一、西尼罗河病毒感染的幸存者预后良好（论文文献综述）
张福良[1]（2021）在《猪日本乙型脑炎病毒单克隆抗体制备及快速检测方法的建立》文中研究表明流行性日本乙型脑炎（Epidemic encephalitis B）,简称乙脑,是由日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的一种人畜共患病,是威胁人类尤其是儿童健康的主要传染病之一。猪被认为是乙脑流行环节中的“放大宿主”,日本乙型脑炎病毒可在猪体内大量繁殖,从而引起明显的病毒血症。此外,日本乙型脑炎病毒还可以通过蚊子在猪群之间进一步传播,对中国养猪业造成重大经济损失。日本乙型脑炎的防控不仅需要疫苗的有效防疫,也需要简便、快捷、准确的诊断与检测。单克隆抗体（Monoclonal antibodies,Mc Ab）具有高度特异性的优点,基于单抗而建立的日本乙型脑炎抗原抗体诊断方法具有很大的应用前景。本研究进行了日本乙型脑炎病毒单克隆抗体的制备及其抗原抗体检测方法的建立与初步应用。本研究建立了一种较为温和地纯化日本乙型脑炎病毒的双重凝胶层析方法,与病毒原液相比,双重凝胶层析纯化后日本乙型脑炎病毒的回收率和总蛋白去除率分别为61.04%和99.71%,HCP和BSA去除率分别达到98.72%和99.72%,表明在经过膜包超滤浓缩及琼脂糖凝胶分子筛层析（TFF-SEC）后,进一步进行Capto TMCore700层析能够获得纯度更高、完整性更好,且具有良好免疫原性和生物学活性的病毒颗粒。以TFF-SEC-Capto TMCore700纯化的日本乙型脑炎病毒粒子作为抗原,采用IPMA、IFA和间接ELISA相结合的手段,建立了日本乙型脑炎病毒单抗体外（Vero细胞系）筛选的试验方法。研究共筛选到5株单克隆抗体:29E3、29F8、4B4、2F2和36A6,其杂交瘤细胞培养上清效价在1:800～1:1600之间;接种小鼠后,制备的腹水效价在1:5.12×105～1:2.56×106之间。类和亚型鉴定表明,4B4和36A6为Ig G1类,29E3、29F8和2F2为Ig G2α类,29E3、29F8和2F2轻链为κ链,4B4和36A6轻链为λ链。稳定性测定试验表明,五株杂交瘤细胞均能稳定、持续分泌特异性抗体。Western blot鉴定结果显示,29F8和2F2单克隆抗体可以特异性识别JEV的E蛋白。应用纯化的日本乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体,制备了可用于检测日本乙型脑炎病毒的胶体金试纸。试纸条特异性强,检测极限约可达103～104TCID50/100μL,重复性、稳定性良好,可广泛应用于生产、临床上多种样品检测。研究进一步优化了各种检测条件,并对临床检测日本乙型脑炎病毒阴性、阳性血清临界值进行了判定,建立了日本乙型脑炎病毒单抗阻断ELISA检测方法,最低可检测到1:1600倍稀释的阳性血清,具有较强的特异性;批内、批间重复性试验的变异系数均小于5%。综上所述,本研究成功建立了日本乙型脑炎病毒单抗体外筛选方法,并获得5株能稳定、持续分泌特异性抗体的杂交瘤细胞;成功建立了日本乙型脑炎病毒单抗阻断ELISA检测方法。
刘延刚[2]（2020）在《乙型脑炎病毒入侵脑微血管内皮细胞机制研究》文中研究表明研究背景与目的流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis）是一种由乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）感染引起的严重神经系统疾病,也是目前人类最常见的病毒性脑炎。尽管疫苗的使用极大地降低了其发病率,但是目前每年全世界仍报告接近七万JEV感染病例。这些病例大多分布在亚太区域,其中超过50%在我国河南和云贵川等地区。近年来,随着气候变化,人群迁移和病毒变异等原因,其发病率又有逐渐升高的趋势。由于临床上尚无特异性药物可用于治疗JEV感染引起的神经症状,导致该病病死率居高不下,幸存者中30%～50%会留下神经或精神后遗症,给公共卫生和社会带来了沉重的负担。因此,亟需深入探索JEV的致病机制,为开发有效抗病毒的药物提供坚实的理论依据。JEV是一种蚊媒传播的黄病毒,经蚊子叮咬人后首先引起局部感染,随后释放入血并穿越血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）感染神经元,造成中枢神经系统广泛炎症。其中,突破BBB是JEV发挥致病作用的关键步骤和重要前提,但是目前对于JEV穿越BBB的机制仍然知之甚少。脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells,BMEC）作为BBB的主要成分,决定了BBB的结构和功能的完整性,也是阻止JEV穿越BBB的第一道防线。JEV感染BMEC是其发挥穿越BBB作用的初始事件。通过劫持内吞途径入侵（entry）细胞是病毒感染的首要步骤,涉及多种细胞过程和宿主蛋白。研究已经对JEV入侵多种类型宿主细胞的方式进行了表征,但目前对于JEV感染BMEC的入侵机制仍然不明确。在本课题中,通过干扰RNA文库系统筛选,我们鉴定出内吞途径相关分子caveolin-1和ezrin等宿主因子在JEV感染BMEC中的关键作用。在此基础上,我们将对JEV入侵BMEC所涉及的内吞途径和具体分子机制进行系统地研究。这不仅将加深对JEV穿越BBB机制的理解,还可以为抗JEV药物的开发提供重要的靶点。一、乙型脑炎病毒感染脑微血管内皮细胞的宿主因子筛选及内吞途径研究研究方法1.建立原代人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cell,HBMEC）单层模型,采用靶向人膜转运相关蛋白的干扰RNA文库系统筛选参与JEV感染的关键宿主因子。2.采用si RNA或化学抑制剂氯丙嗪抑制HBMEC中网格蛋白（clathrin）表达及功能,通过间接免疫荧光法和内吞（内化）实验分别检测对JEV的感染和入侵的影响。3.采用si RNA、化学抑制剂菲律平III或通过表达caveolin-1显性抑制突变体抑制小窝蛋白依赖的内吞途径,检测对JEV的感染和入侵的影响。4.对病毒和内吞途径标志性分子进行双重荧光标记,通过激光共聚焦技术分析JEV与clathrin和caveolin-1的定位关系。研究结果1.在接触培养48 h后,HBMEC呈单层极化生长,顶端面形成微绒毛结构,并高度表达内皮细胞标志分子血管性血友病因子和紧密连接蛋白Claudin-5。2.通过筛选,鉴定出18种宿主因子,这些因子的下调对JEV感染HBMEC的抑制率达到50%以上,包括:内吞途径标志分子CAV1（caveolin-1）;转运所需内体分选复合物组成蛋白HGS和VPS4A;膜融合过程关键分子NSF和SYT1;肌动蛋白重组相关蛋白ACTR2、ACTR3、ARPC3、ARPC4、RAC1、EZR和WAS;内体和囊泡转运相关蛋白COPA、GAF1、RAB4B、RAB5A、RAB5B和RAB11B。3.绘制出校正的病毒入侵动力学曲线,显示0-6 h JEV内化（内吞）不断增加,到6 h达到最高。4.下调clathrin表达或抑制clathrin功能并不影响JEV在HBMEC中的感染率和内吞。5.下调caveolin-1表达或抑制caveolin-1功能,JEV在HBMEC中的感染率和内吞显着减少。6.JEV感染2 h时,病毒颗粒与caveolin-1在HBMEC膜皱褶处广泛共定位,而在细胞膜和胞内均不与clathrin共定位。结论JEV主要通过小窝蛋白介导的内吞途径入侵脑微血管内皮细胞,而不需要网格蛋白介导的内吞途径参与。同时,肌动蛋白细胞骨架重组,内体和囊泡转运,蛋白分选以及膜融合等过程在JEV对脑微血管内皮细胞的感染中也可能具有重要的作用。二、Ezrin在乙型脑炎病毒入侵脑微血管内皮细胞中的作用及机制研究方法1.利用si RNA分别敲低HBMEC中ERM成员蛋白moesin、ezrin和radixin,通过间接免疫荧光技术、吸附实验和内吞实验检测对JEV感染、结合和入侵的影响。2.利用ezrin特异性抑制剂NSC668394处理,通过检测病毒感染和入侵以及CT-B的内吞,分析ezrin参与JEV感染的阶段。3.采用鬼笔环肽染色检测JEV对肌动蛋白形态的影响;采用针对肌动蛋白重组的化学抑制剂处理后,检测JEV的感染与入侵,分析肌动蛋白重组在JEV感染和入侵中的作用。4.在NSC668394处理下,采用G/F-肌动蛋白比率测定实验结合病毒和细胞骨架共定位分析,检测JEV对肌动蛋白重组的影响以及ezrin在其中的作用。5.基于STRING数据库预测ezrin和caveolin-1共同相互作用蛋白,并通过si RNA和特异性抑制剂验证其中参与JEV入侵HBMEC的分子。6.利用抑制剂抑制Src（PP2）和ezrin或si RNA下调caveolin-1表达,通过免疫印迹法分析JEV对Src、ezrin和caveolin-1的活性状态的影响以及三者活化的上下游关系。7.利用免疫共沉淀技术结合重组蛋白体外激酶实验,分析JEV感染过程中Src、ezrin和caveolin-1的相互作用。8.在NSC668394处理下,通过磷酸化Src（p-Src）和磷酸化caveolin-1（p-caveolin-1）共定位分析,验证Src-caveolin-1相互作用以及ezrin在其中的作用。研究结果1.三种ERM蛋白中,仅ezrin下调后JEV的内化显着减少。2.NSC668394以剂量依耐性方式抑制JEV的感染,其预处理后对JEV内化的抑制率超过96%;NSC668394预处理后,HBMEC对CT-B的内吞也显着减少。3.JEV诱导HBMEC肌动蛋白广泛重组,抑制肌动蛋白重组时JEV在HBMEC中的感染率和内吞显着减少。4.NSC668394预处理后JEV诱导的肌动蛋白聚合以及病毒与细胞骨架的共定位明显减少。5.通过STRING数据库预测发现3个可能与ezrin和caveolin-1直接相关的分子,其中Src下调和抑制后JEV在HBMEC中的感染率和内吞显着减少。6.抑制Src后JEV诱导的ezrin和caveolin-1活化（磷酸化）均减少;抑制ezrin后caveolin-1活化减少而Src活化不受影响;下调caveolin-1后ezrin和Src的活化反而升高。7.针对Src、ezrin和caveolin-1的抗体均可以从JEV感染的HBMEC中沉淀出p-Src、p-ezrin和p-caveolin-1;在离体状态下,Src可以直接磷酸化ezrin和caveolin-1。8.JEV感染2 h后,p-Src与p-caveolin-1在细胞膜皱褶上发生明显共定位;NSC668394处理后p-caveolin-1及其与p-Src的共定位均明显减少。结论JEV可以通过激活Src/ezrin/caveolin-1通路并形成p-Src/p-ezrin/p-caveolin-1信号复合物的方式入侵HBMEC。Ezrin是Src介导caveolin-1活化进而促进JEV通过caveolin-1依赖的内吞途径入侵HBMEC的关键因素,也是JEV入侵中组织肌动蛋白重组的关键分子。三、靶向Src/ezrin的抑制剂作为潜在抗乙型脑炎病毒药物研究方法1.经皮下接种感染ICR乳鼠,通过观察症状、生存分析和苏木素伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色分析,确定建立JEV感染动物模型的实验条件。2.病毒感染后经皮下重复注射药物,通过生存分析,确定不同剂量NSC668394和PP2对JEV的致死性是否具有保护作用。3.病毒感染后经皮下重复给予高剂量的NSC668394（6 mg/kg）和PP2（7.5 mg/kg）,采用RT-PCR法、间接免疫荧光法和HE染色检测小鼠脑组织JEV载量和病理损伤。研究结果1.经皮下注射4×103 PFU/只的JEV后,小鼠神经症状明显,死亡率为73.33%,并表现出典型的乙型脑炎病理改变。2.JEV感染后,经皮下重复注射6天高剂量的PP2（7.5 mg/kg）或NSC668394（6mg/kg）,小鼠存活率分别提高到54.55%和61.91%。3.重复给予高剂量的PP2和NSC668394后,JEV感染小鼠的脑组织病毒载量均减少到模型组的1%左右,同时,脑组织病理损伤也显着改善。结论在JEV感染后重复给予PP2和NSC668394均可以明显减少脑组织病毒载量,缓解大脑病理损伤,挽救JEV感染导致的动物死亡。
狄荻[3]（2020）在《乙型脑炎病毒对雏鸭致病性的研究》文中研究指明乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）是有囊膜的单股正链RNA病毒,属于黄病毒科,黄病毒属。作为一种重要的人畜共患病原,JEV严重危害人类健康和养殖业发展。蚊虫是JEV的传播媒介,鸟类和猪是JEV的扩增宿主。JEV可以感染家鸭,前期研究发现:通过直接皮下注射JEV方式,实验性感染雏鸭后,雏鸭生长受到抑制并且会引起部分雏鸭死亡,表明JEV对雏鸭具有潜在的致病性。为了探究JEV在是否能够在自然条件下感染雏鸭,并造成危害,开展了如下研究:为了调查JEV在鸭群的流行情况,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对江苏省某地部分鸭群进行JEV抗体检测,同时对疑似病例进行了JEV的RT-PCR检测。ELISA结果显示,在被检的20份产蛋种鸭血清样本中,15份为JEV抗体阳性,抗体阳性率为75%（15/20）。RT-PCR检测结果显示,在被检的19份病死雏鸭病料中,有1份为JEV阳性,2份为JEV弱阳性。对JEV阳性样本的RT-PCR扩增片段测序发现,所检测到的病毒属于JEV基因I型毒株。该研究结果表明了被检鸭群中存在JEV感染。为了进一步研究JEV对雏鸭的潜在致病性,采用感染JEV的淡色库蚊叮咬新生雏鸭的方式,模拟自然条件下JEV感染雏鸭,评估JEV对雏鸭的致病性。结果显示,2日龄雏鸭经过淡色库蚊叮咬感染JEV后,出现病毒血症,并观察到非特征性的临床症状,雏鸭死亡率为30%（6/20）。一些雏鸭表现突然死亡,并伴有角弓反张的症状。组织病理变化发现,在感染雏鸭的脑组织中,可以观察到以淋巴细胞和胶质细胞集聚为特征的血管套现象以及脑膜炎,这一组织病理学变化是JEV病毒性脑炎的特征性病变。免疫组织化学结果表明,在感染雏鸭脑组织神经元细胞质中检测到JEV阳性信号。将感染雏鸭脑组织病料接种BHK-21细胞,出现JEV特征性细胞病变,并能回收到病毒。回收病毒的基因序列与感染淡色库蚊的病毒株一致。上述结果表明,通过淡色库蚊叮咬新生雏鸭感染JEV,能够引起雏鸭发病死亡,并造成病毒性脑炎,表明了JEV对雏鸭具有潜在的致病性。综上所述,本研究调查了JEV在鸭群中的流行情况,并证明了JEV对雏鸭具有一定的致病性,增进了关于JEV对养鸭业潜在危害的认知。养鸭业在中国南方地区十分发达,而且家鸭与人类和蚊子接触密切,有利于JEV传播,威胁养鸭业和人类健康。因此,有必要在鸭群中深入开展JEV流行病学调查。
李晨曦[4]（2020）在《基因Ⅰ型与Ⅲ型JEV在水禽宿主中适应性差异的分子机制》文中研究指明日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）属于黄病毒科黄病毒属,能够引起人的中枢神经系统损伤和猪的繁殖障碍等疾病,在自然界中主要是通过蚊虫叮咬进行传播,蚊子是病毒的传播宿主,水禽和猪是病毒主要的扩增宿主。根据病毒E基因序列可将JEV分为五个基因型,即基因I、II、III、IV、V型（GI、II、III、IV、V）。从上世纪30年代到20世纪末,GⅢ型毒株一直占据着亚洲地区JEV流行的主要地位,但最近二十年GⅠ型JEV逐渐替代GⅢ型成为我国乃至整个亚洲地区的主要流行毒株,而对于基因型转换的分子机制目前尚不清楚。最近研究发现,GⅠ型JEV相对于GⅢ型在水禽宿主中具有适应性的优势,能够引起雏鸭产生滴度更高、持续时间更长的病毒血症,而宿主适应性的差异被认为可能是引起JEV基因型转换的一个重要的原因。为解析GⅠ型与GⅢ型JEV在水禽宿主中适应性差异的分子基础,本研究首先建立了GⅠ型与GⅢ型JEV PCR-Based反向遗传学系统。GⅠ型与GⅢ型JEV基因组全序列的同源性约为88.9%,存在12.3%的差异性,而基因组序列间的差异,限制了酶切位点的选择,为后期GⅠ型与GⅢ型JEV间嵌合病毒的构建带来了困难。为解决这一困难,我们根据GⅠ型与GⅢ型JEV基因组间的保守序列,设计了四对通用型引物,以GⅠ型毒株SH7与GⅢ型毒株SH15的cDNA为模板,分四段扩增出涵盖病毒基因组全长的DNA片段,并在第一段的5’端引入一T7启动子序列,随后将四个片段克隆在低拷贝质粒POK-12上。以构建的低拷贝质粒为模板,扩增出各自的四个片段,随后利用特异的通用型引物,通过两轮Fusion PCR方法分别获得了含有T7启动子序列的GⅠ型与GⅢ型病毒基因组的全长DNA序列,经体外转录并转染BHK细胞,拯救出了病毒粒子rGI与rGIII。经鉴定拯救出的病毒粒子与亲本毒具有相似的复制特性,且在BHK上能够形成大小、形态相似的病毒蚀斑。GI/Ⅲ型JEV PCR-Based反向遗传学系统具有很好的稳定性且易于操作,这为下一步嵌合病毒与定点突变病毒的构建提供了关键性的技术平台。在研究初期发现GⅠ型毒株SH7与SD12相对于GⅢ型毒株SH15与SH19在水禽宿主细胞DEF中能够诱导更低水平IFN-α与IFN-β的表达,使得SH7与SD12毒株在DEF中能够达到更高的病毒复制滴度,并且在雏鸭动物实验中也发现攻毒GI-SH7的雏鸭组相对于攻毒GIII-SH15组,其血清中IFN-α与IFN-β的含量更低,且其病毒血症的滴度更高、持续的时间也更长。但是,这种诱导Ⅰ型干扰素表达差异的现象具有宿主特异性,仅在禽类宿主中发现,而在其他两类宿主细胞ST与bEnd.3中并没有发现诱导IFN-α与IFN-β表达的差异,且不存在病毒复制上的差异,因此GⅠ型与GⅢ型JEV在水禽宿主中特异性的诱导Ⅰ型干扰素表达的能力,决定其宿主适应性的差异。为解析在水禽宿主中诱导Ⅰ型干扰素表达差异的分子机制,我们比较了50株GⅠ型与GⅢ型JEV的全基因组序列,找到了53个具有高度替换率的差异性氨基酸位点,利用建立的PCR-Based反向遗传学系统构建了GⅠ型与GⅢ型JEV间结构蛋白和各个非结构蛋白相互替换的嵌合病毒,结果发现结构蛋白的相互替换并没有改变GⅠ型与GⅢ型病毒的特性,但当非结构蛋白NS5相互替换后,具有GI-NS5蛋白的嵌合病毒rGIII/SH7NS5与亲本毒rGI相似,能够诱导更低水平的IFN-α与IFN-β表达,并且具有复制动力学的优势,同时发现GI-NS5蛋白相对于GIII-NS5蛋白具有更强的拮抗Ⅰ型干扰素表达的能力。而GⅠ型与GⅢ型NS5蛋白间共存在11个氨基酸位点的差异且分布在三个结构域上,进一步构建了NS5蛋白各个结构域相互替换的嵌合病毒,发现NS5蛋白a-a RdRp区域决定着病毒诱导IFN-α与IFN-β的表达能力,具有该区域的嵌合病毒rGI/SH7b-aRdRp、rGIII/SH7a-aRdRp与亲本毒rGI相似,在DEF细胞中能够诱导低水平IFN-α与IFN-β的表达,并且病毒的复制水平更高。NS5蛋白a-aRd Rp区域共存在V372A与H386Y两个氨基酸位点的差异,V372与H386氨基酸位点在GI毒株中高度保守,但A372与Y386氨基酸位点在GⅢ型毒株中保守性较差。为探究关键性的氨基酸位点,构建了V372A或H386Y氨基酸位点的突变病毒,最终发现只有当GⅠ型或GⅢ型JEV NS5蛋白同时存在氨基酸V372与H386时,才能在水禽宿主中具有诱导低水平IFN-α与IFN-β表达的能力,并表现出宿主适应性的优势。NS5-V372A与H386Y两个氨基酸位点位于NLS区域,该区域属于一种核定位信号并与NS5蛋白拮抗Ⅰ型干扰素能力相关。而V372A与H386Y两个氨基酸位点决定着NS5蛋白的入核能力,通过实验发现GI-NS5蛋白具有与核转运受体蛋白du KPNA4更强的结合能力,但同时duKPNA4也可与Ⅰ型干扰素转录因子duIRF7结合,这使得GI-NS5蛋白与du IRF7竞争结合duKPNA4的能力更强,从而抑制duIRF7入核起始Ⅰ型干扰素的表达,这也就导致了具有NS5-V372-H386的突变病毒与亲本毒rGI能够诱导低水平IFN-α与IFN-β表达的能力。那么,为什么两个氨基酸位点决定着NS5蛋白与duKPNA4的结合能力?利用生物信息学软件分析了两个氨基酸位点在NS5蛋白空间结构上的特点,发现V372A与H386Y各个氨基酸位点形成的氢键排布不同,这可能导致NS5蛋白的NLS柔韧性有所不同。为验证假设,将GⅠ型与GⅢ型NS5-372与-386氨基酸位点进行同性氨基酸替代,结果发现与亲本毒rGI的NS5-372-386位点具有相同氢键特性的突变病毒rGI/V372G-H386K,rGI/V372P-H386R,rGIII/A372G-Y386K和rGIII/A372P-Y386R,其NS5蛋白具有更强的入核能力,能够诱导低水平IFN-α与IFN-β的表达,并表现出对水禽宿主适应性的优势。综上所述,本研究成功的构建了GⅠ型与GⅢ型JEV PCR-Based反向遗传学系统,并以此为基础构建了一系列的嵌合病毒与定点突变病毒,最终找到NS5-V372A-H386Y两个氨基酸位点决定着GⅠ型与GⅢ型JEV对水禽宿主适应性的差异。进一步的研究发现NS5-V372A-H386Y位点决定着NS5蛋白与duIRF7竞争结合duKPNA4的能力,从而影响Ⅰ型干扰素的表达。同时,通过对GI-NS5与GIII-NS5蛋白进行结构模拟分析,发现NS5-V372A与H386Y两个氨基酸位点的氢键排布决定着宿主适应性的差异,并通过对V372A与H386Y位点进行同性氨基酸的替换得到了验证。因此,本研究中从病毒与宿主两个方面解释了GⅠ型与GⅢ型JEV对水禽具有宿主适应性差异的原因,这为进一步揭示JEV基因型转换的分子机制奠定了理论基础。
包伟东[5]（2020）在《内蒙古地区优势蚊种的基因多态性分析及西尼罗病毒检测方法的建立》文中进行了进一步梳理随着全球气候的变化、生态环境的不断恶化、城镇化程度的加快、各国之间的贸易往来频繁及交通工具运输的快捷便利,全世界蚊媒传染病发病呈上升趋势,已有蚊媒传染病的流行区域不断扩大、疾病的流行频度不断加强。内蒙古拥有广袤的草原,水草丰茂,牛羊较多,与蒙古国,俄罗斯相接壤,边境线很长,独特的气候环境和地理环境给蚊虫带来滋生的空间。为了解内蒙古呼伦贝尔和锡林郭勒盟边境地区优势蚊虫种类,并对其保守基因COI的基因多态性分析。应用传统形态学和分子生物学相结合的方法,对该地区10个采样点进行蚊虫种型的鉴定和基因多态性分析,并对蚊虫体内是否携带西尼罗病毒初步进行检测。方法:在2018-2019年间,从内蒙古呼伦贝尔地区和锡林郭勒盟地区的草地上采集蚊虫样本。通过传统形态学鉴定方法,对蚊虫样本进行显微镜下观察后初步确定其种型。再采用聚合酶链式反应（PCR）对蚊虫的线粒体细胞色素C氧化酶I基因（COI）基因序列进行扩增,测序后对蚊虫的基因序列进行同源性分析和遗传进化分析,即应用Mega6.06软件构建系统进化树,与GenBank数据库中已知蚊虫的COI基因进行聚类分析,以确定蚊子进化的规律;通过相关生物软件分析其碱基组成成分、不同位点碱基替换类型、遗传距离,和基因单倍型多样性。在相继研究中,根据西尼罗病毒的E2蛋白基因,采用TaqMan实时荧光定量PCR方法对10个采样点的蚊虫样本初步检测西尼罗病毒。结果:在两个项目地区,共采集6000余只蚊虫,经过形态学和分子生物学方法分析发现,7个采样点的蚊虫属于伊蚊背点骚扰蚊,3个采样点的蚊虫属于摇蚊,呼伦贝尔地区均为伊蚊背点骚扰蚊,锡林郭勒地区3个采样点为伊蚊背点骚扰蚊,其余3个采样点为摇蚊。COI基因的碱基成分分析显示A+T的含量明显高于G+C的含量,单倍型多样性分析发现2种蚊子的单倍型多样性均较高,其中Hap1-Hap4是共有的基因单倍型,是较原始的单倍型基因,且不同地区的蚊虫之间存在显着的基因多样性。充分表明项目区蚊虫的遗传资源比较丰富;通过检测样品数量的33%,结果显示目前在内蒙古的这2个地区蚊虫体内未发现西尼罗病毒。结论:背点骚扰蚊,摇蚊是内蒙古呼伦贝尔和锡林郭勒地区优势蚊种,且不同采样地区的蚊子之间存在着较丰富的基因多样性;经过TaqMan实时荧光定量PCR方法检测,该地区蚊虫体内未发现西尼罗病毒。
饶清[6]（2020）在《索非布韦抗日本乙型脑炎病毒体外活性研究》文中研究指明[目的]构建日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）标准品质粒,通过该标准品质粒检测体系分析索非布韦体外抗JEV病毒活性。[方法]1、利用BHK-21细胞对JEV进行连续盲传培养,通过美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找并下载JEV全基因序列;BioEdit软件对下载序列进行比对,选取相对保守区域设计特异性引物,通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）扩增获得目的片段。2、1%琼脂糖凝胶对扩增的目的条带进行电泳,目的条带在凝胶成像仪紫外灯下切取,然后通过琼脂糖凝胶回收试剂盒回收,回收产物克隆连接到pMD-19T载体上,接着转化到DH5α感受态细胞,最后涂布于含100ug/ml氨苄青霉素（Ampicillin,AMP）的LB固态平板,37℃培养箱中过夜培养;挑取LB固态平板上的单个菌,于含AMP的LB液体培养基中进行单克隆培养,提取菌液中的质粒进行双酶切（Sall,Bamhl）鉴定。3、构建的日本乙型脑炎病毒标准品质粒通过无核酸酶的水10倍梯度稀释并记为10-1、10-2、10-3、1 0-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9,每个梯度浓度设置 3 个平行复孔,同时添加日本乙型脑炎病毒原液及10倍梯度稀释病毒液（病毒原液,10-1,10-2,10-3,10-4）,设置ddH20空白对照组,利用设计好的特异性引物通过实时荧光定量 PCR（Real time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR）SYBR 法检测标准品质粒的稳定性,特异性和灵敏性。4、利用CCK8试剂检测不同浓度的索非布韦（500μM,100μM,20μM,4μM,0.8μM,0.16μM,0.032μM,0.0064μM）对人肝癌细胞（Human hepatoma cell line,Huh-7）的增殖活性,同时设置空白对照组。5、Huh-7细胞上进行药物对JEV的直接杀伤作用,吸附阻断,细胞内增殖抑制以及复制的影响实验;不同途径的抗病毒效果通过RT-qPCR进行相对定量分析。[结果]1、JEV在BHK-21细胞上连续多次培养后,获得病毒培养上清液;根据NCBI数据库下载的JEV序列比对,选取了相对保守的prM结构蛋白区域,利用JEV下载序列（GenBank:MH258853）,设计特异性引物扩增得到prM区域的目的片段,经测序鉴定为正确的441个碱基对（base pair,bp）。2、目的片段经1%琼脂糖凝胶电泳回收成功克隆连接到pMD-19T载体并进行单克隆培养,提取菌液质粒经酶切鉴定正确。3、10倍梯度稀释的标准品质粒,经RT-qPCR结果表明,复孔之间数值差异小（<0.5）,熔解曲线特异性好,峰值单一;同时以得到的标准品质粒Ct值作为X轴,标准品质粒拷贝数log10作为Y轴得到JEV标准品质粒的标准曲线方程:y=-0.2889x+11.516,R2=0.993。此外,计算得到病毒原液,10-1,10-2,10-3,10-4浓度的病毒拷贝数分别为1184130.27、120912.86、10736.84、1053.45、121.25copies/ul。构建的标准品质粒稳定性和特异性良好,且灵敏度高。4、索非布韦 500μM,100μM,20μM,4μM,0.8μM,0.16μM,0.032μM,0.0064μM与对照组相比,索非布韦对Huh-7细胞活性无统计学差异（P>0.05）。5、索非布韦对JEV的直接杀伤实验表明,不同浓度的索非布韦与对照组相比,有统计学意义（P<0.05）,说明索非布韦溶液对JEV有一定程度的直接杀伤效果;但不同浓度索非布韦间无差异（P>0.05）。索非布韦对JEV的吸附阻断实验表明,不同浓度的索非布韦与对照组相比,有显着统计学差异（P≤0.01）,说明索非布韦溶液对JEV的吸附具有阻碍作用。索非布韦500μM组较索非布韦50μM组间相比,无统计学意义（P>0.05）;其它药物浓度间对JEV的吸附阻断效果均有显着性差异（P≤0.01）。索非布韦对JEV的细胞内增殖抑制实验表明,不同浓度的索非布韦与对照组相比,有显着统计学差异（P≤0.01）,说明索非布韦溶液对JEV的细胞内增殖具有抑制效果。索非布韦500μM组较索非布韦50μM组间相比,无统计学意义（P>0.05）;其它药物浓度间对JEV的细胞内增殖抑制效果均有显着性差异（P≤0.01）。索非布韦对JEV的复制影响实验表明,索非布韦500μM,50μM,5μM,0.5μM组以及利巴韦林（10μg/ml）组与病毒对照组相比,有显着统计学差异（P≤0.01）,说明索非布韦溶液500μM,50μM,5μM,0.5μM和利巴韦林（10μg/ml）对JEV的复制具有抑制效果;索非布韦500μM组与50μM、利巴韦林组相比,无统计学意义（P>0.05）。索非布韦50μM组与5μM、利巴韦林组相比,无统计学意义（P>0.05）。索非布韦5μM组与500μM、0.5μM、利巴韦林组相比,有统计学意义（P<0.05）。其它浓度的索非布韦药物间对JEV的复制抑制效果均有显着性差异（P≤0.01）。[结论]基于JEV prM结构蛋白区域构建的标准品质粒稳定性和特异性好,灵敏度高,适用于对JEV进行病毒拷贝数的定量检测。索非布韦对JEV具有一定程度的直接杀伤效果;对于病毒的吸附阻断,复制抑制以及细胞内增殖抑制效果显着。
王国玮[7]（2020）在《流行性乙型脑炎病毒感染与吉兰巴雷综合征相关性研究》文中认为目的2018年宁夏北部地区暴发流行性乙型脑炎（JE）可疑病例,部分病人出现合并吉兰巴雷综合征（GBS）暴发流行的新特点。为了进一步明确暴发流行的病原体,总结其流行病学、临床特征以及治疗观察,明确该病原体感染与GBS之间的因果关系,为临床诊断和治疗提供科学依据,为流行性乙型脑炎病毒（JEV）的防控以及今后的科学研究提供实验室依据。方法根据JE诊断标准（WS214-2008）和布莱顿GBS工作组发布的诊断标准,在确诊161例JE患者中收集47例急性JE（重型和极重型）合并GBS患者作为研究组,收集门诊正常人20例作为对照组。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）技术对收集的所有患者血液和（或）脑脊液进行JEV-IgM、西尼罗河病毒（WNV）IgM检测;采用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）分别对WNV-RNA和寨卡病毒（ZIKV）RNA检测。并对患者血液和脑脊液进行病毒培养、分离和鉴定。对分离出的病毒株,进行全基因组测序和系统发生学分析。应用酶联免疫斑点法对44例患者的血液和（或）脑脊液行周围神经自身抗体谱系检测。总结其流行病学特征、临床症状和体征、脑脊液学检查、腓肠神经活检、神经电生理学和影像学特点以及治疗8个月后随访观察结果。结果（1）流行病学调查分析表明GBS暴发流行时间在2018年第28周到35周,流行地区在宁夏北部地区,与文献报道宁夏三带喙库蚊地理分布一致。上述地区70%为三带喙库蚊,开展灭蚊和接种乙脑病毒减毒活疫苗后,截止2019年12月宁夏仅有3例轻型JE患者,治疗一周后全部恢复,未见合并周围神经损害病例及其类似暴发流行。（2）47例GBS患者血液和（或）脑脊液免疫测定证实存在JEV感染,且在GBS发病前症状与JEV感染一致。从其中1例急性重症患者脑脊液分离得到病毒株1株,经全基因组测序和鉴定为JEV基因Ⅰb型（GⅠb）,与宁夏分离到蚊子的JEVs属于同一进化支。与GenBank100株基因组序列进行BLAST对比分析,提示与江苏连云港分离株系KX357114.1在进化树位置最近,同源性99.38%,与广东分离株系MH184574.1、MH184576.1、MH184575.1同源性分别为99.17%、99.16%、99.03%,暗示我区JEV可能起源于JEV多发的南方城市。（3）47例患者有发热、头痛,或恶心、呕吐以及不同程度的意识障碍、呼吸衰竭和四肢弛缓性瘫痪。23例颅脑MRI显示双侧丘脑和（或）中脑多发、新发病灶。38例脑脊液存在蛋白细胞分离现象。（4）47例患者肌电图提示周围神经及神经根损害。按照GBS经典和变异分型分为4例急性炎性脱髓鞘性多发神经根神经病（AIDP）,22例急性运动轴索性神经病（AMAN）,18例急性运动感觉轴索性神经病（AMSAN）和3例急性感觉神经病（ASN）。（5）2例AMSAN患者腓肠神经活检可见部分有髓神经纤维髓鞘增厚、分层,大部分轴索内高度水肿、线粒体空泡化,部分轴索萎缩变性。（6）44例GBS患者血液和（或）脑脊液周围神经自身抗体谱系检测,约30%患者存在抗GM1、GM2、GD1a和GD1b抗体阳性。（7）通过对呼吸肌力和四肢肌力恢复程度评估,提示激素联合丙种球蛋白组明显优于单独使用激素组（P<0.01）。结论（1）宁夏地区本次暴发流行病毒为JEV GIb型,改变既往JEV GIII型,在国内属于首次报告。（2）GBS的暴发流行可能相关于JEV感染。（3）JE合并GBS患者周围神经以轴索损害为主,主要为AMAN和AMSAN亚型,血液和脑脊液存在不同类型的抗神经节苷脂抗体（主要是GM1、GM2、GD1a和GD1b）。（4）免疫球蛋白早期应用可能具有一定治疗作用。（5）灭蚊和易感人群的免疫接种依然是预防本病的关键。
赵芳芳[8]（2020）在《自噬介导的日本脑炎DNA疫苗免疫增强效应及机制研究》文中研究说明目的:探讨自噬介导的日本脑炎（Japanese encephalitis,JE）DNA疫苗免疫增强效应及机制,为新型JE疫苗的研发提供新的思路。研究方法:1.pJME-LC3的构建及鉴定根据GenBank检索到的小鼠LC3B基因序列,利用RT-PCR法合成LC3B基因,重组至含JEV prME蛋白编码基因的pJME构建重组质粒,命名为pJME-LC3,BamH I/EcoR I双酶切、测序鉴定;脂质体法将pJME-LC3按不同时间、不同浓度转染CHO-K1细胞,western blot法检测prME-LC3融合蛋白的表达;用G418对pJME-LC3转染CHO-K1细胞进行筛选,光镜下观察抗性克隆株的形成,western blot法检测数代稳定转染株细胞中prME-LC3的表达;将pJME-LC3转染至CHO-K1细胞,光镜下观察自噬性细胞集落的形成,透射电镜观察细胞内自噬小体的形成,western blot法检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ及底物蛋白p62的表达;用HBAD-GFP-LC3及pJME-LC3处理细胞,间接免疫荧光法标记后通过共聚焦显微镜观察prME-LC3融合蛋白与内源性LC3蛋白在自噬体中共定位。2.动物分组及免疫120只BALB/c鼠随机分为6组,其中pcDNA3.1（+）阴性对照组、pJME常规DNA疫苗对照组、pJME-LC3实验组及药物抑制自噬活性的pJME-LC3+3-MA组给予相应质粒100μg/100μL肌注,其余两组分别接受PBS（100μL肌注）或100μL JEV-L腹腔注射,共免疫3次,每次间隔两周,pJME-LC3+3-MA组从首次免疫开始至末次免疫结束每天加用60μg自噬抑制剂3-MA腹腔注射。3.病毒攻击第一批:每组15只BALB/c鼠共6组,免疫流程同前;第二批:每组20只BALB/c鼠共6组,其中PBS（100μL肌注）,pcDNA3.1（+）、pJME、pJME-LC3及pJME-LC3+3-MA组分别200μg/100μL肌注,JEV-L组100μL腹腔注射,具体免疫流程同前。pJME-LC3+3-MA组从首次免疫开始至末次免疫结束每天加用60μg自噬抑制剂3-MA腹腔注射。末次免疫后3周,小鼠腹腔注射JEV（野生强毒株YN2016-1,105PFU/500μL）进行病毒攻击。4.JE DNA疫苗pJME-LC3免疫效应及机制研究末次免疫后3周,每组20只小鼠断颈处死,无菌取脾脏分离淋巴细胞及DCs。间接免疫荧光法观察prME-LC3融合蛋白在免疫鼠脾脏DCs中的表达;流式细胞术分析免疫鼠脾脏DCs摄取FITC-Dextran能力及CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞亚群;乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测免疫鼠JEV特异性CTL活性;每次免疫后间隔一周及末次免疫后连续三周（第1、3、5、6、7w）采集免疫鼠外周血分离血清,ELISA法检测免疫鼠脾脏淋巴细胞经JEV刺激后分泌细胞因子（IL-4、IL-10、IFN-γ、IL-12）水平及血清样本中JEV特异性IgG1/IgG2a抗体相对滴度;Western blot法检测IFN-γ-JAK2/STAT1-T-bet中信号通路蛋白及下游转录因子T-bet的表达。5.JE DNA疫苗pJME-LC3免疫记忆及保护性免疫研究流式细胞术分析免疫鼠脾脏CD4+/CD8+记忆性T淋巴细胞亚群;攻毒后3周内观察各组小鼠状态及存活数量,并计算存活率;80%空斑减少中和试验（PRNT80）检测免疫鼠血清中和抗体滴度。结果:1.成功构建pJME-LC3测序分析结果显示:JEV prME蛋白及LC3B蛋白编码基因与GenBank检索到的基因序列相符。琼脂糖凝胶电泳显示:pJME-LC3经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切后释出的DNA片段之一与LC3B基因（390bp）大小一致,另两个片段与pJME经相同酶切后释出的基因片段pcDNA3.1（+）（5428bp）及prME（2001bp）大小一致,提示重组质粒pJME-LC3构建成功。2.pJME-LC3编码蛋白在CHO-K1细胞内快速及稳定表达prME-LC3融合蛋白在转染后12h即有大量表达,且随作用时间（12-36h）及质粒浓度（1-4mg/mL）的增加而上升;G418对pJME-LC3转染后抗性克隆株进行筛选,发现pr ME-LC3融合蛋白蛋白能够在数代抗性克隆株细胞内稳定表达而未出现衰减现象。3.pJME-LC3促进CHO-K1细胞自噬活性增加光镜下pJME-LC3组自噬性细胞集落形成明显多于pJME组,作用与Rapamycin相似;透射电镜下pJME-LC3组细胞内自噬小体数量多于pJME组;western blot检测pJME-LC3组自噬标志蛋白LC3 II明显高于pJME组,而作为自噬底物的负性调节蛋白p62的表达则呈相反趋势。4.pJME-LC3编码蛋白与CHO-K1细胞内源性LC3蛋白共定位于自噬体共聚焦显微镜下pJME-LC3组用于标记细胞内源性LC3蛋白的绿色荧光呈颗粒状聚集于胞浆及胞膜,并与红色荧光标记的质粒编码蛋白共定位于自噬体呈现融合的黄色荧光,而pJME组绿色荧光弥散存在于胞浆中,且未与红色荧光融合。5.pJME-LC3促进质粒编码蛋白在免疫鼠脾脏DCs中的表达荧光显微镜下观察发现:作为常规JE DNA疫苗对照的pJME组少量DCs胞浆中可见质粒编码蛋白表达;pJME-LC3实验组大量DCs胞浆中均可见质粒编码蛋白表达;而pJME-LC3+3MA自噬活性抑制组仅有少量DCs胞浆中质粒编码蛋白表达;作为阴性对照的pcDNA3.1（+）空载体组DCs中未见质粒编码蛋白表达。6.pJME-LC3促进免疫鼠脾脏DCs内吞能力pJME-LC3实验组免疫鼠脾脏DCs摄取FITC-Dextran的能力明显强于JEV-L对照组（P<0.05）,作为常规DNA疫苗对照的pJME组（P<0.05）及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（P<0.05）,后3组两两之间差异无统计学意义。7.pJME-LC3增加CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞数量pJME-LC3实验组CD3+CD4+T淋巴细胞比例为（45.66±5.04）%,明显高于其它组（P<0.05）;作为常规DNA疫苗对照的pJME组CD3+CD4+T淋巴细胞比例为（37.40±5.23）%,与JEV-L对照组（35.84±2.75）%及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（34.46±3.87）%两两之间无显着性差异;作为阴性对照的pcDNA3.1（+）组CD3+CD4+T淋巴细胞比例为（26.38±4.69）%,与PBS空白对照组（25.25±3.82）%基本一致,均低于其它组（P<0.05）。pJME-LC3实验组CD3+CD8+T淋巴细胞比例为（30.23±1.43）%,明显高于其它组（P<0.05）;作为常规DNA疫苗对照的pJME组CD3+CD8+T淋巴细胞比例为（15.89±1.45）%,与JEV-L对照组（15.07±0.96）%及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（13.42±1.58）%两两组间差异无统计学意义;PBS空白对照组CD3+CD8+T淋巴细胞比例为（9.98±1.80）%,与作为阴性对照的pcDNA3.1（+）阴性对照组基本一致,显着低于其它组（P<0.05）。8.pJME-LC3增加JEV特异性CTL活性当设效应靶细胞:靶细胞为10:1时,LDH释放法对不同免疫组小鼠脾细胞JEV特异性CTL活性检测的结果显示:pJME-LC3组CTL杀伤活性为（55.72±2.34）%,显着高于JEV-L对照组（39.43±2.85）%,pJME常规DNA疫苗对照组（37.88±2.47）%及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（28.96±3.21）%,差异有统计学意义（P<0.05）。9.pJME-LC3促进免疫鼠脾脏T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子pJME-LC3实验组T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ水平为（48.26±5.47）pg/mL,显着高于JEV-L对照组的（19.45±5.76）pg/mL（P<0.01）、pJME常规DNA疫苗对照组（35.09±7.16）pg/mL（P<0.05）及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（33.64±4.80）pg/mL（P<0.05）,而后3组中JEV-L组明显低于其它2组,差异均有统计学意义（P<0.05）;PBS空白对照组、pcDNA3.1（+）阴性对照组IFN-γ水平分别为（5.65±1.28）pg/m L、（7.82±1.94）pg/mL,均低于其它组（P<0.05）。IL-12在pJME-LC3实验组为（62.19±9.75）pg/mL,显着高于作为常规DNA疫苗对照的pJME组（44.61±7.49）pg/mL（P<0.05）、pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（39.88±9.04）pg/mL（P<0.05）及JEV-L对照组（29.64±6.32）pg/mL（P<0.01）,而后3组中JEV-L组明显低于其它2组,差异均有统计学意义（P<0.05）;作为空白对照的PBS组、pcDNA3.1（+）阴性对照组IL-12水平分别为（15.24±4.21）pg/mL、（16.90±6.46）pg/mL,均低于其它组（P<0.05）。细胞因子IL-4、IL-10水平在各组间无显着性差异（P>0.05）。10.pJME-LC3促进JEV特异性IgG2a抗体生成根据各样本孔OD值评估IgG1抗体相对滴度发现:PBS空白对照组、pcDNA3.1（+）阴性对照组在初次免疫后1、3、5、6、7周无明显变化,均低于其它免疫组,且各时间点两组间无显着性差异;JEV-L对照组、pJME常规DNA疫苗对照组、pJME-LC3实验组及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组IgG1抗体相对滴度均随免疫时间延长逐渐上升,在初次免疫后第1、3、5、6、7周两两组间差异均统计学意义。IgG2a抗体相对滴度自初次免疫后1、3、5、6、7周在PBS空白对照组、pcDNA3.1（+）阴性对照组均处于低水平,各时间点数值无显着性差异;pJME-LC3实验组IgG2a抗体滴度快速上升,至初次免疫后第7周达到最高值,而JEV-L对照组、pJME常规DNA疫苗对照组及自噬活性抑制的pJME-LC3+3-MA组在初次免疫后1、3、5、6周IgG2a抗体上升速度及绝对值均低于pJME-LC3实验组,且在第7周出现衰减。11.pJME-LC3促进脾脏T淋巴细胞pJAK2、pSTAT1蛋白及转录因子T-bet的表达pJME-LC3实验组免疫鼠脾脏T淋巴细胞中pJAK2、pSTAT1蛋白及转录因子T-bet的表达均显着高于作为减毒疫苗对照的JEV-L组、pJME常规DNA疫苗对照组及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组,差异有统计学意义（P<0.01）;而后3组之间无显着性差异;PBS空白对照组、pcDNA3.1（+）阴性对照组与JEV-L组3种蛋白的表达量无显着性差异。12.pJME-LC3促进BALB/c鼠CD4+、CD8+TCM/TEM比值CD4+TCM/TEM比值在pJME-LC3实验组为（2.34±0.79）,高于pJME常规DNA疫苗对照组（1.93±0.64,P<0.05）、JEV-L对照组（1.58±0.27,P<0.05）及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（1.56±2.02,P<0.05）;后3者之间差异无统计学意义;CD4+TCM/TEM在作为空白对照的PBS组（0.94±0.59）与pcDNA3.1（+）阴性对照组（0.99±0.37）中比值基本一致,均低于其它组（P<0.05）。CD8+TCM/TEM比值在pJME-LC3实验组为（0.62±0.30）,高于pJME常规DNA疫苗对照组（0.40±0.29,P<0.05）、JEV-L对照组（0.36±0.13,P<0.05）、pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（0.36±0.21,P<0.05）;而CD8+TCM/TEM比值在PBS空白对照组为（0.28±0.17）与pcDNA3.1（+）阴性对照组的（0.27±0.05）基本一致,均低于其它组（P<0.05）。13.pJME-LC3促进JEV特异性中和抗体快速、持续生成pJME-LC3实验组小鼠血清中和抗体效价早在攻毒前2天即有升高（1:20）,攻毒后14天达到1:160,此外其余各组中和抗体滴度均在攻毒后21天下降,而pJME-LC3实验组未见衰减。提示pJME-LC3免疫组小鼠血清抗体产生速度、效价增长速度、效价绝对值、抗体效价持续时间均优于pJME常规DNA疫苗对照组、JEV-L对照组或pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组。14.pJME-LC3增强对JE BALB/c鼠的保护性免疫用JEV野生强毒株YN2016-1对小鼠进行攻击后第2天,大部分小鼠开始有不同程度的毛色晦暗潮湿、食欲不振、体重减轻等症状,之后陆续出现死亡。至攻毒后第21天,第一批:pJME-LC3实验组存活率为（13/15,86.67%）,高于JEV-L对照组（12/15,80%）,pJME常规DNA疫苗对照组（8/15,53.33%）及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（7/15,46.67%）。第二批:pJME-LC3实验组存活率为（91.67±2.36）%,显着高于JEV-L组（81.67±2.36）%,pJME组（61.67±2.36）%及pJME-LC3+3-MA组（56.67±2.36）%。结论:1.构建的pJME-LC3可在体外快速、稳定表达,激活自噬并将prME-LC3融合蛋白传递至细胞自噬途径;2.pJME-LC3促进DCs对prME-LC3融合蛋白的摄取,并通过提高免疫鼠脾CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞数量增强JEV特异性的CTL活性;3.pJME-LC3通过增加Th1型细胞因子分泌水平诱导Th1型细胞免疫应答,同时促进以IgG2a为主体的体液免疫应答;4.pJME-LC3通过IFN-γ-JAK2/STAT1-T-bet途径促进初始CD4+T淋巴细胞向Th1型细胞分化,可成为自噬介导JE DNA疫苗免疫增强效应机制之一;5.pJME-LC3通过增加JEV特异性CD4+、CD8+TCM/TEM比例,诱导长效免疫记忆;6.pJME-LC3通过促进JEV特异性中和抗体的快速、持续生成诱导强效免疫保护。
赵彩权[9]（2019）在《日本乙型脑炎病毒编码的解旋酶降解宿主miRNA的机制研究》文中进行了进一步梳理黄病毒科病毒是一类单链正义RNA病毒,可引起多种重要的人和动物传染病。该家族的许多成员是虫媒病毒,通过蚊子和蜱等节肢动物作为载体进行传播。日本脑炎病毒（JEV）、西尼罗河病毒（WNV）、寨卡病毒（ZIKV）和登革热病毒（DENV）是对人类健康产生重大影响的黄病毒属病毒。有研究表明,真核生物miRNA在病毒的复制和传播中起重要作用。宿主miRNA的表达和靶向结合病毒基因组能够参与细胞的抗病毒免疫反应。很多时候,宿主miRNA在病毒的生命周期中通过复杂的调控途径来促进或抑制其对宿主的感染。miRNA也可以由病毒基因组编码并在宿主细胞中表达,病毒miRNA可以与宿主miRNA拥有共同的序列,或者具有完全不同的序列。因此,黄病毒科病毒调控宿主miRNA的表达和功能对疾病的发生具有极其重要的作用。黄病毒科病毒调控miRNA产生的研究报道已有很多,但通过其NS3的解旋酶功能对miRNA产生调控的研究还未见报道。在本研究中,首先我们通过高通量测序数据分析感染日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）的鼠脑组织和小鼠神经元细胞,发现JEV感染后导致宿主细胞中整体miRNA的表达水平发生下调。我们通过添加转录抑制剂Favipiravir（T-705）、α-鹅膏蕈碱（α-Amanitin）和翻译抑制剂环己酰亚胺（CHX）的实验发现,宿主miRNA表达下调是由于JEV感染后翻译的蛋白质所导致的。为了进一步确定哪种病毒蛋白调控宿主miRNA的降解,我们构建了表达JEV结构蛋白（E、C、PrM）和非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）的10种pcDNA3.1表达载体。将这10种载体分别转染NA细胞,待48 h后检测其对宿主细胞miR-466d-3p表达的影响,发现JEV的NS3能够显着下调miR-466d-3p的表达。随后构建了其他黄病毒科病毒NS3的表达载体,发现ZIKV、WNV、DENV1、CSFV和HCV都能够不同程度的下调miR-466d-3p的表达。通过NS3的siRNA抑制试验以及病毒NTPase和解旋酶化学抑制剂DRB（5,6-dichloro-1-β-D-ribofuranosyl-1H-benzimidazole）和伊维菌素（Ivermectin,IVER）处理发现NS3的解旋酶活性能够下调宿主miRNA的表达。已有研究表明,阻碍RISC沉默复合体蛋白Dicer和Argonaute蛋白的活性会抑制miRNA的顺利产生。我们利用qRT-PCR的方法检测了RISC中主要组成蛋白基因的表达。结果显示组成RISC沉默复合体蛋白的表达在JEV感染后均发生了不同程度的上调,表明JEV NS3不是通过影响RISC沉默复合体的活性来抑制宿主神经元细胞miRNA的表达。其次,通过解旋酶阻断试验和miRNA体外双链解旋试验的结果表明,NS3可以导致pre-miR-466d的双链结构解开并导致成熟miRNA功能异常。通过建模和RNA免疫沉淀实验,我们发现NS3解旋酶区域的精氨酸富集结构域对premiRNA的结合和宿主miRNA的降解至关重要。对NS3解旋酶区域精氨酸富集结构域保守氨基酸位点定点突变的实验结果显示,R226G和R202W显着降低了与pre-miR-466d的结合和降解能力。综上所述,黄病毒属病毒NS3的解旋酶功能对宿主细胞miRNA的产生具有至关重要的调控作用,为揭示病毒和宿主miRNA的相互作用和抗病毒免疫反应提供了新的途径。
胡广[10]（2019）在《交叉反应性CD8阳性T细胞在抗肿瘤和抗病毒中的作用》文中进行了进一步梳理随着科学技术的进步以及免疫学领域的发展,人类的生活水平有了很大的改善。然而当前,人类健康仍然受到肿瘤以及诸如黄病毒等病原体的威胁。肿瘤是一种高死亡率的全球化的疾病。面对越来越高的发病率,现有的肿瘤治疗手段已经很难达到理想的效果。肿瘤免疫治疗被认为是治疗,甚至是治愈肿瘤的希望。近年来,这一领域快速发展,已经引发了全球性的关注。由于多数肿瘤抗原属于自身抗原,受中枢耐受等机制的影响,机体对肿瘤抗原的免疫反应水平较低。因此,诱导抗原交叉反应性CD8阳性T细胞的产生,或许是一种有效的治疗肿瘤的策略。本文第一部分对诱导产生抗原交叉反应性CD8阳性T细胞的免疫策略进行了探究,并DCs根据优化的免疫策略,对其应用于肿瘤治疗的情况进行了研究,并发现CCL3细胞因子具有增强疫苗免疫反应的作用。寨卡病毒作为一种“新兴”的黄病毒,因其感染与孕妇分娩的胎儿小头畸形症以及成人格林巴列综合征的发生有关,受到越来越多的关注。对登革病毒的研究表明,异源化的登革病毒感染产生的登革病毒抗原特异的交叉反应性CD8阳性T细胞介导对之后寨卡病毒感染的保护性作用。那么同样作为黄病毒的日本脑膜炎病毒,在免疫后,产生的交叉反应性CD8阳性T细胞是否同样能介导对寨卡病毒感染的保护性作用呢?在本论文中的第二部分,我们对此进行了研究,初步结果表明,日本脑膜炎病毒免疫产生的CD8阳性T细胞具有保护小鼠对抗之后寨卡病毒感染的趋势。仍然需要更多的研究进行证实这一结果。
二、西尼罗河病毒感染的幸存者预后良好（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、西尼罗河病毒感染的幸存者预后良好（论文提纲范文）
（1）猪日本乙型脑炎病毒单克隆抗体制备及快速检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 日本乙型脑炎研究进展 |
| 1.1 日本乙型脑炎流行病学 |
| 1.1.1 日本乙型脑炎在世界范围内流行情况 |
| 1.1.2 日本乙型脑炎在中国境内流行情况 |
| 1.1.3 家畜感染日本乙型脑炎情况 |
| 1.1.4 日本乙型脑炎感染体征和症状 |
| 1.2 日本乙型脑炎病毒 |
| 1.2.1 日本乙型脑炎病毒的病原学 |
| 1.2.2 日本乙型脑炎病毒的分子生物学 |
| 1.2.3 日本乙型脑炎病毒的致病机理 |
| 1.3 日本乙型脑炎病毒检测方法 |
| 1.3.1 病毒分离鉴定 |
| 1.3.2 分子生物学方法 |
| 1.3.3 血清学方法 |
| 1.4 日本乙型脑炎病毒疫苗 |
| 1.4.1 鼠源性乙脑灭活疫苗 |
| 1.4.2 细胞源性乙脑灭活疫苗 |
| 1.4.3 SA14-14-2 减毒活疫苗 |
| 1.4.4 嵌合减毒活疫苗 |
| 1.4.5 其他疫苗 |
| 第二章 单克隆抗体与胶体金免疫层析技术研究进展 |
| 2.1 单克隆抗体 |
| 2.1.1 杂交瘤技术生产单克隆抗体 |
| 2.1.2 早期单克隆抗体的缺点和可能的替代发展 |
| 2.1.3 抗日本乙型脑炎病毒单克隆抗体的研究进展 |
| 2.2 胶体金免疫层析技术研究进展 |
| 2.2.1 胶体金颗粒的制备机理 |
| 2.2.2 免疫层析试纸结构 |
| 2.2.3 胶体金免疫层析技术在猪病检测中的应用 |
| 试验研究 |
| 第三章 猪日本乙型脑炎病毒在BHK-21 细胞中动态增殖的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 阳性质粒鉴定结果 |
| 3.2.2 荧光定量PCR方法的评价 |
| 3.2.3 猪日本乙型脑炎病毒在BHK-21 细胞中的动态增殖 |
| 3.3 讨论与分析 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 猪日本乙型脑炎病毒的双重层析纯化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 Sepharose4FF凝胶过滤层析 |
| 4.2.2 Capto~(TM) Core 700 层析 |
| 4.2.3 病毒回收和浓缩 |
| 4.2.4 残留宿主细胞蛋白(HCP)和牛血清白蛋白(BSA)测定 |
| 4.2.5 电子显微镜检查 |
| 4.2.6 纯化病毒的免疫原性分析 |
| 4.3 讨论与分析 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 猪日本乙型脑炎病毒单克隆抗体的制备 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 猪日本乙型脑炎病毒感染Vero细胞 |
| 5.2.2 小鼠免疫后血清效价测定 |
| 5.2.3 阳性克隆的筛选与克隆 |
| 5.2.4 单克隆抗体的特性鉴定 |
| 5.3 讨论与分析 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 猪日本乙型脑炎病毒胶体金试纸条研制与应用 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 试验方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 透射电镜扫描 |
| 6.2.2 日本乙型脑炎病毒单抗饱和度测定 |
| 6.2.3 日本乙型脑炎病毒单抗标记最佳条件 |
| 6.2.4 日本乙型脑炎病毒多抗IgG纯化及最佳拦截浓度 |
| 6.2.5 胶体金结合垫(金垫)的筛选 |
| 6.2.6 样本结合垫(样品垫)的筛选及确定 |
| 6.2.7 样品稀释液的最佳条件优化 |
| 6.2.8 猪日本乙型脑炎病毒抗原快速检测试纸的批量生产及性能测试 |
| 6.3 讨论与分析 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 猪日本乙型脑炎病毒阻断ELISA方法的建立及初步应用 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试验材料 |
| 7.1.2 试验方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 单抗腹水纯化与辣根过氧化物酶(HRP)标记 |
| 7.2.2 包被抗原和酶标单抗工作浓度 |
| 7.2.3 封闭液 |
| 7.2.4 封闭时间与温度 |
| 7.2.5 待检血清作用时间及温度 |
| 7.2.6 2F2-HRP作用时间 |
| 7.2.7 底物作用时间 |
| 7.2.8 临界值 |
| 7.2.9 特异性和敏感性 |
| 7.2.10 重复性 |
| 7.2.11 临床应用 |
| 7.3 讨论与分析 |
| 7.4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）乙型脑炎病毒入侵脑微血管内皮细胞机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 乙型脑炎病毒感染脑微血管内皮细胞的宿主因子筛选及内吞途径研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Ezrin在乙型脑炎病毒入侵脑微血管内皮细胞中的作用及机制 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 靶向Src/ezrin的抑制剂作为潜在抗乙型脑炎病毒药物 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 常见蚊媒病毒穿越血脑屏障机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文及参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（3）乙型脑炎病毒对雏鸭致病性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 乙型脑炎病毒简介 |
| 1.2 乙型脑炎的流行病学 |
| 1.3 临床表现和病理变化 |
| 1.3.1 人感染JEV |
| 1.3.2 家畜感染JEV |
| 1.3.3 禽类感染JEV |
| 1.3.4 其他动物感染JEV |
| 1.4 淡色库蚊在JEV传播中的作用 |
| 1.5 JEV的诊断与防控 |
| 1.5.1 JEV的诊断 |
| 1.5.2 JE的防控 |
| 第二章 鸭群中乙型脑炎病毒及其抗体检测 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 血清样品JEV抗体检测 |
| 2.1.3 样品中核酸提取 |
| 2.1.4 RT-PCR检测JEV基因 |
| 2.1.5 全长E基因的扩增及测序 |
| 2.1.6 荧光定量RT-PCR检测病毒组织分布 |
| 2.1.7 E基因序列遗传进化分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 JEV抗体检测结果 |
| 2.2.2 RT-PCR检测结果 |
| 2.2.3 序列遗传进化分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 实验用淡色库蚊的饲养与自然交配繁殖 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 蚊种 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.1.3 饲养环境 |
| 3.1.4 成虫饲养 |
| 3.1.5 成蚊吸血繁殖 |
| 3.1.6 幼虫饲养 |
| 3.1.7 蚊蛹孵化 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 淡色库蚊的生殖营养周环 |
| 3.2.2 淡色库蚊繁殖情况 |
| 3.2.3 淡色库蚊繁殖的注意事项 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 新生雏鸭通过蚊子叮咬感染JEV的实验 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 伦理道德声明 |
| 4.1.2 实验材料 |
| 4.1.3 细胞复苏传代及病毒扩增滴定 |
| 4.1.4 胸腔注射接种淡色库蚊 |
| 4.1.5 淡色库蚊叮咬感染雏鸭 |
| 4.1.6 临床症状观察 |
| 4.1.7 病理切片检查 |
| 4.1.8 免疫组织化学检查 |
| 4.1.9 样品中核酸提取 |
| 4.1.10 qRT-PCR检测JEV |
| 4.1.11 RT-PCR检测JEV |
| 4.1.12 雏鸭体内病毒分离 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 JEV在蚊子体内的分布 |
| 4.2.2 临床症状和病毒血症 |
| 4.2.3 组织病理变化 |
| 4.2.4 脑组织中JEV的检测 |
| 4.2.5 病毒分离 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）基因Ⅰ型与Ⅲ型JEV在水禽宿主中适应性差异的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乙型脑炎概述 |
| 1.1.1 乙型脑炎流行病学特征 |
| 1.1.2 乙型脑炎的临床症状与病理变化 |
| 1.1.3 乙型脑炎的防控措施 |
| 1.2 乙型脑炎病毒 |
| 1.2.1 乙型脑炎病毒的形态、理化及生物特性 |
| 1.2.2 乙型脑炎病毒基因组结构及其功能 |
| 1.2.3 乙型脑炎病毒复制周期 |
| 1.2.4 乙型脑炎病毒基因型分布及基因型转换 |
| 1.3 黄病毒感染性克隆研究进展 |
| 1.4 乙型脑炎病毒反向遗传学系统的应用 |
| 1.5 黄病毒逃逸天然免疫的分子机制 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 GⅠ型与GⅢ型 JEV PCR-Based反向遗传学系统的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒、细胞、质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 病毒的扩增 |
| 2.1.5 病毒RNA的提取 |
| 2.1.6 GⅠ型与GⅢ型 JEV第一链c DNA合成 |
| 2.1.7 GⅠ型与GⅢ型 JEV基因组的分段克隆 |
| 2.1.8 GⅠ型与GⅢ型 JEV全长c DNA的克隆 |
| 2.1.9 病毒的拯救 |
| 2.1.10 拯救病毒的间接免疫荧光鉴定 |
| 2.1.11 拯救病毒的多步生长曲线 |
| 2.1.12 病毒蚀斑试验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 GI与 GⅢ型 JEV基因组序列的同源性分析及引物保守型分析 |
| 2.2.2 GⅠ型与GⅢ型 JEV基因组分段扩增与克隆 |
| 2.2.3 病毒全长cDNA扩增 |
| 2.2.4 rGI与rGIII JEV的拯救与鉴定 |
| 2.2.5 被拯救病毒与亲本毒生长特性的比较 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 GI与 GⅢ型 JEV在水禽宿主中诱导IFN-I表达的差异 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒、细胞、实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 鸭胚成纤维细胞的制备 |
| 3.1.5 RNA提取与反转录 |
| 3.1.6 荧光定量PCR检测Ⅰ型干扰素表达 |
| 3.1.7 ELISA方法检测Ⅰ型干扰素的表达量 |
| 3.1.8 细胞上清中病毒滴度测定 |
| 3.1.9 细胞中病毒蛋白水平测定 |
| 3.1.10 雏鸭动物实验 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 三种细胞感染JEV后间接免疫荧光验证 |
| 3.2.2 GⅠ型与GⅢ型 JEV诱导Ⅰ型干扰素表达的差异 |
| 3.2.4 GⅠ型与GⅢ型 JEV在宿主细胞中病毒滴度的测定 |
| 3.2.5 GⅠ型与GⅢ型 JEV在雏鸭体内诱导干扰素表达的差异 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 GⅠ型与GⅢ型 JEV诱导水禽宿主IFN-I表达差异的分子基础 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞、质粒、病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 GⅠ型与GⅢ型 JEV氨基酸序列的比对分析 |
| 4.1.5 嵌合病毒与定点突变病毒的构建 |
| 4.1.6 嵌合病毒与定点突变病毒在DEF中诱导IFN-I表达能力分析 |
| 4.1.7 嵌合病毒与定点突变病毒复制动力学分析 |
| 4.1.8 嵌合病毒与定点突变病毒的空斑形成试验 |
| 4.1.9 GⅠ型与GⅢ型 JEV NS5 蛋白拮抗IFN-I表达能力分析 |
| 4.1.10 小鼠动物实验 |
| 4.1.11 雏鸭动物实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 GⅠ型与GⅢ型 JEV差异性氨基酸位点分析 |
| 4.2.2 GⅠ型与GⅢ型 JEV间结构蛋白相互替换嵌合病毒的构建及拯救 |
| 4.2.3 结构蛋白相互替换的嵌合病毒诱导Ⅰ型干扰素能力分析 |
| 4.2.4 结构蛋白相互替换的嵌合病毒复制动力学分析 |
| 4.2.5 非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B/NS3、NS4A/NS4B、NS5 相互替换的嵌合病毒构建 |
| 4.2.6 非结构蛋白NS5 决定GⅠ型与GⅢ型 JEV诱导IFN-I表达的差异 |
| 4.2.7 非结构蛋白NS5 决定GⅠ型 JEV在 DEF细胞中的复制优势 |
| 4.2.8 NS5-a-a Rd Rp区域决定GI与 GⅢ型 JEV诱导IFN-I表达的差异 |
| 4.2.9 NS5-a-a Rd Rp区域决定GⅠ型 JEV在 DEF中的复制优势 |
| 4.2.10 NS5-372-386 位点共同决定GⅠ型与GⅢ型 JEV在 DEF中诱导IFN-表达的差异 |
| 4.2.11 NS5-372-386 位点共同决定GⅠ型与GⅢ型 JEV在 DEF中复制差异. |
| 4.2.12 NS5-V372A-H386Y位点突变不改变病毒对小鼠的毒力 |
| 4.2.13 NS5-372V-386H位点决定GⅠ型 JEV在雏鸭宿主中适应性的优势 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 NS5-V372A-H386Y决定水禽宿主IFN-I表达差异的分子机制 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞、质粒、病毒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 细胞核与细胞质蛋白分离 |
| 5.1.5 鸭源核转运受体蛋白与鸭源IRF7分子的克隆表达 |
| 5.1.6 鸭源核转运受体蛋白与JEVNS5蛋白分子的互作 |
| 5.1.7 鸭源核转运受体蛋白与duIRF7分子的互作 |
| 5.1.8 鸭源核转运受体蛋白du KPNA4与du IRF7 共定位实验 |
| 5.1.9 鸭源核转运受体蛋白du KPNA4对Ⅰ型干扰素表达的作用 |
| 5.1.10 GⅠ型与GⅢ型 JEV NS5-372 与386 位点的同性氨基酸替代 |
| 5.1.11 NS5-372-386 位点突变病毒的诱导IFN-I表达能力分析 |
| 5.1.12 NS5-372-386位点突变病毒的复制动力学分析 |
| 5.1.13 NS5-372-386位点突变病毒的空斑形成试验 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 GⅠ型与GⅢ型 JEV NS5 蛋白核定位能力分析 |
| 5.2.2 GⅠ型与GⅢ型 NS5 蛋白与du KPNA2、du KPNA3、du KPNA4 互作 |
| 5.2.3 鸭源IRF7 分子与核转运受体蛋白du KPNA4 互作 |
| 5.2.4 GⅠ型与GⅢ型 JEV NS5 蛋白不与du IRF7 分子互作 |
| 5.2.5 du KPNA4 促进du IRF7 分子入核启始IFN-I表达 |
| 5.2.6 NS5-372-386 位点决定NS5 蛋白与du KPNA4 的结合能力 |
| 5.2.7 NS5-372-386 氢键排布决定GⅠ型与GⅢ型 JEV对水禽宿主适应性 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）内蒙古地区优势蚊种的基因多态性分析及西尼罗病毒检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 蚊虫的概述 |
| 1.1.2 蚊虫的分类 |
| 1.1.3 蚊虫分布 |
| 1.2 蚊子的种型鉴定方法 |
| 1.2.1 传统形态学鉴定方法 |
| 1.2.2 分子生物学鉴定方法 |
| 1.3 蚊传疾病 |
| 1.3.1 蚊传疾病的流行情况 |
| 1.3.2 蚊传疾病的防治 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 试验材料 |
| 2.1 蚊虫的采集 |
| 2.2 培养基及缓冲液 |
| 2.3 试剂耗材 |
| 2.4 仪器设备 |
| 3 方法 |
| 3.1 蚊虫的种型鉴定 |
| 3.1.1 形态学鉴定 |
| 3.1.2 分子生物学鉴定 |
| 3.1.3 数据处理分析 |
| 3.2 在蚊虫体内西尼罗病毒的检测 |
| 3.2.1 蚊虫总RNA的提取 |
| 3.2.2 TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立 |
| 4 结果 |
| 4.1 蚊虫种型鉴定及基因多态性结果 |
| 4.1.1 蚊虫的形态学鉴定结果 |
| 4.1.2 蚊虫COI基因的扩增和同源性分析结果 |
| 4.1.3 蚊虫的COI基因序列遗传进化树结果 |
| 4.1.4 蚊虫COI基因序列组成及核苷酸不同位点碱基替代类型结果 |
| 4.1.5 遗传距离分析结果 |
| 4.1.6 COI基因遗传多样性和单倍型分析结果 |
| 4.2 在蚊虫体内西尼罗病毒检测结果 |
| 4.2.1 TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线绘制结果 |
| 4.2.2 TaqMan实时荧光定量PCR特异性试验结果 |
| 4.2.3 TaqMan实时荧光定量PCR灵敏性试验结果 |
| 4.2.4 TaqMan实时荧光定量PCR方法检测样品结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）索非布韦抗日本乙型脑炎病毒体外活性研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 日本乙型脑炎的研究现状 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（7）流行性乙型脑炎病毒感染与吉兰巴雷综合征相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
（8）自噬介导的日本脑炎DNA疫苗免疫增强效应及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:LC3与JEV prME蛋白真核表达重组质粒的构建和鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 RT-PCR法扩增小鼠LC3B基因 |
| 2.3.2 JEV prME蛋白与小鼠LC3B蛋白编码基因重组质粒的构建 |
| 2.3.3 pJME-LC3 转染CHO-K1 细胞及稳定转染细胞株的筛选 |
| 2.3.4 pJME-LC3 编码蛋白及诱导自噬相关蛋白的western blot分析 |
| 2.3.5 结晶紫染色观察pJME-LC3 诱导自噬性细胞集落形成 |
| 2.3.6 透射电镜观察pJME-LC3 诱导自噬小体形成 |
| 2.3.7 共聚焦显微镜观察pJME-LC3编码蛋白与LC3 蛋白在自噬体中共定位 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 pJME-LC3 的构建及鉴定 |
| 3.1.1 LC3B蛋白编码基因的合成 |
| 3.1.2 pJME-LC3 的构建、鉴定 |
| 3.2 pJME-LC3 编码蛋白的体外表达 |
| 3.2.1 pJME-LC3 编码蛋白的瞬时表达 |
| 3.2.2 pJME-LC3 编码蛋白的稳定表达 |
| 3.3 pJME-LC3 体外激活自噬 |
| 3.3.1 pJME-LC3 促进自噬性细胞集落的形成 |
| 3.3.2 pJME-LC3 促进CHO-K1 细胞自噬小体的形成 |
| 3.3.3 pJME-LC3 促进CHO-K1 细胞自噬相关蛋白的表达 |
| 3.4 pJME-LC3 编码蛋白与LC3 蛋白共定位于自噬体 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:自噬增强JE DNA疫苗免疫效应及机制的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 pJME/pJME-LC3 的大量提取与纯化 |
| 2.3.2 BALB/c鼠分组及免疫 |
| 2.3.3 免疫鼠脾脏淋巴细胞的分离 |
| 2.3.4 免疫鼠脾脏淋巴细胞和DCs的分离 |
| 2.3.5 间接免疫荧光法检测质粒编码蛋白在免疫鼠脾脏DCs中的表达 |
| 2.3.6 流式细胞术检测免疫鼠脾脏DCs内吞能力 |
| 2.3.7 流式细胞术分析免疫鼠脾脏CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞亚群 |
| 2.3.8 LDH活性释放法检测免疫鼠JEV特异性CTL活性 |
| 2.3.9 ELISA法检测免疫鼠脾脏T淋巴细胞分泌细胞因子水平 |
| 2.3.10 ELISA法检测免疫鼠血清JEV特异性Ig G1/Ig G2a抗体相对滴度 |
| 2.3.11 Western blot法检测IFN-γ-JAK2/STAT1-T-bet信号通路蛋白表达 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 pJME-LC3 促进质粒编码蛋白在免疫鼠脾脏DCs中的表达 |
| 3.2 pJME-LC3 增强免疫鼠脾脏DCs内吞能力 |
| 3.3 pJME-LC3 促进免疫鼠脾脏CD3+CD4+/CD3+CD8+T 淋巴细胞数量 |
| 3.4 pJME-LC3 促进免疫鼠JEV特异性CTLs活性 |
| 3.5 pJME-LC3 促进免疫鼠JEV特异性Ig G2a抗体相对滴度快速、持续升高 |
| 3.6 pJME-LC3 促进免疫鼠脾脏T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ、IL-12 |
| 3.7 pJME-LC3 促进免疫鼠脾脏T淋巴细胞pJAK2、pSTAT1 蛋白及下游转录因子T-bet的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:pJME-LC3 促进BALB/c鼠保护性免疫及免疫记忆的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 pJME/pJME-LC3 的大量提取与纯化 |
| 2.3.2 BALB/c鼠分组及免疫 |
| 2.3.3 免疫鼠脾脏淋巴细胞的分离 |
| 2.3.4 流式细胞术分析免疫鼠脾脏CD4+/CD8+记忆性T淋巴细胞亚群 |
| 2.3.5 病毒攻击 |
| 2.3.6 观察各免疫组小鼠存活率 |
| 2.3.78 0%空斑减少中和试验(PRNT80)检测免疫鼠JEV特异性中和抗体滴度 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 pJME-LC3 促进免疫鼠CD4+、CD8+TCM/TEM比值 |
| 3.2 pJME-LC3 增强对JE小鼠模型的保护性免疫 |
| 3.3 pJME-LC3 促进JEV特异性中和抗体生成 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）日本乙型脑炎病毒编码的解旋酶降解宿主miRNA的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 病毒与宿主miRNA相互作用的研究进展 |
| 1 miRNA的研究进展 |
| 1.1 miRNA的发现 |
| 1.2 miRNA产生的基因结构 |
| 1.3 miRNA产生的经典途径 |
| 1.4 miRNA产生的非经典途径 |
| 1.4.1 不依赖“微处理器”的miRNA产生途径 |
| 1.4.2 不依赖于Dicer的 miRNA产生途径 |
| 1.5 miRNA产生的分子机制 |
| 1.5.1 pri-miRNA转录本的序列和结构特征 |
| 1.5.2 微处理器 |
| 1.5.3 RNA III型聚合酶Dicer及其结合蛋白 |
| 1.5.4 RNA诱导沉默复合物的形成 |
| 1.6 isomiRNAs产生机制 |
| 1.6.1 5'末端加工产生isomiRNA的机制 |
| 1.6.2 3'isomiRNA的产生机制 |
| 1.6.3 3'末端加尾修饰 |
| 1.6.4 序列突变产生isomiRNA的机制 |
| 2 病毒与宿主miRNA的相互作用 |
| 2.1 宿主miRNA与病毒相互作用的影响因素 |
| 2.2 宿主miRNA与病毒基因组的相互作用 |
| 2.3 病毒感染对宿主miRNA表达水平的调节 |
| 3 黄病毒与miRNA的相互作用 |
| 3.1 黄病毒简介 |
| 3.2 miRNA介导的黄病毒基因组的稳定转录 |
| 3.3 黄病毒感染对宿主miRNA表达水平的调节 |
| 第二章 JEV编码的解旋酶降解宿主miRNA的机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 实验动物、细胞及病毒 |
| 2.2 试剂耗材 |
| 2.3 实验仪器 |
| 3 主要试验方法 |
| 3.1 JEV滴度测定 |
| 3.2 JEV感染细胞 |
| 3.3 细胞RNA的提取 |
| 3.4 细胞RNA的反转录和实时定量PCR |
| 3.5 免疫印迹 |
| 3.6 miRNA模拟物或抑制剂转染细胞 |
| 3.7 RNA免疫共沉淀 |
| 3.8 液相色谱、质谱串联系统分析方法 |
| 3.9 miRNA测序数据分析 |
| 3.10 miRNA测序reads分析 |
| 3.11 miRNA实时定量PCR |
| 4 结果 |
| 4.1 JEV介导小鼠神经细胞miRNA表达分析 |
| 4.1.1 测序数据质控 |
| 4.1.2 miRNA表达分析 |
| 4.1.3 miRNA表达下调 |
| 4.2 JEV NS3 介导神经元细胞中miRNA的降解 |
| 4.2.1 转录抑制剂对JEV调控miRNA表达的影响 |
| 4.2.2 JEV NS3 对神经元细胞中miRNA表达的调控 |
| 4.2.3 RNA-seq分析JEV NS3 对神经元细胞miRNA表达调控 |
| 4.2.4 干扰JEV NS3 对宿主细胞miRNA表达的影响 |
| 4.2.5 JEV NS3 对宿主细胞RISC的影响 |
| 4.2.6 miR-466d-3p调控宿主细胞JEV的复制 |
| 4.3 JEV感染诱导宿主细胞isomiRNA的产生 |
| 4.4 JEV对pri-、pre-、mature-miRNA表达的调控 |
| 4.4.1 体内检测感染JEV后 pri-、pre-、mature-miRNA的表达 |
| 4.4.2 体外检测JEV对 miRNA的降解 |
| 4.5 JEV NS3 降解宿主miRNA的表达 |
| 4.5.1 解旋酶抑制剂阻断NS3 导致的miRNA降解 |
| 4.5.2 JEV NS3对miR-466d-3p的体外解旋 |
| 4.6 JEV NS3与miRNA的结合情况 |
| 4.6.1 RPISeq软件分析NS3与pre-miRNA和 miRNA的结合情况 |
| 4.6.2 RIP分析JEV NS3与miRNA的结合情况 |
| 4.6.3 免疫荧光技术分析与miRNA的结合情况 |
| 4.7 JEV NS3与miRNA结合位点突变对miRNA表达的影响 |
| 4.7.1 JEV NS3与miRNA结合氨基酸位点分析 |
| 4.7.2 JEV NS3与miRNA结合氨基酸位点突变分析 |
| 4.8 黄病毒科病毒NS3对miRNA表达的调控 |
| 4.8.1 不同黄病毒科病毒NS3对miRNA的降解 |
| 4.8.2 系统进化树分析黄病毒科病毒NS3与miRNA结合的氨基酸位点 |
| 4.8.3 miRNA与 JEV NS3 结合的结构域 |
| 5 讨论 |
| 5.1 病毒感染对宿主miRNA表达的调控方式 |
| 5.2 黄病毒属病毒解旋酶对miRNA表达的调控 |
| 5.3 RNA结合蛋白对miRNA表达的影响 |
| 5.4 pre-miRNA高通量测序分析黄病毒属病毒NS3对miRNA表达的调控 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
（10）交叉反应性CD8阳性T细胞在抗肿瘤和抗病毒中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一部分 交叉反应性CD8阳性T细胞在抗肿瘤中的应用 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 GP100、TRP2 相关序列及合成情况 |
| 2.2 试剂及常用溶液 |
| 2.3 实验动物 |
| 2.4 DCS的培养及小鼠免疫方法 |
| 2.5 LPS与 CPG作为联合佐剂免疫小鼠 |
| 2.6 脾脏细胞的体外刺激实验 |
| 2.7 流式细胞分析法检测 |
| 2.8 数据分析与整理 |
| 3.实验结果与讨论 |
| 3.1 DCS荷载GP100 相关多肽进行小鼠免疫后的免疫反应 |
| 3.2 DCS在不同温度下,与多肽进行孵育免疫小鼠后,小鼠的免疫应答情况 |
| 3.3 DCS-PEP免疫小鼠一次与两次的免疫反应的比较 |
| 3.4 LPS与CPG作为联合佐剂与N4 多肽混合后免疫小鼠 |
| 3.5 炎症性细胞因子增强DCS-PEP疫苗的研究 |
| 3.6 DCS-PEP疫苗与联合佐剂疫苗结合后增强小鼠免疫反应的情况 |
| 3.7 DCS-PEP疫苗与联合佐剂疫苗结合后用于治疗小鼠黑色素瘤的研究 |
| 3.8 TRP2 多肽结合DCS疫苗与联合佐剂用于小鼠肿瘤治疗情况 |
| 4.讨论和展望 |
| 5.参考文献 |
| 第二部分 交叉反应性CD8阳性T细胞在抗病毒中的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 小鼠及伦理 |
| 2.2 多肽合成 |
| 2.3 病毒、细胞以及试剂 |
| 2.4 小鼠感染实验 |
| 2.5 脾脏细胞的体外刺激实验 |
| 2.6 细胞染色以及流式细胞术检测细胞因子的产生情况 |
| 2.7 酶联免疫斑点实验 |
| 2.8 过继性转移细胞转移实验 |
| 2.9 数据分析与整理 |
| 3.实验结果及讨论 |
| 3.1 HLA限制性的JEV以及ZIKV表位预测情况 |
| 3.2 通过IFNg的ELISPOT实验筛选免疫优势的多肽表位 |
| 3.3 通过细胞内因子的染色实验进一步验证筛选的免疫优势表位 |
| 3.4 JEV免疫对ZIKV感染的影响 |
| 3.5 JEV免疫能否介导对之后ZIKV感染的保护性作用呢? |
| 4.讨论和展望 |
| 5.参考文献 |
| 第三部分专业综述 黄病毒科病毒交叉免疫应答对寨卡病毒感染的影响 |
| 1.前言 |
| 2.黄病毒交叉反应性抗体对寨卡病毒感染的影响 |
| 3.黄病毒交叉反应性T细胞对寨卡病毒感染的影响 |
| 4.讨论与展望 |
| 5.参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、西尼罗河病毒感染的幸存者预后良好（论文参考文献）
- [1]猪日本乙型脑炎病毒单克隆抗体制备及快速检测方法的建立[D]. 张福良. 西北农林科技大学, 2021
- [2]乙型脑炎病毒入侵脑微血管内皮细胞机制研究[D]. 刘延刚. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [3]乙型脑炎病毒对雏鸭致病性的研究[D]. 狄荻. 中国农业科学院, 2020(01)
- [4]基因Ⅰ型与Ⅲ型JEV在水禽宿主中适应性差异的分子机制[D]. 李晨曦. 中国农业科学院, 2020(01)
- [5]内蒙古地区优势蚊种的基因多态性分析及西尼罗病毒检测方法的建立[D]. 包伟东. 内蒙古农业大学, 2020
- [6]索非布韦抗日本乙型脑炎病毒体外活性研究[D]. 饶清. 昆明医科大学, 2020(02)
- [7]流行性乙型脑炎病毒感染与吉兰巴雷综合征相关性研究[D]. 王国玮. 宁夏医科大学, 2020(08)
- [8]自噬介导的日本脑炎DNA疫苗免疫增强效应及机制研究[D]. 赵芳芳. 中国医科大学, 2020(01)
- [9]日本乙型脑炎病毒编码的解旋酶降解宿主miRNA的机制研究[D]. 赵彩权. 内蒙古大学, 2019(05)
- [10]交叉反应性CD8阳性T细胞在抗肿瘤和抗病毒中的作用[D]. 胡广. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2019(07)