆状带绦虫密码子分析与四个功能基因的研究（论文提纲范文）
| 本论文创新性工作 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 一 带科绦虫主要虫种功能基因研究进展 |
| 1 猪带绦虫 |
| 2 细粒棘球绦虫 |
| 3 多房棘球绦虫 |
| 4 多头带绦虫 |
| 5 牛带绦虫及亚洲带绦虫 |
| 6 其他带科绦虫 |
| 7 展望 |
| 二、选题目的和意义 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 豆状带绦虫生物学研究 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 豆状带绦虫转录组密码子偏好性分析 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 豆状带绦虫及其他42种扁形动物(吸虫与绦虫)线粒体基因组密码子偏好性分析 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 豆状带绦虫Tp-UBC2基因克隆、原核表达及重组表达蛋白的功能研究 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 豆状带绦虫Tp1基因的克隆、原核表达及重组抗原Dot-ELISA诊断方法的建立 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第六章 豆状带绦虫Tp-dUTPase基因的克隆、原核表达及重组抗原Dot-ELISA方法的建立 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第七章 豆状带绦虫Tp-TSP2基因序列分析及重组质粒的构建 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的论文 |
（9）细粒棘球蚴egG1Y162-1、egG1Y162-2疫苗诱导小鼠保护作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 内容与方法 |
| 1. 研究对象 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 接种物制备 |
| 1.3 实验动物模型制备 |
| 1.4 标本采集 |
| 2. 内容与方法 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 实验技术路线图 |
| 3质量控制 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述（一） |
| 参考文献 |
| 文献综述（二） |
| 参考文献 |
| 导师评阅表 |
（10）绵羊细粒棘球蚴病病理组织学观察及EG95重组抗原体外表达研究（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 细粒棘球蚴病 |
| 1.2 细粒棘球绦虫 |
| 1.2.1 细粒棘球绦虫形态学 |
| 1.2.2 细粒棘球绦虫生活史 |
| 1.3 细粒棘球蚴病流行病学 |
| 1.3.1 细粒棘球蚴病的流行特征 |
| 1.3.2 细粒棘球蚴病流行现状 |
| 1.4 细粒棘球蚴病诊断、防治现状及建议 |
| 1.4.1 细粒棘球蚴病诊断 |
| 1.4.2 细粒棘球蚴病防治现状 |
| 1.4.3 细粒棘球蚴病防治建议 |
| 1.5 绵羊细粒棘球蚴病病理组织学研究现状 |
| 1.6 EG95 基因研究的意义 |
| 1.7 EG95 重组抗原的研究进展 |
| 1.7.1 大肠杆菌表达的 EG95 重组蛋白 |
| 1.7.2 根瘤农杆菌表达系统表达 EG95 重组蛋白 |
| 1.7.3 BCG 菌表达的 EG95 重组蛋白 |
| 1.7.4 用甲醇酵母进行表达的 EG95 重组蛋白 |
| 1.7.5 用杆状病毒-昆虫细胞系统进行表达的 EG95 重组蛋白 |
| 1.7.6 病毒活载体表达 EG95 重组蛋白 |
| 1.7.7 EG95 DNA 疫苗 |
| 1.7.8 EG95 人工合成肽 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 绵羊细粒棘球蚴病病原株型鉴定与病理学观察 |
| 2.1.1 绵羊细粒棘球蚴病病原株型鉴定 |
| 2.1.2 绵羊细粒棘球蚴病的病理学观察 |
| 2.2 EG95 重组基因的构建和表达研究 |
| 2.2.1 EG95 基因的克隆分析 |
| 2.2.2 EG95 重组抗原的表达 |
| 2.3 可溶性 EG95 重组蛋白的抗原性检测 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 绵羊细粒棘球蚴病病原株型鉴定与病理学观察 |
| 3.1.1 绵羊细粒棘球蚴病病原株型鉴定 |
| 3.1.2 绵羊细粒棘球蚴病的临诊表现及病理学观察 |
| 3.2 EG95 重组基因的构建和表达研究 |
| 3.2.1 EG95 基因的克隆分析 |
| 3.2.2 EG95 重组蛋白的表达与可溶性分析 |
| 3.2.3 可溶性 EG95 重组蛋白的抗原性检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的文章及获得的成果： |
四、全长细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及DNA疫苗的构建（论文参考文献）
- [1]表达细粒棘球蚴EG95蛋白重组狂犬病病毒的构建及免疫研究[D]. 许彤. 山东大学, 2021(09)
- [2]西藏阿里地区细粒棘球蚴基因多态性分析及其中间宿主淋巴细胞功能状态的研究[D]. 魏玉环. 中国疾病预防控制中心, 2020(03)
- [3]细粒棘球绦虫TSP8、TSP11基因的原核表达及免疫学初步分析[D]. 王炜烨. 石河子大学, 2020(08)
- [4]青南儿童棘球蚴病调查分析及AE免疫学诊断、代谢组学研究[D]. 蔡其刚. 甘肃农业大学, 2019
- [5]棘球蚴病疫苗研究进展[J]. 朵红. 青海畜牧兽医杂志, 2016(06)
- [6]棘球蚴EG95重组蛋白研究进展[J]. 李宏民,娄忠子,李立,李振华,李建秋,闫鸿斌,贾万忠. 中国人兽共患病学报, 2014(10)
- [7]细粒棘球绦虫Eg95疫苗的研制现状[J]. 李文桂. 国外医学(医学地理分册), 2014(01)
- [8]豆状带绦虫密码子分析与四个功能基因的研究[D]. 陈林. 四川农业大学, 2013(09)
- [9]细粒棘球蚴egG1Y162-1、egG1Y162-2疫苗诱导小鼠保护作用机制的研究[D]. 刘晓霞. 新疆医科大学, 2013(05)
- [10]绵羊细粒棘球蚴病病理组织学观察及EG95重组抗原体外表达研究[D]. 李宏民. 山东农业大学, 2012(02)