一、鼻咽癌发生发展过程中EBER_1表达的研究（论文文献综述）
赵爽[1]（2021）在《基于转录组测序分析的鼻咽癌相关EB病毒变异亚型及预后模型的研究》文中进行了进一步梳理背景:EB病毒（Epstein-Barrvirus,EBV）广泛感染人类,引发多种疾病包括恶性肿瘤,其中与鼻咽癌发病密切相关——在约98%的鼻咽癌患者的肿瘤组织中,可以检测到EBV的核酸。目前,已有多种EBV毒株的基因序列发表,不同肿瘤来源的EBV毒株携带不同的基因变异。EBV的变异可能在其致瘤过程中发挥作用,从而影响特定类型肿瘤的生物学行为。然而,对与鼻咽癌相关的EBV基因变异尚缺乏系统性研究。鼻咽癌是一种具有高度侵袭性和转移性的恶性肿瘤,目前,TNM分期系统是鼻咽癌治疗决策和预后评估的主要依据。然而,该系统对于评估鼻咽癌预后的价值有限,已经不能完全满足临床需求。目的:这一博士学位课题的研究工作基于转录组测序数据分析,目的有二,①发现、鉴定与鼻咽癌相关的EBV基因变异,解析不同EBV亚型与鼻咽癌临床特征的关系,初步揭示鼻咽癌相关EBV基因变异的生物学功能。②筛选、构建鼻咽癌预后分子模型。方法:本项研究共纳入两组鼻咽癌患者;第一组67个病例,主要参加转录组测序及相关分析;第二组32个病例,主要参加EBV基因变异的验证分析。此两组鼻咽癌病例互为独立样本。针对第一组67例鼻咽癌患者的肿瘤和癌旁组织进行转录组测序。对测序数据进行生物信息学分析,从中发现鼻咽癌相关EBV的基因变异。采用RNA原位杂交技术BaseScope联合免疫组化共染色的方法,在第二组32例鼻咽癌组织样本中对测序发现的EBV基因变异进行验证。将上述在鼻咽癌中发现、鉴定的EBV变异位点,与公共数据中非鼻咽癌来源的EBV序列进行聚类分析;从中找出鼻咽癌相关的EBV亚型,并分析不同病毒亚型与鼻咽癌患者临床特征及预后的关系。另外,采用常规细胞分子生物学方法,建立稳定表达上述EBV变异基因的鼻咽癌细胞株,通过体外实验探索鼻咽癌相关EBV变异基因的基本生物学功能。构建鼻咽癌预后分子模型的工作,从第一组参加转录组测序的67例鼻咽癌患者之中选择随访信息完善的60例入组,分为“复发转移组”和“非复发转移组”两组。通过对测序数据的分析,采用随机森林和极限梯度提升的机器学习方法,筛选出宿主的与鼻咽癌预后相关的特征基因。基于这一组特征基因,进一步采用Cox 比例风险回归模型构建鼻咽癌预后模型。继而采用GSEA和相关性分析,评价该模型的医学生物学功能。结果:①转录组测序结果显示,入组的鼻咽癌组织中存在EBV基因变异。其中,EBER2和LMP2基因具有最高的变异频率,分别在65/66和64/66例鼻咽癌组织中被检测到。②采用BaseScope和免疫组化共染技术,在独立样本32个鼻咽癌病例中以单细胞原位的方式验证了测序检出的EBER2的变异;并且证明携带病毒变异的细胞为肿瘤（上皮）细胞,而不是肿瘤组织中的浸润免疫细胞,由此明确了 EBV变异活跃转录的组织细胞来源。③根据EBER2的变异位点,将测序获得的EBV序列与已发表的EBV序列进行聚类分析,可将EBV分为两种亚型:EB-1和EB-2。其中,根据EBER2 7123位点,可进一步将EB-2细分为A>T和A>G两种亚型。EB-1基因型EBV显着富集于鼻咽癌（卡方检验,p<0.0001）;而EB-2亚型富集于中国北方鼻咽癌患者,且与肿瘤T分期相关（卡方检验,p<0.05）。生存分析显示,相较于EB-1亚型和EB-2-A>G,感染EB-2-A>T亚型EBV的患者预后最差（Log-rank,p=0.026）。④结合宿主mRNA表达谱数据进行差异表达基因分析和富集分析发现,EB-1和EB-2亚型参与影响宿主细胞不同的生物学过程。其中,EB-1亚型主要激活“Epithelial mesenchymal transition”,而 EB-2 亚型则主要激活“MYC targets v1”等。⑤针对另一个发生高频率变异的病毒基因LMP2变异的体外实验分析发现,相较于对照组,变异的LMP2B有显着促进鼻咽癌细胞增殖、迁移,抑制凋亡的作用。构建鼻咽癌预后分子模型的工作,对于转录组测序数据重点关注宿主的基因表达。⑥采用机器学习方法筛选出“复发转移组”和“非复发转移组”之间的特征基因,共 13 个:CES4A、GIMAP1.GIMAP5、GLB1L、LGR5、LOC730098、MLF1、MTHFD1L、MYLPF、NUP160、SIRPB1、TCN2、TMEM265、U2AF1L5。⑦基于这些特征基因构建Cox风险比例模型,得到一个4-mRNA signature,包括U2AF1L5、TMEM265、GLB1L和MLF1基因。根据这一模型计算每个患者的风险评分,并将患者分为高风险组和低风险组。⑧Kapan-Meier生存曲线和ROC曲线分析显示,这一预后模型能较好地评估鼻咽癌患者的预后,高风险组患者预后显着差于低风险组（Log-Rank,总生存:p=0.00126,无病生存:p=0.000059）。这一 4-mRNA signature在评估患者总生存以及无病生存的效果（AUC分别为0.893和0.86,）优于T分期（AUC为0.619和0.538）及N分期（AUC:0.582和0.622）。⑨多因素Cox分析结果显示,风险评分是鼻咽癌的独立预后因素（总生存,HR=14.501,p=0.012,无病生存:HR=13.752,p<0.001）。⑩GSEA 富集分析发现 4-mRNA signature 与细胞增殖和宿主免疫应答密切相关。结论:鼻咽癌组织中存在EBV基因变异。其中EBER2和LMP2基因具有最高的变异频率。鼻咽癌组织内发生基因变异的EBV存在于肿瘤细胞而非浸润免疫细胞中。根据EBER2的变异模式,可将EBV分为两种亚型:EB-1和EB-2;它们与鼻咽癌患者的临床特征、预后相关,并可能与宿主发生不同的相互作用。通过对转录组数据的分析挖掘,构建了包含4个基因的4-mRNA signature模型,可用于鼻咽癌预后评估。
王维文[2]（2020）在《CXCR4在EBV相关胃癌中的表达和调控作用研究》文中指出EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）是一种双链DNA病毒,与多种肿瘤的发生相关。约有90%以上的健康人群在幼儿时期曾感染EBV,呈持续性潜伏感染状态,且在其体内均可检测到EBV抗体。EBV相关胃癌（EBV associated gastric carcinoma,EBVaGC）约占胃癌总数的3%-8%,临床病理学特征与其他胃癌不同,其发病机制尚未明了。CXCR4属于高度保守的7次跨膜G蛋白偶联受体,已有研究发现CXCR4在多种肿瘤组织中表达升高,可影响多种肿瘤的发生发展过程,如促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、诱导细胞迁移和侵袭以及上皮间质转化等多种生物学活性。CXCR4与病毒感染密切相关,如CXCR4可作为共受体辅助HIV感染并进入宿主细胞。CXCL12可与CXCR4的N端特异性结合,并与CXCR4的第2胞外环相互作用后启动下游信号通路,调控相关肿瘤的发生和发展。目的:明确CXCR4在EBVaGC组织中的表达及其调控机制,并探讨CXCR4在EBVaGC发生发展中的作用以及可能的作用机制,为进一步阐明EBV在EBVaGC发生发展过程中的作用提供理论基础。材料和方法:（1）实时荧光定量PCR检测EBV阳性和EBV阴性胃癌细胞系中CXCR4及相关microRNA的表达。（2）Western blot检测细胞系中CXCR4及相关蛋白的表达;免疫组化检测EBV阳性和EBV阴性胃癌组织中CXCR4表达。（3）亚硫酸氢盐基因组测序法检测CXCR4基因启动子和第1外显子甲基化状态。（4）在EBV阴性胃癌细胞系中分别过表达LMP1或LMP2A,检测microRNA-146a,PI3K/AKT和CXCR4的表达水平。（5）在EBV阳性胃癌细胞系中分别敲减LMP1或LMP2A的表达,检测microRNA-146a,PI3K/AKT和CXCR4表达水平的变化。（6）通过转染microRNA-146a的模拟物和抑制物,提取不同作用条件处理的蛋白,检测CXCR4蛋白表达的变化。（7）PI3K抑制剂LY294002处理细胞,检测CXCR4蛋白表达的变化。（8）采用小干扰RNA靶向沉默CXCR4表达,Western blot检测细胞自噬蛋白LC3B表达的变化,透射电镜和荧光共聚焦显微镜检测自噬小体的形成。（9）流式细胞分析检测靶向沉默CXCR4和自噬激活剂作用对细胞表型的影响。（10）采用小干扰RNA靶向沉默CXCR4表达和自噬激活剂诱导细胞自噬,检测EBV即刻早期基因BZLF1的表达。结果:（1）EBV阳性胃癌细胞系（GT38和GT39）中CXCR4 mRNA和蛋白水平均低于EBV阴性胃癌细胞系（BGC823和SGC7901）（P<0.05）;AGS-EBV细胞系中CXCR4 mRNA转录和蛋白表达水平则明显高于AGS细胞系（P<0.05）;EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中CXCL12和CXCR7 mRNA转录水平无明显差异;EBVaGC组织中CXCR4表达率较高（与AGS-EBV细胞系的潜伏类型一致）。（2）EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中CXCR4基因启动子和第一外显子均呈现低甲基化状态。（3）EBV阳性胃癌细胞系（GT38和GT39）microRNA-146a的表达水平高于EBV阴性胃癌细胞系（BGC823,SGC7901,AGS）。（4）转染LMP1重组表达质粒可上调EBV阴性胃癌细胞系microRNA-146a的表达,同时下调CXCR4的表达;且干扰EBV阳性胃癌细胞系LMP1表达后可表现出相反的调控模式。（5）microRNA-146a可通过结合CXCR4的3’-UTR区,随着模拟物转染浓度的增加,CXCR4表达水平依次下降,且作用48h的抑制效果明显强于24h（P<0.05）。（6）转染LMP2A重组表达质粒可诱导AKT发生磷酸化,并上调CXCR4的表达;且敲减LMP2A后可表现出相反的调控模式。（7）以不同浓度的PI3K抑制剂LY294002处理AGS-EBV细胞,发现PI3K/AKT通路可以剂量依赖的方式诱导CXCR4的表达。（8）干扰CXCR4蛋白表达,可降低LC3B蛋白表达,同时抑制自噬小体的形成。（9）CXCR4可诱导细胞发生自噬,增加细胞进入G2/M期,促进细胞增殖,同时减少细胞发生凋亡的数量。（10）CXCR4可抑制BZLF1mRNA和蛋白的表达,参与EBV持续性潜伏感染的过程,但细胞自噬并不介导CXCR4-BZLF1-EBV潜伏感染的调控过程。结论:（1）LMP1可通过上调microRNA-146a的表达,抑制靶基因CXCR4的表达。（2）LMP2A可通过PI3K/AKT通路上调CXCR4的表达。（3）LMP1和LMP2A可在不同阶段调控CXCR4的表达,参与EBVaGC的发生和发展过程。
孙乐[3]（2020）在《LMP1在鼻咽癌的增殖、转移及放疗敏感性中的机制研究》文中认为前言:鼻咽癌（NPC）是一种来源于鼻咽上皮的恶性肿瘤,按其发病率排在常见癌症的第24位,70%的鼻咽癌新发病例均出现在东亚和东南亚地区,尤其是我国南方,如中国广东、广西、湖南、福建、江西、香港地区为鼻咽癌的高发区,男性的发病率一般是高于女性的2-3倍,40-50岁为高发的年龄段。由于患者鼻咽部的恶性肿瘤位置较隐匿,导致其早期临床症状不典型,约70%的患者在被确诊时己是Ⅲ期或Ⅳ期。此外,鼻咽癌大部分患者属于低分化或未完全分化的鳞状上皮细胞癌,恶性程度较高,容易在鼻咽部以外出现远处肿瘤转移。NCCN指南推荐同步放化疗和辅助放化疗或诱导化疗后同步放化疗作为治疗手段。据统计几乎98%的NPC与EBV密切相关,其中EBV的潜伏膜蛋白1（LMP1）在控制和促进鼻咽癌的发生、发展的细胞分化过程中己经被证实起到了重要的作用。它能通过鼻咽癌细胞内多种信号直接传导细胞通路,如TRAFs&NF-κB、PI3K-A kt/PK B、MAPK、转运蛋白PRA1等,调节和控制鼻咽癌细胞的正常增殖、生长、迁移、分化、免疫与细胞凋亡,从而控制癌变细胞的发生和发展。对于LMP1的鼻咽癌最新的研究结果表明,miR-155在体外能够促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭,但对于鼻咽癌细胞放疗的影响尚不清楚;而高迁移率族蛋白B1（HMGB1）最近被发现在人鼻咽癌组织中过表达,而且其表达的高低与患者的总生存期和无病生存期有关,且关于促进HMGB1的机制以及促进的HMGB1在NPC中的作用却知之甚少;此外,循环肿瘤细胞（CTC）及EBVDNA和RNA作为鼻咽癌的一个有前途的生物标志物也不断的被重视起来,但这几种标志物与鼻咽癌的转移关系还没有研究。目的:为了进一步深入探讨EBV LMP1及其相关因子miR-155、HMGB1在鼻咽癌发生、发展的分子机制,分析EBV的DNA和RNA、CTC在鼻咽癌转移诊断中的作用,寻找基因治疗和判断鼻咽癌预后的分子靶标。我们首先设计和构建了 LMP1真核表达载体转染的鼻咽癌稳定细胞系,并评估LMP1对鼻咽癌细胞增殖、迁移的影响。通过检测LMP1转染的鼻咽癌细胞中miR-155的表达及miR-55基因抑制对鼻咽癌细胞放疗的敏感性,评估miR-155对鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭和体外放疗的影响,探讨miR-155与LMP1的相关性。通过检测人鼻咽癌标本及EBV感染的鼻咽癌细胞中HMGB1,评估LMP1对HMGB1的促进作用及HMGB1在体外对鼻咽癌细胞增殖的调控作用。检测鼻咽癌患者血浆中的EBV DNA和RNA（LMP1、LMP2、BART和EBER1）水平,评估患者外周血液循环CTC细胞中EBVDNA、RNA与CTC和肿瘤转移之间的关系。方法:（1）构建重组LMP1表达载体,并对CNE-2细胞进行转染,之后以实时定量PCR法、蛋白印迹观察转染率及LMP1转录和蛋白表达水平的变化;对pEGFP-LMP1转染CNE-2鼻咽癌细胞进行克隆,CCK8检测细胞活性,采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力;细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力;蛋白印迹法对HMGB1和P65蛋白进行表达定量分析;之后采用qPCR测定LMP1过表达的CNE-2细胞中miR-155的转录水平;用miR-155 mimic转染CNE-2和HONE1细胞,并进行细胞侵袭实验判断miR-155对于鼻咽癌侵袭的影响;使用RNeasy Mini试剂盒从CNE-2细胞中分离并提取细胞总mRNA,使用mirVanaTMmiRNA分离试剂盒提取CNE-2细胞中的miRNA;CCK8检测miR-155模拟转染CNE-2细胞后的增殖情况,及使用miR-155抑制剂后的细胞增殖情况;测定miR-155抑制后的正常CNE-2细胞或CNE-2（LMP1）细胞在放疗下的存活率。（2）遵循知情原则,对84例鼻咽癌患者进行活检,血清学检查52例为EBV阳性,32例为EBV阴性,并记录了这些患者放疗或化疗前完整的临床资料。检测这些标本的HMGB1表达以及其与LMP1 DNA水平的关系。之后评估感染EBV的CNE-2细胞从细胞核向细胞质的转移和释放HMGB1的情况,测定HMGB1对CNE-2细胞的增殖影响,以及RAGE特异性siRNA转染对HMGB1在CNE-2细胞增殖中的作用。（3）遵循知情原则,收集250名鼻咽癌患者资料,其中伴有转移者136例,不伴有转移者114例,治疗前取外周静脉血,进行CTC计数,并采用实时定量PCR方法检测血浆LMP1、LMP2、BART和EBER1水平,评估DNA/RNA和肿瘤转移之间的关系。结果:（1）pEGFP-LMP1质粒转染CNE-2细胞后14天时,重组载体转染的LMP1蛋白表达明显高于对照组,pEGFP-LMP1真核载体构建成功;CCK8检测显示LMP1过表达的CNE-2细胞的增殖活性比对照组高,具有统计学差异;细胞划痕实验中,LMP1过表达的CNE-2细胞在12h、24h时间点均大于对照组,有统计学差异,P<0.01;细胞侵袭实验中,LMP1过表达的CNE-2细胞穿过胶膜的细胞数在12h、24h明显多于对照组,有统计学差异,P<0.01;LMP1过表达CNE-2细胞组HMGB1和P65蛋白表达均高于对照组,单因素方差分析均有统计学差异,分别为P=0.0058;P=0.02;比较miR-155在CNE-2与HONE1之间的转录水平,发现并无明显的统计学差异,P>0.05,但在LMP1过表达CNE-2细胞中miR-155的转录水平是CNE-2的4.5倍,P<0.001。采用miR-155 mimic转染CNE-2和HONE1细胞,miR-155转录水平分别增加11.22和11.63倍。细胞侵袭实验中,miR-155 mimic转染CNE-2和HONE1细胞,24h后染色计数穿越基质膜的细胞数明显高于转染对照组的细胞越膜数量,统计学有显着差异,P<0.001。通过CCK-8检测,miR-155模拟转染可显着促进CNE-2细胞增殖,P<0.05。与miR-Con细胞相比,转染miR-155抑制剂显着降低了 CNE-2细胞中miR-155的水平P<0.05;P<0.01,细胞增殖也显着下降,P<0.05。在0或4.0Gy辐射处理后,转染miR-155抑制剂后,CNE-2（LMP1）细胞与转染miR-Con的细胞相比,形成的菌落更少,P<0.01。在转染了miR-155抑制剂的CNE-2（LMP1）)细胞中比在转染了 miR-Con细胞中更显着,P<0.01。无论是否暴露于4.0Gy辐射,miR-155敲低对CNE-2（Con）细胞的集落数量减少不显着,P>0.05。（2）EBV阳性组的HMGB1蛋白水平也显着高于EBV阴性组（P<0.001）。HMGB1 mRNA水平与52个EBV阳性人样本中LMP1 DNA水平显着相关,R2=0.5640,P<0.0001。感染EBV的CNE-2细胞的上清液中的HMGB1在感染后12小时至48小时内也有显着的升高（P<0.05、P<0.01或P<0.001）,大于0.5 mg/mL HMGB1的处理促进CNE-2细胞增殖（0.5、1、3 mg/mL HMGB1的P<0.05或P<0.01）,且有剂量依赖性（P<0.05）。这种促进细胞增殖的作用也具有时间依赖性（治疗后36或48小时,P<0.05或P<0.01）。在60 nM转染siRNA-RAGE后,HMGB1促进CNE-2细胞的增殖被显着抑制（36 或 48 h 后,P<0.05 或P<0.01）。（3）转移组的平均CTC数值为显着高于非转移组,P<0.0001。转移性鼻咽癌患者血浆EBV DNA和RNA水平明显高于非转移性鼻咽癌患者。CTC、LMP1 DNA、BART或EBER1相对水平与肿瘤分期和结节分期均有显着相关性（R2>0.25,无论是肿瘤期还是淋巴结期,四种生物标志物）。结论:（1）pEGFP-LMP1的重组质粒能够有效地转染CNE-2细胞,并在CNE-2细胞中稳定表达。EBV LMP1在鼻咽癌发生、发展中起重要作用,其促进鼻咽癌增殖、侵袭和迁徙可能通过激活HMGB1/NF-kb信号途径完成。miR-155与EBV阳性鼻咽癌相关,其上调与LMP1相关,而miR-155在在体外可以促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制miR-155可以使得鼻咽癌细胞对放疗更加敏感。（2）在体内或体外鼻咽癌组织中HMGB1均显着增高,HMGB1与鼻咽癌的恶性状态相关,EBV感染导致的LMP1高表达通过HMGB1/RAGE信号促进在鼻咽癌细胞体外增殖。（3）转移的鼻咽癌患者血中CTC、EBVDNA和RNA水平均明显升高。LMP1 DNA和EBER1 RNA与鼻咽癌转移具有相关性。
郑小辉[4]（2020）在《鼻咽部EB病毒核酸标志物检测在鼻咽癌分子诊断中的应用研究》文中研究指明目的:鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma,NPC）是一种高侵袭性、高转移性的恶性肿瘤,在中国南方和东南亚地区广泛流行。临床上鼻咽癌的早诊早治成为提高患者生存率、改善预后的关键突破口。寻找和建立简单可靠的生物学标志物应用于高发区鼻咽癌的早期诊断和筛查是亟待解决的重要问题。已有充分的研究表明,EB病毒（Epstein-barr virus,EBV）感染在鼻咽癌的发病中扮演着非常重要的角色,鼻咽刷取样结合EB病毒核酸标志物检测可能会为高发区鼻咽癌的诊断和筛查提供新的研究思路。我们开展该项研究的目的主要有:（1）探讨鼻咽刷取样结合EBV DNA检测对中国华南区高发的鼻咽癌是否具有较好的诊断应用价值。（2）明确鼻咽刷样本中EBV的产生来源,以确定是否是肿瘤细胞来源反应鼻咽癌的发生,为鼻咽部EB病毒核酸标志物的发掘和利用提供清晰的理论基础。（3）发掘适用于辅助鼻咽癌诊断的核酸标志物,尤其适用于在高发现场不依赖临床医生和医疗设备的盲刷取样条件下的标志物,以利于在高发现场人群筛查中的应用。方法:本项研究以鼻咽癌作为研究疾病模型,通过与地处中国华南地区鼻咽癌高发区的中山大学肿瘤防治中心人员合作开展进行,便于充分利用当地丰富的病例资源。（1）首先招募了129例的鼻咽癌患者,116例的对照受试者,58例接受治疗后的复查患者（训练集人群）,对每例受试者通过已建立的鼻咽刷取样体系刷取鼻咽部样本,对鼻咽刷样本中EBV DNA load进行q-PCR检测,对配对血液样本中的EBV VCA-IgA抗体滴度和EBV DNA load分别进行免疫酶法和q-PCR定量检测,评估鼻咽刷EBV DNA load的诊断价值。（2）进一步对上述训练集人群刷取的鼻咽刷样本,同时提取了样本中的总DNA和RNA,对获得鼻咽刷样本中的EBV DNA进行了比较PCR实验,即同时检测EBV基因组中EBNA1基因的99bp和213bp的片段,以判断DNA是否是凋亡裂解的DNA片段;对获得的RNA中EBV转录的六个潜伏期基因（包括EBER1,BART,LMP1,LMP2A,EBNA1和EBNA2）,五个裂解期基因（包括立早期ZEBRA和RTA,早期基因PK和TK以及晚期基因VCA-p18）以及转录的四个Bart miRNAs（mir-bart1-5p,mir-bart5,mir-bart16,mir-bart17-5p）的转录表达进行了q-PCR检测,与EBV DNA load进行了相关性分析,并与49例活检组织（包括36例鼻咽癌和13例黏膜炎症）中这11个EBV mRNA和4个miRNA的表达进行了比较研究;对鼻咽刷样本中EBV DNA C-promoter区甲基化状态,包括甲基化程度（methylated degree）和甲基化类型（methylated type）进行了甲基化特异的PCR检测,通过这些实验的开展明确EBV的产生来源,以确定鼻咽刷EBV是否是鼻咽癌来源。（3）最后通过受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）曲线,相关性分析等分析方法确定截断值（Cut off value,COV）,评价了训练集样本中检测的EBV miRNA,EBV methylated degree,EBV methylated type等多个其它核酸标志物单个及联合应用于鼻咽癌诊断的诊断准确性,并在另一包含424例样本的独立验证集人群（215例鼻咽癌患者和209例非鼻咽癌受试者）中进行验证。此外,又对38例鼻咽癌患者和48例对照受试者平行进行了不依赖内镜引导的取样,获得了配对的盲刷条件下的鼻咽刷样本,评价了这些核酸标志物在盲刷下应用于诊断的价值。结果:（1）对鼻咽刷样本中EBV DNA load的检测显示在鼻咽癌组,所有的鼻咽刷样本中都显示阳性结果并且EBV DNA load显着升高（平均值为46360 copies/ng DNA,表达范围为40–1395000 copies/ng DNA）。在非鼻咽癌的对照组和现场人群对照组,EBV DNA load阳性率和拷贝数值分别为70.6%（平均值28 copies/ng DNA,表达范围0158 copies/ng DNA）和87.8%（平均值50 copies/ng DNA,表达范围0469copies/ng DNA）,治疗之后,阳性率为63.8%（平均值27 copies/ng DNA,表达范围0417 copies/ng DNA）。通过ROC曲线确定截断值,鼻咽刷样本中EBV DNA load的检测应用于鼻咽癌诊断的敏感度和特异性分别达到了96%和97%,平行试验显示诊断效果优于EB病毒血清VCA-IgA抗体（敏感度89%,特异度77%）和血浆EBV DNA load（敏感度为76%,特异度为87%）的检测。与11例病人（约为8.5%）需要多次活检不同的是,这11例病例在接受首次刷检时,EBV DNA load都高于设定的截断值,有效弥补传统指标的不足。（2）对EBV DNA进行比较PCR的结果显示,104例鼻咽癌患者鼻咽刷样本中,只在12例样本中检测到EBNA1基因99bp短片段数量的显着增多,提示只有少量样本中有明显的EBV DNA的降解;对EBV六个潜伏期和五个裂解期基因的转录检测结果显示在鼻咽癌鼻咽刷样本中EBV RNA转录是典型的II型EBV潜伏感染,即高表达EBER1,BART,LMP1,LMP2A和EBNA1基因,而不表达EBNA2,同时也检测到一定频率（从31.4%到93%）的裂解期基因的表达,这与鼻咽活检组织表达情况类似,提示鼻咽刷样本标志物能反应鼻咽部鼻咽癌的生长情况。在对照组鼻咽刷样本中,主要在49.3%的样本中检测到少量的EBER1基因的表达,但同时也在0%到15.5%的样本中检测到少量的几个裂解期基因的表达。相关性分析显示无论是在鼻咽癌组还是对照组,潜伏期和裂解期基因的表达频率都与EBV DNA load具有显着的相关性,但EBV DNA load与EBV转录产物EBER1表达的相关性只在鼻咽癌患者中观察到,而在对照组两者不存在显着相关。对EBV miRNAs的检测也得到了相似的结果。EBV DNA C-promoter区甲基化检测结果显示在鼻咽癌组,鼻咽刷样本中EBV DNA C-promoter区主要是以methylated type为主,methylated degree较高,而在对照组鼻咽刷样本中则以non-methylated type为主,methylated degree较低,结果提示鼻咽癌患者鼻咽刷样本中EBV DNA load主要来自感染EBV的肿瘤细胞贡献,而在对照组鼻咽刷样本中主要来自游离EBV的贡献。（3）基于EBV DNA load,EBV DNA methylated degree,EBV DNA methylated type和EBV miRNA在鼻咽癌和对照组中表达的显着不同,进一步分析显示EBV mir-bart1-5p（敏感度93.94%,特异度100%）,EBV DNA methylated degree（敏感度95.2%,特异度94.7%）和EBV DNA methylated type（敏感度100%,特异度81.6%）应用于鼻咽癌的诊断均具有较高的准确性。EBV mir-bart-1-5p的诊断价值在另一包含424例样本的独立人群中得到了验证,对于鼻咽癌诊断的敏感度为93.5%,特异度为100%。基于EBV DNA methylated type在鼻咽癌和对照组的性质不同,即在鼻咽癌患者中,EBV DNA C-promoter区域主要呈现甲基化的状态,即启动子区发生甲基化EBV DNA的数量（定义为A类EBV DNA）多于非甲基化DNA的数量（定义为B类EBV DNA）,即A/B>1。而在对照组中,EBV DNA C-promoter区主要呈现非甲基化的状态,即发生甲基化EBV DNA的数量（A类EBV DNA）少于非甲基化DNA的数量（B类EBV DNA）,即A/B<1。这为鼻咽刷刷检发展到不依赖于临床的盲刷取样提供了可能,我们的结果显示在盲刷的取样条件下,由于取样部位失去了电子鼻咽镜的引导,取样的精度降低,这导致鼻咽刷样本中的EBV DNA load（敏感度由95.2%下降到55.3%）和EBV DNA methylated degree（敏感度由95.2%下降到57.9%）等定量指标的诊断敏感度会有很大程度的降低,但获取的总EBV DNA中A/B是大于或小于1的特性是基本不变的（敏感度由100%变为89.5%）。结论:鼻咽部EB病毒核酸标志物,包括EBV DNA load,EBV miRNA,EBV methylated degree,EBV methylated type作为高效的分子标志物,应用于鼻咽癌诊断具有较好准确性;通过对鼻咽刷样本中EBV多个潜伏和裂解期基因转录表达谱的研究,以及对EBV miRNA和EBV DNA C-promoter区甲基化的研究,间接和直接两方面充分表明鼻咽癌患者鼻咽刷样本中的EBV DNA主要来自潜伏感染EBV的肿瘤细胞,反应了鼻咽部鼻咽癌的生长情况,而对照组鼻咽刷样本中的EBV DNA主要来自裂解释放的游离EBV颗粒;基于鼻咽刷样本中EBV DNA在病例组和对照组产生途径的不同及所引起的EBV DNA C-promoter区甲基化性质的不同,我们提出检测methylated type这一适用于盲刷取样的定性标志物,突破了鼻咽刷刷检在现场广泛开展应用的瓶颈。通过开展的这三方面的研究,为中国鼻咽癌高发区的鼻咽癌诊断和筛查提供了新思路,对于完善鼻咽癌的病因理论具有重要价值。
杨爱华[5]（2019）在《胃癌患者EB病毒抗体和内皮素ET-1抗体检测及临床意义》文中提出目的:检测EB病毒相关胃癌（EBV associated gastric carcinoma,EBVaGC）患者血清中EB病毒相关抗体、内皮素-1（endothelin 1,ET-1）及其受体ETAR、ETBR水平,探讨其在EBVaGC早期辅助诊断中的意义,分析两者间的相互关系。方法:应用原位杂交技术确认EBVaGC患者31例,同时选取临床病理资料与之匹配的EBV阴性胃癌（EBV nagtive gastric carcinoma,EBVnGC）患者40例作为对照,应用化学发光法检测EB病毒相关抗体水平,ELISA法检测内皮素-1（ET-1）及其受体ETAR和ETBR,采用阳性率、灵敏度、特异度、阳性似然比、阳性预测值等参数来评估这些指标在EBVaGC早期诊断中的价值。结果:（1）EBVaGC与EBVnGC两组患者EBV EA IgG、EBV VCA IgA阳性率比较（χ2=31.97,7.99,P<0.05）,差异显着,具有统计学意义;EBV EA IgA、EBV VCA IgM、EBV VCA IgG、EBV NA IgG阳性率比较（χ2=0.11～0.88,P>0.05）,无显着性差异。（2）EBV EA IgG、EBV VCA Ig A阳性似然比、阳性预测值均大于其他4项抗体（χ2=5.19～20.18,P<0.05）;EBV VCA Ig G和EBV NA IgG灵敏度虽高,但是特异度较低,EBV EA IgA特异度虽高,但是灵敏度却偏低。EBV EA IgG、EBV VCA IgA抗体检测较其他相关抗体兼具较高的灵敏度、特异度（χ2=11.65～29.62,P<0.05）。（3）EBVaGC组EBV抗体阳性模式多样化。（4）EBVaGC组ET-1、ETAR和ETBR血清水平均明显低于EBVn GC组,具显着性差异（P<0.05）。（5）EBVaGC与EBVnGC患者VCA IgM与ET-1,ETAR和ETBR之间呈正相关（r=0.323,0.290,0.325,P<0.05）。根据结果判断标准,EBVaGC患者EBV DNA阳性率明显高于EBVnGC患者（P<0.01）,且EBV DNA拷贝数与ET-1/ETAR/ETBR含量呈负性关系。结论:（1）EA IgG和VCA IgA抗体效价升高有助于EBVaGC的早期辅助诊断。（2）EBVaGC组EBV抗体阳性模式多样化,单一抗体检测的价值有限,多抗体联合检测较单一抗体检测更能提高EBVaGC诊断的准确性。（3）EBVaGC患者组ET-1、ETAR和ETBR血清水平均明显低于EBVn GC组,VCA-IgM抗体水平与ET-1、ETAR和ETBR抗体水平呈正相关,提示EBV感染早期即可促进ET-1及受体相关抗体的产生。（4）有助于我们了解EBVaGC独特的发生机制,并筛选其新的分子标志物。
闫春[6]（2019）在《EB病毒相关肿瘤基因多态性与易感性的相关性研究》文中研究说明目的:探讨胃癌细胞系AGS转染EBV基因组前后多态性位点的改变。分析肌动蛋白超家族蛋白 21 B（Kinesin superfamily protein 21B,KIF21B）rs2297911 位点、成虫大盘基因类似物5（Discs large homolog 5,DLG5）rs1058198位点、小核RNA激活蛋白质复合体（small nuclear RNA-activating protein complex,SNAPc）rs3812561 位点以及微管相关蛋白 9（microtubule-associated protein 9,MAP9）rs1058992 位点多态性与 EB 病毒（Epstein-Barrvirus,EBV）相关肿瘤易感性的相关性,包括EBV相关/阴性胃癌（EBV-associated/-negative gastric cancer,EBVa/nGC）,EBV相关/阴性鼻咽癌（EBV-associated/-negative nasopharyngeal carcinoma,EBVa/nNPC）和 EBV 相关/阴性淋巴瘤（EBV-associated/-negative lymphoma,EBVa/nL）。方法:①采用高通量测序技术检测胃癌细胞系AGS转染EBV前后宿主细胞基因多态性位点的变化。②将AGS与AGS-EBV细胞系差异多态性位点所在基因通过FunRich这一开放访问的网络工具进行分类。③选取KIF21B（rs2297911）,DLG5（rs1058198）,SNAPC4（rs3812561）和 MAP 9（rs1058992）4 个位点,利用 Agena MassArray 系统基因分型。④基因分型数据均采用卡方检验,非条件Logistic回归计算比值比（odds ratio,OR）,P≤0.05为差异有统计学意义。所有统计分析均采用SPSS 21.0软件进行。结果:①在 AGS 和 AGS-EBV细胞,SNP（single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性）位点在基因中的分布位置以非编码区为主,外显子编码区、3’UTR、基因间区、5’UTR、基因下游区域、基因上游区域和基因剪切位点SNP分布数目依次减少。对比两组细胞系SNP位点,筛选出AGS-EBV克隆样本中均与AGS细胞系中存在基因型别差异的SNP位点。差异SNP位点分布比例与总体比例大体一致,以非编码区SNP位点为主,无基因剪切位点SNP位点。②通过高通量测序共检测到928个差异SNP位点,上述SNP所在基因共涉及178个细胞组分,共参与37个生物学过程,所在基因共包含有253种蛋白结构域,共涉及773个生物学通路。③KIF21B（rs2297911）,DLG5（rs1058198）,SNAPC4（rs3812561）,MAP9（rs1058992）检测均符合 HWE 平衡（rs2297911:χ2=1.225,P>0.05;rs3812561:χ2=1.457,P>0.05;rs1058198:χ2=0.116,P>0.05;rs1058992:χ2=0.085,P>0.05）,表明所选对照样本来自于遗传平衡的群体。④EBVaL与对照组比较,KIF21B基因rs2297911位点基因型分布及等位基因分布差异显着（P均<0.05）。G等位基因是EBVaL的危险因素（P=0.009,OR=1.872,95%CI:1.169～2.998）;EBVaNPC 与 EBVaL 相比,KIF21B（rs2297911）基因型分布及等位基因频率不同（P均<0.05）,在G的隐性模型中,EBVaL的GG基因型频率高于EBVaNPC和EBVnNPC（P=0.013,OR=2.125,95%CI:1.169～3.864;P=0.047,OR=4.444,95%CI:1.101～17.939）。EBVaL与NPC（包括EBVaNPC和EBVnNPC）之间的G等位基因也存在显着差异（P=0.005,OR=1.961,95%CI:1.215～3.163;P=0.009,OR=3.241,95%CI:1.297～8.097）;其余各组两两比较,基因型分布及等位基因频率均无明显差异（P>0.05）。⑤EBVaGC与EBVnGC组比较,MAP9基因rs1058992位点基因型分布（P<0.05）及等位基因频率（P<0.05,OR=1.904,95%CI=1.141～3.179）比较差异均有显着性。C隐性模型中,EBVaGC与EBVnGC组比较具有明显差异（P=0.006,OR=2.558,95%CI=1.316～5.010）。EBVnGC与正常对照组C等位基因频率比较差异有显着性（P<0.05,OR=1.724,95%CI=1.036～2.870）;其余各组两两比较,基因型分布及等位基因频率均无明显差异（P>0.05）。⑥SNAPC4基因rs3812561位点和DLG5基因rs1058198位点在患者和正常对照组中,基因型及等位基因均无统计学差异（P均>0.05）。结论:①EBV感染可导致AGS细胞基因出现大量SNPs,提示其感染参与宿主细胞基因结构发生改变的过程。②KIF21B（rs2297911）G等位基因在隐性模型与显性模型中均为EBVaL易感危险因素。③EBVaGC与EBVnGC组比较,MAP9（rs1058992）位点基因型分布及等位基因频率比较差异均有显着性,CC基因型及C等位基因是EBVaGC的危险因素;EBVaGC组较正常对照组C等位基因频率明显增加,C等位基因为EBVaGC危险因素。④SNAPC4基因rs3812561位点和DLG5基因rs1058198位点多态性与EBV相关肿瘤易感性无明显相关性。
王海语[7]（2019）在《白血病和骨髓增生异常综合征患者EB病毒编码基因变异亚型分析》文中研究表明目的和背景:EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）是重要的DNA肿瘤病毒,与鼻咽癌、胃癌和淋巴瘤等多种肿瘤的发生发展密切相关。近年来,有学者对EBV感染与白血病的关系进行了研究,结果显示EBV独特的表达模式是B细胞特殊分化窗口的标志,可导致慢性白血病;也有研究发现EBV感染与急性白血病的发生相关。然而,关于EBV在血液肿瘤中的潜在作用目前仍不清楚。我们以往曾对山东地区鼻咽癌、胃癌、淋巴瘤以及健康人群中多个EBV编码基因的多态性进行了研究,但尚不清楚EBV编码基因在恶性血液病中的变异情况及其生物学意义。本研究检测了白血病和骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS）病人中EBV 1/2分型、F/f分型、EBV编码小RNA（EBV-encoded small RNAs,EBERs）基因和膜潜伏蛋白1（latent membrane protein 1,LMP1）基因多态性,探讨其与血液肿瘤的关系。方法:选取青岛地区白血病病人313例和骨髓增生异常综合征（MDS）病人99例作为研究对象,取病人外周血标本4 m L,乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）抗凝,1200 r/min离心10 min,吸取中间白细胞层,采用蛋白酶K消化法和酚氯仿法提取细胞DNA。采用巢式聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术分析EBV 1/2分型,采用PCR结合限制性片段长度多态性（PCR-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP）分析可区分F/f变异,PCR结合DNA测序检测分析EBERs基因和LMP1基因多态性。应用DNAStar软件对EBER和LMP1基因核苷酸及编码氨基酸序列进行对比分析,与EBV标准株B95-8序列比较,根据其特征性改变对变异进行分类。结果:（1）白血病、MDS患者和健康人群1型EBV的检出率分别为73.8%（59/80）、88.2%（30/34）和78.9%（45/57）;2型EBV检出率分别为8.7%（7/80）、8.8%（3/34）和17.6%（10/57）,1+2型EBV检出率分别为17.5%（14/80）、3%（1/34）和3.5%（2/57）;（2）F型EBV在白血病、MDS患者和健康人群中的检出率分别为98.8%（82/83）、93.3%（28/30）和94.2%（98/104）,f型EBV在白血病、MDS患者和健康人群中的检出率分别为1.2%（1/83）、6.7%（2/30）和5.8%（6/104）;白血病、MDS患者和健康人群中1/2分型、F/f分型的分布比较显示差异无统计学意义（P>0.05）;（3）白血病、MDS和健康人群中EBERs的主要基因型为EB-6m型,其检出率分别为73.2%（30/41）、83.3%（10/12）和96.7%（89/92）,白血病、MDS与同一地区健康人群之间EBERs基因变异类型的分布不同,差异有统计学意义（P<0.05）;（4）白血病、MDS和健康人群中LMP1的主要亚型为China 1、XhoⅠ（-）和del-LMP1;（5）China 1亚型在白血病、MDS和健康人群中的检出率分别为70%（28/40）、90%（9/10）和69.8%（30/43）,白血病、MDS与健康人群之间LMP1基因变异类型的分布亦无显着性差异（P>0.05）;XhoⅠ（-）变异在白血病、MDS和健康人群中的检出率分别为75%（30/40）、90%（9/10）和74.4%（32/43）,差异无显着性（P>0.05）;del-LMP1变异在白血病、MDS和健康人群中的检出率分别为77.5%（31/40）、90%（9/10）和69.8%（30/43）,差异无显着性（P>0.05）。结论:（1）青岛地区白血病和MDS的EBV基因型以1型和F型为主;（2）EBERs基因EB-6m亚型是白血病和MDS患者中最常见的类型;（3）白血病和MDS中LMP1的主要亚型为China 1、XhoⅠ（-）和del-LMP1,3种变异型在白血病、MDS和以往健康人群中的分布无显着性差异,提示携带3种变异型EBV毒株可能与白血病和MDS的发生无关。
张岩[8]（2019）在《EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究》文中认为EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）属γ疱疹病毒亚科,全球成人的感染率高达90%以上,能够在宿主细胞内长期潜伏,与多种人类肿瘤的发生有关,是公认的DNA肿瘤病毒。EBV相关肿瘤中几乎所有的肿瘤细胞均可检测到EBV基因组的存在,EBV在宿主细胞中建立的潜伏感染是其重要的致癌基础,EBV通过其潜伏期基因产物影响受感染细胞的基因表达及生物学行为参与相关肿瘤的发生发展。EBV相关胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC）是胃癌的一种独特亚型,是发病人数最高的EBV相关肿瘤,与EBV阴性胃癌（EBV-negative gastric carcinoma,EBVnGC）相比具有独特的临床病理特征,但其发病机制尚未完全明了。EBV编码的潜伏基因产物可参与多种细胞信号通路的传导,如NF-κB、JNK、STAT3和PI3K/AKT等,通过一系列级联反应参与宿主细胞基因和病毒基因的表达调控,诱导细胞转化、促进细胞增殖、抑制细胞的分化和凋亡,从而导致EBV相关肿瘤的发生。转录因子NF-κB是与细胞增殖、免疫反应、炎症反应和肿瘤密切相关的重要的调节因子,持续激活的NF-κB信号通路能够通过上调其下游分子的表达来诱导细胞增殖,抑制肿瘤细胞的凋亡。NF-κB信号通路在肿瘤发生发展中的重要作用在多种EBV相关肿瘤中已被阐述,但其在EBVaGC中的具体作用机制还不明确。目的:1通过检测胃癌细胞系及胃癌组织中NF-κB经典信号通路相关分子的表达及亚细胞定位,明确EBVaGC和EBVnGC中NF-κB经典信号通路的激活情况。2探讨EBV通过潜伏感染激活NF-κB经典信号通路的具体机制。3检测分析NF-κB信号通路对EBV阳性胃癌细胞增殖和凋亡等细胞生物学行为,以及EBV潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A表达的影响。方法:1提取EBV阴性胃癌细胞系（SGC7901,BGC823,HGC27）、EBV阳性胃癌细胞系（GT38,GT39,SNU719）总RNA和总蛋白,采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）对NF-κB信号通路相关分子（NFKBIA、TRAF1/2/3/6）的转录表达进行检测;Western blot检测并分析其蛋白表达水平;免疫荧光技术检测胃癌细胞系中p65蛋白的亚细胞定位;ELISA技术检测细胞系中NF-κB转录因子与DNA结合能力,综合判断NF-κB信号通路在胃癌细胞系中的激活情况。2免疫组化技术检测EBVaGC和EBVnGC肿瘤组织中IκBα及p65蛋白表达及亚细胞定位。3采用不同浓度的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系SNU719及EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,24h后CCK-8检测细胞存活情况。4采用流式细胞技术及Annexin-FITC试剂盒分别检测浓度为2.5μM、5μM和10μM的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用12h后对EBV阳性胃癌细胞系GT38凋亡的影响。Western blot检测BAY11-7082、MG-132不同浓度及不同处理时间IκBα和磷酸化IκBα以及凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3）的表达。5采用2.5μM,5μM,10μM浓度的BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系GT38,12h后收集细胞提取总蛋白,Western blot检测转录因子ZEB1蛋白的表达变化情况。6采用BGS特异性引物对NFKBIA基因启动子区进行扩增,该区域含有83个CpG位点,随机选取扩增条带进行TA克隆,每个样本挑选6个克隆,根据所测6个TA克隆总CpG位点中发生甲基化的比例计算甲基化率。7 PCR结合DNA测序技术检测胃癌细胞系IκBα基因突变情况。8 miRBase和rna22网站预测EBV编码的miR-BART16含有IκBα3’UTR结合位点,将IκBα3’UTR靶定序列或其突变序列分别克隆至双荧光素酶报告基因质粒,连同相应的模拟物共转染HEK293T细胞检测其荧光素酶的表达。9构建分别携带EBV潜伏膜蛋白LMP1和LMP2A编码基因的重组表达质粒,分别转染EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照。收集转染2h、6h、24h、48h、72h的实验组细胞,并提取各组细胞总蛋白,Western blot检测相关蛋白表达的变化。设计并合成靶向LMP1编码基因的siRNA及对照序列（NC）,转染EBV阳性胃癌细胞系GT38,作用48h收集细胞,提取细胞总蛋白和总RNA,Western blot和qRT-PCR检测IκBα的表达变化。10分别转染LMP1和LMP2A重组质粒至EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照质粒,G418筛选实验及流式细胞仪分选后建立稳定表达LMP1和LMP2A的SGC7901细胞克隆以及载体对照细胞系,Western blot检测稳定表达外源性LMP1和LMP2A的细胞克隆NF-κB信号通路相关基因的表达。11设计并合成靶向TRAF1编码基因的siRNA转染EBV阳性胃癌细胞系GT39,检测下调TRAF1表达对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响。12采用qRT-PCR和免疫组织化学技术检测EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39及EBVaGC组织中miR-BART16与LMP1的相对表达水平。13在GT38和GT39细胞系中分别转染miR-BART16的模拟物、抑制物及对照序列,浓度分别为10nM,30nM和50nM,作用48 h收集细胞,提取各组细胞总RNA和总蛋白检测LMP1的表达。选取50nM浓度miR-BART16模拟物、抑制物及对照序列,分别转染GT38和GT39细胞,采用CCK-8检测转染24h,48h,72h的细胞增殖情况。14 miR-BART16模拟物与抑制物作用GT38、GT39细胞48 h,采用流式细胞技术检测对细胞凋亡的影响,同时采用PI及BrdU染色分析miR-BART16模拟物与抑制物作用后对细胞周期的影响。结果:1 EBV阳性胃癌细胞系NF-κB信号通路抑制因子NFKBIA的转录表达水平明显低于EBV阴性胃癌细胞系（P<0.005）,EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1、TRAF3、TRAF6转录水平均高于EBV阴性胃癌细胞系,TRAF2转录水平明显低于阴性胃癌细胞系;EBV阳性胃癌细胞系中IκBα蛋白表达均较EBV阴性胃癌细胞系明显降低;而两种细胞系中磷酸化IκBα蛋白的表达则无明显差异;p65及p-p65蛋白表达亦无明显差异。EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1蛋白表达明显高于EBV阴性胃癌细胞,而EBV阳性胃癌细胞系TRAF2、TRAF3和TRAF6蛋白的表达均低于EBV阴性胃癌细胞系。2 EBV阳性胃癌细胞系中p65蛋白的核内转位约占50%,而EBV阴性胃癌细胞系则较少检测到核内转位。EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719的p65-DNA结合能力均高于EBV阴性胃癌细胞系。3 EBVaGC组织中IκBαmRNA的转录表达水平明显低于EBVnGC组织及癌旁组织,EBVaGC组织中IκBα蛋白表达较EBVnGC组织弱,而发生p65核转位的肿瘤细胞多于EBVnGC组织。4 EBV阳性胃癌细胞系SNU719对NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用的敏感性明显强于EBV阴性胃癌细胞系SGC7901。5与DMSO对照组比较,2.5μM BAY11-7082处理组SNU719细胞凋亡率无明显变化（P>0.5）,5μM和10μM处理组的细胞凋亡率明显升高,最高达51.5%,差异有显着性（P<0.001）。MG-132及BAY11-7082信号通路抑制剂作用后均能对凋亡相关蛋白的表达产生不同程度的影响。6 2.5μM浓度BAY11-7082作用细胞后ZEB1蛋白表达无明显变化（P>0.5）,5μM和10μM浓度作用后,ZEB1蛋白表达明显下调（P<0.01）。7 EBV阳性胃癌细胞系中NFKBIA基因启动子区甲基化率:GT38为0.80%,GT39为0.80%,SNU719为0.4%,均呈低甲基化状态。8 EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719 NFKBIA基因第一外显子区均存在12bp的片段缺失（+615+626delCGCCCCCAGGAG）,造成4个氨基酸的丢失,而在EBV阴性胃癌细胞系未检测到该片段的缺失.9 EBV-miR-BART16不能直接影响带有h-NFKBIA-3’UTR的荧光素酶的表达,IκBα的表达不受miR-BART16的直接调控。10与载体对照组比较,转染LMP1重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,72h表达量是对照组的40%,磷酸化p-IκBα表达上调,在7h表达水平最高（2.15倍）;p65总蛋白的表达较对照组降低,而磷酸化p-p65表达随作用时间上调。TRAF1表达上调,72h可达2.01倍,而TRAF2/3/6表达下调。干扰LMP1,其mRNA表达是对照组的26%,而IκBα的mRNA转录表达未见明显改变（P>0.05）,LMP1蛋白水平表达下调,IκBα蛋白表达水平则出现上调现象。11与空白对照比较,转染LMP2A重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,48h下调最明显,表达量仅是对照组的29%,p-IκBα的表达上调,在72h达到最高（3.32倍）;p65总蛋白的表达较对照组降低,而p-p65表达随作用时间而上调。TRAF1表达上调,72h可达2.51倍,而TRAF2/3表达下调,TRAF6略有下调。12与空白对照比较,稳定转染LMP1/2A均能下调IκBα表达,表达量仅是对照组的67%和61%,p-IκBα的表达上调,为对照组的1.35倍和1.47倍,p65总蛋白和磷酸化蛋白的表达无明显差异,TRAF1分别上调2.15倍和1.46倍,而TRAF2/6表达下调,TRAF3表达无明显变化。13靶向TRAF1的siRNA作用EBV阳性胃癌细胞系GT39 48h和72h后,p65和IκBα总蛋白及磷酸化蛋白表达均未发生明显变化。14与GT38和GT39细胞系比较,EBVaGC组织中miRNA-BART16表达量明显高于2种EBV阳性胃癌细胞系,约为14-165倍。qRT-PCR及免疫组化技术在10例EBVaGC组织中均未检测到LMP1的表达。15与阴性对照组比较,GT38和GT39细胞系转染miR-BART16模拟物后,LMP1mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而降低;而转染miRNA-BART16抑制物以后,LMP1 mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而增加,呈明显的量效关系。16 miR-BART16转染GT38和GT39细胞48 h和72 h后,CCK-8检测显示其模拟物能够明显抑制细胞增殖（P<0.05）,而转染miR-BART16抑制物后,细胞增殖明显增强（P<0.05）。17在GT38和GT39细胞中转染miR-BART16模拟物及抑制物,细胞凋亡没有发生明显变化（P>0.05）;转染miR-BART16抑制物48h后,细胞周期阻滞在G2/M期,而转染模拟物后没有明显的变化。结论:1 EBV阳性胃癌的细胞系和EBVaGC组织均存在NF-κB经典信号通路的持续激活,LMP1和LMP2A的表达是该信号通路激活的重要原因。2 NF-κB信号通路的激活可促进上皮细胞间质转化相关分子及潜伏膜蛋白的表达,从而导致EBV阳性肿瘤细胞增殖,抑制其凋亡。3κBα基因第一外显子在EBV阳性胃癌细胞系存在一段12bp的缺失,造成4个氨基酸的丢失。4 EBVaGC中IκBα基因的低表达不受启动子区甲基化和miR-BART16的调控。5 miR-BART16能够在mRNA及蛋白水平下调LMP1的表达,抑制miR-BART16表达能够促进细胞增殖,诱导细胞G2/M期阻滞。
王嘉怡[9]（2019）在《EBV调控AQP3表达机制的研究》文中认为EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）属人疱疹病毒4型,感染超过95%的成年人。EBV感染与多种肿瘤的发生有关,但其致病机制尚不清楚。AQP3（Aquaporin 3）是一种水通道蛋白,其通过跨质膜的渗透梯度促进跨上皮水运输。有研究表明,AQP3在肿瘤进展和转移中起着关键作用,肿瘤细胞可能通过一系列信号传导机制（肿瘤细胞与细胞膜信号传导）促进细胞内AQP3的表达,为肿瘤侵袭与转移提供有利条件。EBV相关胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC）约占全部胃癌病例的10%,具有独特的病理和分子特征。EBVaGC中存在多种肿瘤相关基因启动子区域的整体和非随机DNA甲基化,导致肿瘤相关基因的表达抑制。病毒通过影响细胞的多种生物学途径来刺激肿瘤发生,其中细胞表观遗传机制是最具特征的途径之一,DNA甲基化参与多种肿瘤的发生过程。DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferases,DNMTs）是细胞基因组DNA甲基化的关键效应酶,DNMTs的失调可导致包括抑癌基因在内的肿瘤相关基因启动子异常甲基化,导致基因沉默,肿瘤病毒在调控DNMTs的过程中发挥重要作用。目的:探讨EBVaGC中EBV对AQP3基因表达的影响及调控机制,明确EBV影响AQP3基因甲基化的机制,为阐明EBVaGC的发生发展提供理论依据。材料与方法:（1）实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）检测EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39、SNU719以及EBV阴性胃癌（EBV-negative gastric carcinoma,EBVnGC）细胞系SGC7901、BGC823、HGC27中AQP3、甲基转移酶1（DNMT1）、甲基转移酶3a（DNMT3a）、甲基转移酶3b（DNMT3b）及相关基因的转录表达水平。（2）Western Blot检测EBV阳性胃癌和EBV阴性胃癌细胞系中AQP3、DNMTs及相关基因的蛋白表达水平;免疫组化检测EBVaGC和EBVnGC组织中AQP3蛋白的表达。（3）重亚硫酸氰盐测序（Bisulfite Genomic Sequence,BGS,BSP）检测AQP3基因启动子和第1外显子区的甲基化情况。（4）采用pcDNA3.1构建EBV编码小RNA（EBV-encoded small RNA,EBER）和EBV潜伏膜蛋白（Latent membrane protein,LMP）LMP1、LMP2A编码基因的表达载体,转染EBV阴性胃癌细胞系SGC7901后检测AQP3、DNMTs及相关基因表达的变化。（5）分别采用靶向ERK1和ERK2的小干扰RNA（Small Interfere RNA,siRNA）作用于稳定转染LMP2A后的SGC7901细胞系,检测干扰ERK1和ERK2后AQP3、DNMT3a及相关基因表达的变化。结果:（1）qRT-PCR检测结果显示,EBV阳性胃癌细胞系中AQP3基因转录水平明显低于EBVnGC细胞系（t=2.057,P<0.001）;DNMT3a相反,EBV阳性胃癌细胞系中DNMT3a基因转录水平高于EBV阴性胃癌细胞系（t=3.139,P=0.0146）;EBV阳性胃癌细胞系与EBV阴性胃癌细胞系比较,DNMT1基因转录水平没有显着差异（t=0.6179,P=0.5594）;两种细胞系中DNMT3b基因转录水平也无显着差异（t=0.8166,P=0.4453）。（2）Western Blot结果显示,EBV阴性胃癌细胞系中AQP3蛋白的表达明显高于EBV阳性胃癌细胞系（t=8.857,P<0.001）;而EBV阳性胃癌细胞系中DNMT3a蛋白的表达明显高于EBV阴性胃癌细胞系（t=10.20,P<0.001）;EBV阴性胃癌细胞系DNMT1蛋白表达明显高于EBV阳性细胞系（t=9.374,P<0.001）;两种细胞系中DNMT3b蛋白水平无显着性差异（t=0.1823,P=0.8576）。（3）胃癌组织中AQP3蛋白的表达与细胞系一致,免疫组化结果显示,EBVaGC组织中AQP3蛋白的表达明显低于EBVnGC。（4）3种EBV阳性胃癌细胞系中AQP3基因启动子和第1外显子区CpG岛呈高甲基化状态,甲基化率均高于70%;EBV阴性胃癌细胞系SGC7901与BGC823中甲基化率均小于3%,而EBV阴性胃癌细胞系HGC27中甲基化率为58%。（5）甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理EBV阳性细胞系GT39和SNU719,AQP3启动子和第1外显子区的甲基化率均降低至60%以下,DNMT3a蛋白表达受抑,AQP3基因在转录和蛋白水平表达恢复。（6）与转染对照质粒的EBV阴性胃癌细胞系SGC7901比较,转染EBV潜伏膜蛋白LMP2A的SGC7901细胞中DNMT3a表达升高,AQP3基因表达降低,p-ERK表达升高,ERK通路被激活;而在转染EBV潜伏膜蛋白LMP1或EBER的细胞系中,与转染对照质粒的细胞比较,DNMT3a、AQP3的表达没有明显变化。（7）在稳定转染EBV潜伏膜蛋白LMP2A的EBV阴性胃癌细胞系中分别采用siRNA靶向抑制ERK1或ERK2表达后,DNMT3a的表达下调,AQP3表达则上调。结论:EBVaGC中AQP3蛋白的表达抑制与AQP3基因启动子区和第1外显子区高甲基化相关,AQP3基因启动子区和第1外显子区的高甲基化可能由DNMT3a介导;EBV潜伏膜蛋白LMP2A可通过激活ERK通路上调DNMT3a的表达。
徐海芹[10]（2019）在《不同类型淋巴瘤组织中EB病毒的表达及EBNA1多态性研究》文中进行了进一步梳理目的检测100例淋巴瘤患者中潜伏膜蛋白1（LMP1）及EBV编码的小多聚腺苷酸RNA（EBER）的表达情况,筛选EBV阳性的淋巴瘤病例,为核抗原（EBNA1）基因羧基端测序做准备;同时观察LMP1与EBER的相关性及二者的表达与淋巴瘤类型的相关性,为淋巴瘤的诊断提供依据;对EBV阳性病例进行EBNA1羧基端测序分析,观察是否存在突变热点AA487及AA466-527之间的变异。方法采用免疫组化（Envision）二步法检测100例淋巴瘤组织标本中LMP1蛋白的表达情况;采用原位杂交的方法检测100例淋巴瘤组织标本中EBER的表达情况,筛选出EBV阳性病例;同时比较两种方法的敏感性;用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）方法对EBV阳性病例进行EBNA1基因羧基端的扩增,并将扩增产物送公司进行测序分析。同时分析淋巴瘤EBV表达与预后的相关性。结果（1）从LMP1及EBER的表达率看,不同类型淋巴瘤中,仅经典型霍奇金淋巴瘤（HL）及弥漫性大B细胞淋巴瘤表达LMP1。并且经典型霍奇金淋巴瘤LMP1阳性表达率（8/17,约47%）明显高于弥漫性大B细胞淋巴瘤中LMP1的表达率（1/56,1.79%）（χ2=20.718,P<0.05）,具有统计学意义。不同类型淋巴瘤中,仅NK/T细胞淋巴瘤、经典型霍奇金淋巴瘤（HL）及弥漫性大B细胞淋巴瘤表达EBER。其余类型淋巴瘤中非肿瘤细胞可散在表达EBER。NK/T细胞淋巴瘤EBER阳性表达率最高（8/9,约89%）,霍奇金淋巴瘤EBER阳性表达率次高（10/17,约59%）,二者均明显高于弥漫性大B细胞淋巴瘤中EBER的表达率（3/56,5.36%）（χ2=32.770,χ2=21.948;均P<0.05）,具有统计学意义。原位杂交的方法检测EBER在总淋巴瘤患者中的阳性表达率（21/100,21%）明显高于免疫组化方法检测LMP1在总淋巴瘤患者中的阳性表达率（9/100,9%）（χ2=5.647,P<0.05）,具有统计学意义。（2）从LMP1及EBER表达模式看,LMP1阳性表达位于细胞膜、细胞质及核旁体,EBER阳性信号则定位于细胞核内。LMP1阳性的肿瘤细胞通常散在分布,而EBER阳性的肿瘤细胞通常呈簇状或片状分布、甚至弥漫分布,也会出现EBER阳性的非肿瘤细胞。（3）本次实验成功扩增15例具有EBER阳性细胞（包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞）淋巴瘤EBNA1基因羧基端的部分片段,包括经典型霍奇金淋巴瘤7例、弥漫性大B细胞淋巴瘤3例、NK/T细胞淋巴瘤3例、滤泡性淋巴瘤1例和T淋巴母细胞性淋巴瘤1例。其中弥漫性大B细胞淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的扩增产物较多,这与EBER阳性结果基本一致。（4）通过对15例淋巴瘤EBNA1基因羧基端测序分析,其编码产物为AA439-555。与标准株B95-8相比,15例EBV阳性淋巴瘤组织标本中EBNA1羧基端均出现序列变异。几例具有非肿瘤细胞EBER阳性的淋巴瘤,也均出现了与以往研究相同的共有突变（突变热点AA487及AA466-527之间的变异）。而具有肿瘤细胞EBER阳性的淋巴瘤样本中除了有部分共有突变外,均出现了非共有突变。（5）由于病例数较少,EBV与预后相关性有待于大样本进一步分析。结论淋巴瘤中EBV的表达与NK/T细胞淋巴瘤、经典型霍奇金淋巴瘤密切相关,并且可以作为辅助诊断此两种淋巴瘤的依据。并且弥漫性大B细胞淋巴瘤可伴有一定比例的EBV感染。EBER原位杂交的检测方法较为敏感并且EBER的表达模式有助于淋巴瘤类型的判定。EBNA1基因羧基端扩增产物量与EBER阳性表达结果基本一致,说明EBER的表达常常伴随EBNA1的表达。本组淋巴瘤病例中,除了有部分EBNA1基因羧基端的共有突变外,均出现了非共有突变,这与以往研究不同,为探索EBV的致病机制提供一定的价值,有待于进一步研究。另外,由于病例数较少,EBV与预后相关性有待于大样本进一步分析。
二、鼻咽癌发生发展过程中EBER_1表达的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鼻咽癌发生发展过程中EBER_1表达的研究（论文提纲范文）
（1）基于转录组测序分析的鼻咽癌相关EB病毒变异亚型及预后模型的研究（论文提纲范文）
| 英语缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 与鼻咽癌相关的EBV基因变异及其医学生物学功能 |
| 第一节 导论 |
| 1.EBV概述 |
| 1.1 EBV的基本生物学特征 |
| 1.2 EBV潜伏感染 |
| 1.3 EBV潜伏基因 |
| 2 鼻咽癌概述 |
| 3.鼻咽癌中EBV基因的变异 |
| 4.本项研究的目的和基本策略 |
| 第二节 结果 |
| 1.纳入转录组测序分析的鼻咽癌病例入组及其基本特征 |
| 2.入组样品的转录组测序分析 |
| 3.鼻咽癌组织中EBV基因变异的分析 |
| 3.1 鼻咽癌组织中EBER2和LMP2携带高频变异 |
| 3.2 EBER2变异与鼻咽癌 |
| 4.鼻咽癌中EBER2变异亚型及其临床意义 |
| 4.1 EBER2亚型与鼻咽癌患者临床特征的关系 |
| 4.2 EBER2亚型与鼻咽癌患者预后的关系 |
| 5.EBER变异在鼻咽癌独立样本中的实验验证 |
| 5.1 在EBV阳性细胞中验证EBER的变异 |
| 5.2 在鼻咽癌组织中验证EBER的变异 |
| 5.3 独立样本验证中EBER2亚型分布及与临床表型的关系 |
| 6.EBER2亚型对应宿主基因的表达分析 |
| 7.鼻咽癌组织中LMP2B的变异位点 |
| 8.LMP2B-C666和LMP2B-Raji在鼻咽癌细胞中的生物学功能 |
| 8.1 稳定表达外源性LMP2B-C666和LMP2B-Raji的鼻咽癌细胞的构建 |
| 8.2 LMP2B-C666和LMP2B-Raji对鼻咽癌细胞表型的影响 |
| 8.3 LMP2B-C666的蛋白稳定性 |
| 9.LMP2B变异与EBER2亚型的关联 |
| 第三节 讨论 |
| 1.临床相关研究的质量控制 |
| 2.以转录组测序数据分析EBV基因变异 |
| 3.EBER2的变异与鼻咽癌患者预后的关系 |
| 4.EBER变异的独立样本验证与细胞定位 |
| 5.LMP2B在鼻咽癌中的生物学功能 |
| 本章小结 |
| 第二章 鼻咽癌预后评估模型的建立 |
| 第一节 导论 |
| 1.鼻咽癌概述 |
| 2.与鼻咽癌预后相关的分子标志物 |
| 3.免疫微环境与鼻咽癌预后的关系 |
| 3.1 鼻咽癌与免疫治疗 |
| 3.2 浸润免疫细胞与鼻咽癌预后 |
| 4.本项研究的目的和基本策略 |
| 第二节 结果 |
| 1.鼻咽癌“复发转移组”和“非复发转移组”的特征性基因表达谱 |
| 1.1 入组的鼻咽癌病例及其临床信息 |
| 1.2 转录组测序数据的主成分分析(principal component analysis,PCA) |
| 1.3 机器学习方法筛选两组鼻咽癌病例肿瘤组织的特征基因 |
| 1.4 两组鼻咽癌患者肿瘤组织中的差异表达mRNA |
| 2.筛选出的13个特征基因与鼻咽癌预后的关系 |
| 2.1 13个特征基因与鼻咽癌患者无进展生存的关系 |
| 2.2 13个特征基因与鼻咽癌患者总生存的关系 |
| 3.鼻咽癌预后模型的建立 |
| 3.1 13个特征基因分别对于鼻咽癌预后的影响 |
| 3.2 多因素Cox比例风险回归模型 |
| 3.3 4-gene signature预后预测能力的评估 |
| 3.4 基于4-gene signature的风险评分与其预后能力的关联 |
| 3.5 基于4-gene signature的风险评分是否为预后的独立因素 |
| 4.4-gene signature的生物学功能 |
| 5.肿瘤免疫浸润和鼻咽癌预后的关系 |
| 5.1 本组鼻咽癌病例肿瘤组织中浸润免疫细胞与鼻咽癌预后的关系 |
| 5.2 GEO数据中浸润免疫细胞与鼻咽癌预后的关系 |
| 6.4-mRNA signature表达水平与肿瘤浸润免疫细胞的关系 |
| 第三节 讨论 |
| 1.筛选与鼻咽癌预后相关的基因 |
| 2.干扰素在鼻咽癌发生发展中的作用 |
| 3.鼻咽癌4-gene signature预后评估模型及其生物学功能 |
| 4.免疫微环境与鼻咽癌预后的关系 |
| 本章小结 |
| 第三章 材料与方法 |
| 第一节 研究对象和实验材料 |
| 1.鼻咽癌病例及其组织样品 |
| 2.细胞系 |
| 3.菌株和质粒载体 |
| 4.抗体 |
| 5.主要试剂与耗材 |
| 6.细胞培养的器皿 |
| 7.常用试剂的配制 |
| 8.主要仪器 |
| 9.主要分析软件及网站 |
| 第二节 实验方法 |
| 1.分子生物学实验方法 |
| 2.细胞生物学实验方法 |
| 3.生物学信息分析 |
| 4.统计学方法 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）CXCR4在EBV相关胃癌中的表达和调控作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.1.3 常用试剂配制 |
| 1.2 细胞系及胃癌组织标本的选择 |
| 1.2.1 细胞系的选择 |
| 1.2.2 胃癌组织标本的选择 |
| 1.3 细胞处理 |
| 1.3.1 实验前准备 |
| 1.3.2 细胞复苏 |
| 1.3.3 培养液的更换 |
| 1.3.4 细胞传代 |
| 1.4 CXCR4 及相关基因m RNA检测 |
| 1.4.1 细胞系RNA提取 |
| 1.4.2 cDNA合成 |
| 1.4.3 实时荧光定量PCR(Real-time qPCR) |
| 1.4.4 microRNA逆转录 |
| 1.4.5 microRNA表达水平检测 |
| 1.4.6 Real-time qPCR结果数据分析 |
| 1.5 CXCR4及相关蛋白检测 |
| 1.5.1 细胞系总蛋白的提取 |
| 1.5.2 蛋白浓度的测量 |
| 1.5.3 Western blott 检测细胞系中蛋白的表达 |
| 1.5.4 PI3K通路抑制剂LY294002作用后检测蛋白表达变化 |
| 1.5.5 免疫组织化学染色(SP法)检测胃癌组织中CXCR4 蛋白的表达 |
| 1.5.6 免疫荧光检测胃癌细胞中蛋白亚定位 |
| 1.6 CXCR4甲基化状态检测 |
| 1.6.1 细胞系DNA提取 |
| 1.6.2 DNA样本的焦亚硫酸盐修饰 |
| 1.6.3 亚硫酸盐基因组测序 |
| 1.7 细胞转染 |
| 1.7.1 LMP1 和 LMP2A 过表达细胞模型的建立 |
| 1.7.2 siRNA转染 |
| 1.8 细胞生物学表型实验的检测 |
| 1.8.1 细胞凋亡实验 |
| 1.8.2 细胞周期实验检测 |
| 1.9 细胞自噬的检测 |
| 1.9.1 透射电镜检测自噬体的形成 |
| 1.9.2 共聚焦显微镜检测自噬体的形成 |
| 1.10 统计学和图像分析 |
| 结果 |
| 2.1 GSE51575 数据集中CXCR4 的转录表达 |
| 2.2 胃癌细胞系中CXCR4及相关基因的转录表达 |
| 2.3 胃癌细胞系及组织中 CXCR4 蛋白表达 |
| 2.4 CXCR4 启动子和第 1 外显子甲基化状态检测结果 |
| 2.5 LMP1对CXCR4 表达的调控作用 |
| 2.6 EBV相关胃癌细胞中microRNA-146a的转录表达 |
| 2.7 microRNA-146a潜在靶基因的预测 |
| 2.8 microRNA-146a对 CXCR4 表达的调控作用 |
| 2.9 AGS 和 AGS-EBV 细胞系中 PI3K/AKT 表达 |
| 2.10 LY294002 通路抑制剂作用后CXCR4 蛋白表达变化 |
| 2.11 LMP2A对 CXCR4 表达的调控作用 |
| 2.12 CXCR4蛋白对细胞自噬的调控作用 |
| 2.13 CXCR4对细胞凋亡和周期的影响 |
| 2.14 CXCR4 和自噬在EBV潜伏期的作用 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 附录或缩略词表 |
| 致谢 |
（3）LMP1在鼻咽癌的增殖、转移及放疗敏感性中的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 鼻咽癌的研究进展 |
| 1.1.1 前言 |
| 1.1.2 鼻咽癌的病理 |
| 1.1.3 鼻咽癌的危险因素及病因 |
| 1.1.4 症状和诊断 |
| 1.1.5 治疗 |
| 1.1.6 总结及展望 |
| 1.2 EB病毒LMP1 在肿瘤研究中的进展 |
| 1.2.1 前言 |
| 1.2.2 EB病毒LMP1 简介 |
| 1.2.3 LMP1 的结构特点 |
| 1.2.4 LMP1 在上皮细胞中的作用 |
| 1.2.5 LMP1 在相关肿瘤中的研究进展情况 |
| 1.2.6 针均LMP1 的潜在治疗策略 |
| 1.2.7 结论 |
| 第2章 实验研究:LMP1 对鼻咽癌增殖、转移及放疗敏感性的机制研究 |
| 2.1 LMP1 诱导MIR-155 在鼻咽癌中的机制研究 |
| 2.1.1 前言 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 EBV感染上调高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达促进人鼻咽癌细胞增殖 |
| 2.2.1 前言 |
| 2.2.2 材料和方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 血浆人类疱疹病毒第四型LMP1和EBER1 与循环肿瘤细胞及鼻咽癌转移的关系 |
| 2.3.1 前言 |
| 2.3.2 材料和方法 |
| 2.3.3 结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 总结 |
| 第3章 结论 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）鼻咽部EB病毒核酸标志物检测在鼻咽癌分子诊断中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 鼻咽部EBV DNA load的检测及其作为鼻咽癌诊断标志物的准确性评价 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 鼻咽部EBV的产生来源研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 鼻咽部EB病毒其它核酸标志物的诊断价值评价及在盲刷取样下分子标志物的发掘 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（5）胃癌患者EB病毒抗体和内皮素ET-1抗体检测及临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.研究对象 |
| 2.外周血标本的采集与处理 |
| 3.仪器与试剂 |
| 4.原位杂交筛选EB病毒相关胃癌 |
| 5.EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测 |
| 6.EB病毒相关抗体检测 |
| 7.人内皮素1(ET-1)及其受体ETAR和 ETBR检测 |
| 8.统计学分析 |
| 结果 |
| 1 EBV阳性标本的鉴定 |
| 2 EBVaGC与 EBVn GC患者EBV特异性抗体检测结果 |
| 3 EBVaGC患者EB病毒各抗体效果评价 |
| 4 EBVaGC患者EBV抗体阳性模式出现的概率 |
| 5 EBVaGC和 EBVn GC患者ET-1,ETAR和 ETBR检测结果 |
| 6 EBV DNA载量的检测结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）EB病毒相关肿瘤基因多态性与易感性的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 2 研究对象 |
| 3 原位杂交筛选EBV阳性肿瘤标本 |
| 4 新鲜组织DNA的提取 |
| 5 石蜡包埋胃癌组织核酸提取 |
| 6 转录组高通量测序 |
| 7 基因多态性分析 |
| 8 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 高通量测序SNP分析 |
| 2 基因多态性与EBV相关肿瘤易感性相关性分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 1.流感病毒 |
| 2.呼吸道合胞体病毒 |
| 3.人类免疫缺陷病毒 |
| 4.人T细胞白血病病毒1型 |
| 5.人类乳头状瘤病毒 |
| 6.丙型肝炎病毒 |
| 7.乙型肝炎病毒 |
| 8.单纯疱疹病毒 |
| 9.诺瓦克病毒和轮状病毒 |
| 10.细小病毒 |
| 11.EB病毒 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 致谢 |
（7）白血病和骨髓增生异常综合征患者EB病毒编码基因变异亚型分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 常用试剂配制 |
| 2 细胞系的选择 |
| 3 细胞处理 |
| 3.1 首次传代前细胞的复苏 |
| 3.2 细胞传代 |
| 4 研究对象 |
| 4.1 核酸提取 |
| 4.2 EBV阳性标本筛选 |
| 5 1/2 分型、F/f分型检测 |
| 5.1 PCR扩增 |
| 5.2 RFLP分析 |
| 6 EBV潜伏期基因序列多态性检测 |
| 6.1 引物设计 |
| 6.2 EBERs、LMP1 基因扩增 |
| 6.3 测序分析 |
| 7 统计学分析 |
| 结果 |
| 2.1 EBV感染与白血病和MDS临床病理特征的关系 |
| 2.1.1 白血病和MDS病人EBV检出情况 |
| 2.1.2 EBV感染与病人临床病理特征的关系 |
| 2.2 1/2 分型及F/f分型结果 |
| 2.2.1 1/2 分型结果 |
| 2.2.2 F/f分型结果 |
| 2.3 EBER基因序列多态性 |
| 2.3.1 EBER序列变异类型 |
| 2.3.2 EBER变异类型在不同人群中的分布 |
| 2.4 LMP1 基因序列多态性 |
| 2.4.1 LMP1 序列变异类型 |
| 2.4.1.1 B95-8 亚型 |
| 2.4.1.2 China1 亚型 |
| 2.4.1.3 China2 亚型 |
| 2.4.1.4 Med-亚型 |
| 2.4.2 LMP1 亚型在3 组人群中的分布 |
| 2.4.3 XhoⅠ(-)变异及del-LMP1 变异 |
| 2.4.4 LMP1 C末端重复序列变异 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| EB病毒编码基因多态性研究进展 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（8）EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 NF-κB经典信号通路在EBV相关胃癌中持续激活的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 常用试剂配制 |
| 2 胃癌细胞系及组织标本的选择 |
| 2.1 细胞系选择 |
| 2.2 胃癌组织标本选择 |
| 3 细胞处理 |
| 3.1 实验前准备 |
| 3.2 细胞复苏 |
| 3.3 培养液的更换 |
| 3.4 细胞传代 |
| 4 NFKBIA基因启动子区甲基化状态检测 |
| 4.1 细胞系DNA的提取 |
| 4.2 DNA样本焦亚硫酸盐修饰 |
| 4.3 亚硫酸盐基因组测序 |
| 5 NFKBIA及相关基因mRNA检测 |
| 5.1 细胞系RNA提取 |
| 5.2 新鲜组织标本RNA的提取 |
| 5.3 cDNA的合成 |
| 5.4 实时荧光定量PCR |
| 5.5 qRT-PCR结果数据分析 |
| 6 IκBα及相关蛋白检测 |
| 6.1 细胞系总蛋白的提取及浓度测量 |
| 6.2 Western blot检测细胞系蛋白表达情况 |
| 6.3 免疫荧光技术检测胃癌细胞系中蛋白亚定位 |
| 6.4 石蜡切片免疫组织化学染色(SP法)检测胃癌组织中蛋白的表达 |
| 6.5 免疫组织化学染色结果分析 |
| 6.6 通路抑制剂作用后检测蛋白表达及核定位变化 |
| 7 细胞增殖能力检测(CCK8 试剂盒) |
| 8 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 9 LMP1和LMP2A过表达细胞系的建立 |
| 9.1 载体构建 |
| 9.2 菌液培养 |
| 9.3 质粒提取 |
| 9.4 重组质粒pcDNA3.1-LMP1和pcDNA3.1-LMP2A 转染胃癌细胞系SGC7901细胞 |
| 10 siRNA及 miRNA转染 |
| 11 双荧光素酶报告基因检测 |
| 11.1 h-NFKBIA载体构建 |
| 11.2 细胞转染操作步骤 |
| 11.3 检测实验操作步骤 |
| 12 细胞核蛋白与浆蛋白提取 |
| 13 NF-κB p65 转录因子试剂盒p65-DNA结合能力检测 |
| 14 EBV-DNA拷贝数相对及绝对定量 |
| 14.1 EBV DNA相对拷贝数检测 |
| 14.2 EBV DNA绝对拷贝数检测 |
| 15 统计学和图像分析 |
| 结果 |
| 1 qRT-PCR检测胃癌细胞系中NF-κB经典信号通路相关基因的转录表达 |
| 2 胃癌细胞系中NFKBIA(IκBα)及相关基因的蛋白表达 |
| 3 胃癌细胞系TRAF1/2/3/6 蛋白表达 |
| 4 NFKBIA甲基化状态检测结果 |
| 5 p65 蛋白在胃癌细胞系中的亚定位 |
| 6 ELISA检测胃癌细胞系NF-κB转录因子活性 |
| 7 IκBα及相关基因在胃癌组织中的表达 |
| 8 NF-κB经典信号通路对EBV阳性胃癌细胞增殖、凋亡的影响 |
| 8.1 抑制NF-κB信号通路对胃癌细胞增殖的影响 |
| 8.2 抑制NF-κB信号通路对EBVaGC凋亡的影响 |
| 9 抑制NF-κB信号通路对ZEB1 表达的影响 |
| 9.1 EBV阳性和阴性胃癌细胞系细胞系ZEB1的表达 |
| 9.2 BAY11-7082对ZEB1 表达的影响 |
| 10 抑制NF-κB信号通路对EBVaGC潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A的影响 |
| 11 胃癌细胞系NFKBIA基因变异检测 |
| 12 EBV编码的miRNA-BART16对IκBα表达的影响 |
| 13 LMP1对NF-κB信号通路的调控作用 |
| 14 LMP2A对 NF-κB信号通路的调控作用 |
| 15 稳定转染LMP1及LMP2A对 NF-κB信号通路的调控作用 |
| 16 干扰TRAF1对NF-κB信号通路的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 EBV编码miR-BART16 通过靶定LMP1调节肿瘤细胞增殖 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 常用试剂配制 |
| 2 细胞培养 |
| 3 RNA的提取 |
| 4 miRNA的实时荧光定量检测 |
| 5 细胞增殖能力检测 |
| 6 细胞周期检测 |
| 6.1 碘化丙啶染色分析 |
| 6.2 溴脱氧尿苷(BrdU)细胞周期检测 |
| 7 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 EBVaGC细胞系及胃癌组织中miRNA-BART16与LMP1 的相对表达量 |
| 2 miRNA-BART16 能够调控LMP1 的表达 |
| 3 miR-BART16 对细胞增殖的影响 |
| 4 miRNA-BART16 对细胞凋亡的影响 |
| 5 miR-BART16 对细胞周期的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（9）EBV调控AQP3表达机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 常用试剂配制 |
| 2 细胞系及胃癌组织标本的选择 |
| 2.1 细胞系的选择 |
| 2.2 胃癌组织标本的选择 |
| 3 细胞处理 |
| 3.1 实验前准备 |
| 3.2 细胞复苏 |
| 3.3 培养基的更换 |
| 3.4 细胞传代 |
| 3.5 5-Aza-CdR作用 |
| 4 AQP3基因甲基化状态检测 |
| 4.1 细胞系DNA提取 |
| 4.2 DNA样本的亚硫酸盐修饰 |
| 4.3 亚硫酸氢盐基因组测序(Bisufite genomic sequencing, BGS) |
| 4.4 甲基化特异性 PCR(Methylation-specific PCR, MSP) |
| 5 AQP3 及相关基因mRNA检测 |
| 5.1 细胞系RNA提取 |
| 5.2 去除RNA中 gDNA |
| 5.3 合成c DNA |
| 5.4 实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-time PCR, q RT-PCR) |
| 5.5 qRT-PCR结果数据分析 |
| 6 AQP3及相关蛋白表达检测 |
| 6.1 细胞系蛋白提取及浓度测定 |
| 6.2 Western Blot检测细胞系中蛋白表达水平 |
| 7 免疫组化检测胃癌组织中AQP3 蛋白的表达 |
| 8 LMP1、LMP2A 及 EBER1 过表达细胞模型建立 |
| 9 siRNA转染 |
| 10 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 胃癌细胞系中目的基因mRNA转录表达 |
| 2 胃癌细胞系中AQP3和DNMTs蛋白的表达 |
| 3 胃癌组织中AQP3 蛋白的表达 |
| 4 AQP3 甲基化状态检测 |
| 4.1 胃癌细胞系中AQP3 基因启动子甲基化状态BGS检测结果 |
| 4.2 胃癌组织中AQP3 基因甲基化状态MSP检测结果 |
| 5 去甲基化处理对AQP3 甲基化状态及表达的影响 |
| 5.1 5-Aza-2'-脱氧胞苷处理对AQP3 基因启动子甲基化状态的影响 |
| 5.2 5-Aza-2'-脱氧胞苷处理对AQP3和DNMT3a表达的影响 |
| 6 外源性LMP1,LMP2A,EBER1 表达对AQP3和DNMT3a表达的影响 |
| 6.1 构建稳定表达LMP1,LMP2A和 EBER1 的细胞模型 |
| 6.2 外源性LMP1,LMP2A,EBER1 表达对AQP3、DNMT3a和 ERK1/2 的影响 |
| 6.3 瞬时过表达LMP2A对 AQP3,DNMT3a表达的影响 |
| 7 抑制ERK通路对DNMT3a和 AQP3 表达的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（10）不同类型淋巴瘤组织中EB病毒的表达及EBNA1多态性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 统计学分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章及科研情况 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
四、鼻咽癌发生发展过程中EBER_1表达的研究（论文参考文献）
- [1]基于转录组测序分析的鼻咽癌相关EB病毒变异亚型及预后模型的研究[D]. 赵爽. 北京协和医学院, 2021
- [2]CXCR4在EBV相关胃癌中的表达和调控作用研究[D]. 王维文. 青岛大学, 2020(01)
- [3]LMP1在鼻咽癌的增殖、转移及放疗敏感性中的机制研究[D]. 孙乐. 吉林大学, 2020(08)
- [4]鼻咽部EB病毒核酸标志物检测在鼻咽癌分子诊断中的应用研究[D]. 郑小辉. 新疆医科大学, 2020(07)
- [5]胃癌患者EB病毒抗体和内皮素ET-1抗体检测及临床意义[D]. 杨爱华. 青岛大学, 2019(01)
- [6]EB病毒相关肿瘤基因多态性与易感性的相关性研究[D]. 闫春. 青岛大学, 2019(01)
- [7]白血病和骨髓增生异常综合征患者EB病毒编码基因变异亚型分析[D]. 王海语. 青岛大学, 2019(03)
- [8]EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究[D]. 张岩. 青岛大学, 2019(07)
- [9]EBV调控AQP3表达机制的研究[D]. 王嘉怡. 青岛大学, 2019(03)
- [10]不同类型淋巴瘤组织中EB病毒的表达及EBNA1多态性研究[D]. 徐海芹. 内蒙古医科大学, 2019(03)