一、应用gfp对盐单胞菌C6可能转座酶A基因启动区的鉴定（论文文献综述）
付磊[1]（2020）在《原核生物Argonaute（pAgo）蛋白介导细菌基因组编辑及其机制研究》文中认为虽然经典遗传操作工具在少数模式细菌中有着很好的效果,但并不适用于大多数重要病原菌在内的其它细菌。新型基因编辑技术CRISPR/Cas9由于存在表达元件复杂、脱靶效率高以及细菌存在抗Cas9分子等因素,限制了该技术在很多病原菌中的应用。因此,开发通用、简便、高效、无痕的遗传操作工具对于病原菌致病机制和防控技术的研究具有重要的价值和意义。多杀性巴氏杆菌对猪、牛、鸡、鸭等畜禽养殖业危害严重,缺乏高效的遗传操作工具极大限制了该病原菌致病机理的研究及防控产品的研发。为了研究禽多杀性巴氏杆菌的致病机理和基因工程疫苗,我们实验室前期应用多种经典遗传操作系统,如温敏自杀系统、Sac B筛选系统、galk筛选系统及thy A筛选系统等,来构建禽多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株但都未成功。后来采用NgAgo/gDNA系统成功实现了禽多杀性巴氏杆菌和兔多杀性巴氏杆菌靶基因的敲除和敲入,并获得了毒力下降的疫苗候选菌株,说明NgAgo/gDNA系统为多杀性巴氏杆菌致病机制和防控产品的研究提供了遗传操作工具,但该系统介导细菌基因组编辑的分子机制并不清楚。鉴于此,本论文主要研究原核生物Argonaute（pAgo）蛋白介导多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌基因敲除及其分子机制,其研究内容如下:1)NgAgo介导不同细菌靶基因的敲除及敲入。我们实验室前期研究发现NgAgo/gDNA系统可以高效介导多杀性巴氏杆菌基因的敲除及敲入,但该系统能否用于其它细菌基因敲除需要进一步研究。本研究发现NgAgo/gDNA系统成功介导大肠杆菌aste基因缺失的效率高达90%。表明NgAgo/gDNA系统可以应用于多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌等细菌的基因敲除。2)NgAgo介导细菌基因敲除不依赖自身的DNA酶活性。CRISPR/Cas9系统可通过g RNA靶向切割基因组DNA而提高同源重组效应,来实现细菌基因组编辑,NgAgo/gDNA系统介导细菌基因敲除是否同样依赖gDNA靶向切割基因组DNA的水解酶活性需要进一步探究。故本论文将NgAgo潜在的酶活性位点（D633A,D738A）进行突变,发现仍能高效介导禽多杀性巴氏杆菌lyi基因敲除。不引入外源gDNA,NgAgo也可以高效介导禽多杀性巴氏杆菌lyi及opa基因的敲除。表明NgAgo提高细菌基因敲除的效率不依赖自身DNA酶活性及外源gDNA。3)NgAgo蛋白通过增强recA介导同源DNA链交换来提高同源重组效率。既然NgAgo介导细菌基因敲除不依赖其自身DNA酶活性及外源gDNA,其机制有待解析。本论文采用IP方法筛选NgAgo蛋白互作分子并通过质谱鉴定同源重组酶recA为其互作蛋白,随后通过正反向Co-IP验证NgAgo与内源性recA互作,且互作不受DNase I处理的影响。通过分析纯化的重组NgAgo蛋白和recA蛋白之间的互作,发现两种蛋白可直接互作,进一步应用SPR技术发现NgAgo与recA互作亲和力高于10n M,暗示recA为NgAgo的互作蛋白。同源重组过程中recA通过与单链DNA结合,并介导单链DNA与同源DNA的链交换而实现同源重组。本论文研究发现NgAgo蛋白并没有显着增加recA蛋白与单链DNA的结合,但却能显着增强recA介导的同源DNA链交换能力。表明NgAgo介导细菌基因敲除的机制是NgAgo蛋白与同源重组酶recA结合,并增强recA介导的同源DNA链交换能力,从而提高了同源重组效率,实现了细菌基因组编辑。4)PIWI结构域是NgAgo蛋白介导细菌基因组编辑的主要结构域。NgAgo蛋白主要由四个结构域构成,即N端、PAZ、MID及PIWI结构域,为了分析NgAgo介导细菌基因组编辑的主要结构域,将NgAgo分段为NgAgo-A（N端）、B（PAZ-MID-PIWI区域）、C（N-PAZ区域）、D（MID-PIWI区域）。发现NgAgo-A和NgAgo-C不能,而NgAgo-B和NgAgo-D能与recA互作且高效介导禽多杀性巴氏杆菌lyi基因的敲除。说明NgAgo蛋白C端是其介导细菌基因组编辑的主要结构域。为了排除C端PIWI结构域的DNA酶活性,本论文将NgAgo-D蛋白的酶活性位点进行突变,发现其仍能和recA互作,增强recA介导的同源DNA链交换能力,提高同源重组效率来介导禽多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌基因的敲除。表明NgAgo蛋白C端是其介导细菌基因组编辑的主要区域,且不依赖于自身DNA水解酶活性。为了进一步分析NgAgo介导细菌基因组编辑的主要结构域是MID或PIWI,故将NgAgo分段为NgAgo-E（MID）和NgAgo-F（PIWI）,发现PIWI是与recA互作且高效介导禽多杀性巴氏杆菌opa基因敲除的主要结构域。表明PIWI结构域是NgAgo蛋白介导基因组编辑的主要结构域,且不依赖于自身DNA水解酶活性。5)多种pAgo蛋白均能高效介导细菌基因敲除且不依赖其DNA酶活性。NgAgo蛋白可以通过PIWI结构域与recA互作,增强recA介导的同源重组效率来介导细菌基因组编辑,本论文进一步分析了其它原核生物Ago蛋白PIWI结构域的功能保守性。对嗜热栖热菌的Tt Ago、嗜热古细菌的Pf Ago及超嗜热菌的Aa Ago进行分析,发现三种pAgo（MID-PIWI区域）蛋白都能与细菌recA蛋白互作,能高效介导禽多杀性巴氏杆菌lyi及opa基因的敲除,且不依赖于PIWI区域的DNA酶活性。表明不同原核生物Ago蛋白的PIWI结构域具有功能保守性,均可介导细菌的基因组编辑。总之,本研究发现具有PIWI结构域的pAgo蛋白都能介导多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的基因组编辑,其机制是不依赖于gDNA靶向切割基因组DNA的水解酶活性,而是pAgo的PIWI结构域与recA互作,增强recA介导的同源DNA链交换能力,从而提高同源重组效率。pAgo具有开发为通用、简便、高效、无痕的细菌基因组编辑工具的潜力,为研究重要病原菌的致病机理及防控产品等方面奠定了基础。
王晓璇[2]（2020）在《拮抗细菌Burkholderia seminalis R456的铁代谢及其调控机制研究》文中指出铁代谢作为微生物的基础代谢之一,维持细胞的催化代谢酶和DNA生物合成等多种重要生理过程。然而环境中有限的铁离子浓度阻碍了微生物的正常繁殖和位点适应,不仅影响各类病原细菌的致病性,也影响生防有益细菌的拮抗活性。在长期的生物进化过程中,微生物已发展出多种铁代谢途径,其中最重要的就是通过分泌高亲和力的铁螯合剂-嗜铁素来协助其在低铁环境获取铁离子;而一些被发现的新嗜铁素及相应的铁代谢途径进化经常是由水平基因转移（horizontal gene transfer,HGT）获取的外来基因（簇）所致。另一方面,铁代谢全局调控因子（Ferric uptake regulator,Fur）作为中央枢纽广泛存在于微生物中,协调不同铁代谢途径间的平衡。本实验室前期工作发现4株Burkholderia seminalis菌株S9,0901,DSM23518,和R456分别扮演了环境腐生,植物和人体病原以及拮抗生防的角色,而这些特异性的角色很大程度是由于每个菌株在长期的进化过程中能适应特定位点,通过多维组学结合表型分析,我们发现这些位点适应很大程度是由于菌株通过HGT,位点差异性表达以及甲基化等表观遗传手段丰富了各自的铁代谢途径,特别是能通过分泌抗菌物质c FP（环二肽）拮抗病原真菌的菌株R456,其基因组中存在一个HGT驱动的位点特异表达的铁相关基因簇。因此,以拮抗菌株R456为对象,深入开展来源于HGT的新型铁代谢及其与Fur之间关系研究,不仅将极大地丰富微生物铁代谢网络,也有利于更好地利用R456等有益微生物。通过研究,本文取得了以下主要结果:首先,本研究在B.seminalis R456中鉴定出了从藻类水平基因转移的新型非核糖体多肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases,NRPSs）基因簇,这也是国际上首次发现的藻类向细菌转移的基因簇。基因组分析发现该菌株同时具有嗜铁素ornibactin和pyochelin的合成基因簇以及该水平转移基因簇NRPS-R456。该NRPS基因簇可能主要通过影响嗜铁素合成,铁胁迫生长,生物膜合成和游动性等铁代谢相关表型参与铁代谢途径。通过高效液相色谱-质谱联用,鉴定该菌株在缺铁条件可以合成ornibactin及相关同系物,两种pyochelin异构体。进一步通过制备色谱和镍离子层析柱分离纯化两类嗜铁素并鉴定其活性,结合质谱数据和该基因簇的生信分析结果,预测该基因簇合成一个具有嗜铁素活性的新型多肽;同时该基因簇核心基因的缺失显着降低ornibatcin和pyochelin合成,荧光定量PCR也显示突变体中这两种嗜铁素直接调控因子的表达明显下调。其次,本研究鉴定出上述NRPS-R456基因簇与B.seminalis R456中的传统铁代谢全局调控因子Fur存在相互作用。首先,本研究显示在富铁条件下,Fur的缺失明显使胞内铁含量上调,过氧化氢酶活性降低,过氧化氢耐受性明显减弱,证实了Fur对于铁平衡的调控作用,避免富铁条件下铁过量吸收;其次,为了明确Fur究竟通过影响哪些蛋白来行使其调控功能,我们通过原核表达并制备抗体进行免疫蛋白共沉淀,并通过细菌双杂验证由Fur抗体钓取的蛋白与Fur的互作,经质谱鉴定与Fur互作的蛋白包括核糖体蛋白S1（Rps A）,热激蛋白（Gro EL）,转录终止蛋白（Nus A）,醛脱氢酶（Adh E）,天冬氨酸连接酶（Asp S）,磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（Pck G）和热激蛋白（Dna K）;最后,荧光定量PCR鉴定出NRPSR456和Fur在彼此的突变体中都会下调表达,生信分析发现NRPS-R456中存在一个Fur二聚体结合的识别序列,且酵母单杂显示富铁条件下Fur蛋白可以与识别序列结合,从而抑制该基因簇的表达,这些结果清楚地显示了NRPS-R456或许与Fur蛋白协同调控细菌的铁代谢。最后,本论文通过Tn5转座子突变法鉴定出NRPS-R456控制的铁代谢与细菌的拮抗能力相关。首先通过Tn5随机插入构建包含997个R456转座子突变株的突变体库;然后通过缺铁培养基筛选,获得3个明显在缺铁环境生长受限的突变体,通过对峙培养,筛选到10个拮抗水稻纹枯病菌能力明显减弱的突变体,另有1个突变体两种表型均减弱;最后通过反向PCR法鉴定插入基因,结果发现,具有双重减弱表型的突变株转座子插入至NRPS-R456（R456＿2057）中,缺铁环境生长受限的3个突变体,转座子分别插入到参与嘌呤途径的甘氨酰胺合酶（Pur L）,天冬氨酸转氨酶（Asp B）,铁硫簇蛋白;拮抗减弱的10个突变体中,有8个突变体转座子分别插入到糖基转移酶（Glycosyl transferase）,组蛋白（Histone H1）,核糖体甲基转移酶（50S ribosomal protein L11 methyltransferase）,膜完整性相关转运蛋白（Pqi C）,t RNA尿苷合成酶（Mnm G）,硫酸盐转运蛋白（Yei H）,过氧化氢酶（Catalase）,硫酸盐腺苷转移酶（Cys D）,其余3个突变体转座子均插入到质粒上,其中2个突变株的Tn5转座子插入至同一假设蛋白（R456＿6210）,1个突变株转座子插入至另一假设蛋白（R456＿6327）。综上,本论文在拮抗细菌B.seminalis R456中鉴定出一个从藻类水平转移获得的NRPS-R456基因簇,其不仅单独具有全局性的铁代谢调控功能,且与传统的铁代谢全局调控因子Fur存在相互作用,随机插入突变分析显示其特异的拮抗能力或许也很大程度与这个NRPS-R456负责的铁代谢相关,这一研究结果不仅突出了水平转移在细菌铁代谢进化中的作用,也强调了铁代谢进化在细菌适应特定生态位点进而发挥特定生物学功能中的重要性。
王惠杉[3]（2019）在《DSF群体淬灭菌Pseudomonas sp. HS-18的分离鉴定及其淬灭机制的研究》文中研究说明群体感应是一种微生物细胞间的通讯交流机制,细菌利用群体感应调控多种毒力因子的表达。群体淬灭是一种通过干扰或阻断群体感应系统的方式实现对致病菌毒力的削弱、提高寄主植物抵抗力的新型生物防治途径。群体淬灭具有不直接杀死细菌、不对病原菌造成选择压力等优点,可以避免农药和抗生素容易引起病原菌抗药性的弊病,有望成为一种绿色安全防治微生物病害的新方法。针对革兰氏阴性菌中DSF（diffusible signal factor）群体感应信号的淬灭研究目前鲜有报道。DSF群体感应信号介导多种革兰氏阴性菌的毒力因子表达,对多种农业经济作物造成重大损失。目前病害防治的主要依赖培育抗病品种和使用化学药剂,但化学药剂的过量、长期使用给环境、牲畜、人类带来了严重的污染问题和不良影响。前期的研究表明破坏DSF群体感应系统可有效削弱DSF介导的致病菌的毒力,但目前对DSF淬灭机制的研究相当少。本研究建立了一种高效可靠的DSF淬灭菌筛选方法,从自然环境采集的样品及实验室库存菌株中分离、筛选到一株高效DSF淬灭菌。通过全基因组测序,确定DSF淬灭菌的遗传信息后,分析了DSF淬灭基因,借助分子生物学手段证明DSF淬灭基因的重要作用,并进一步结合转录组分析和q-RT PCR（quantitative real-time PCR）推测可能的DSF淬灭途径。研究结果主要如下:利用不同浓度的DSF为唯一碳源的无机盐培养基MM*固体平板筛选并确定了11株高效DSF淬灭菌株。结合高效液相色谱,定量分析DSF淬灭菌的淬灭效率,最终结合透明圈大小与高效液相色谱分析结果,最终确定了一株在12 h内能完全淬灭0.5m M DSF的最高效DSF淬灭菌Pseudomonas sp.HS-18。通过对Pseudomonas sp.HS-18的基因组测序,明确了HS-18中的遗传信息。HS-18基因组是一个环形染色体,大小为6.49 M,G+C含量为64.74%。HS-18有一个环形的质粒,总长度为0.1 M,G+C含量为55.01%。HS-18中预测到的编码基因个数有6090个,不含有t RNA,5S r RNA有6个拷贝,16S r RNA有5个拷贝,23S r RNA有5个拷贝,s RNA有16个拷贝。HS-18基因组中拥有完整的脂肪酸代谢途径。基于DSF群体感应信号的分子结构与DSF在黄单胞杆菌XC1中的群体感应退出机制的研究,本研究猜想DSF的淬灭与脂肪酸的降解过程相关,进一步利用大肠杆菌（Escherichia coli）中脂肪酸代谢相关的Fad DE.coli及XC1中与DSF群体感应退出机制有关的Rpf B进行氨基酸相似性比对和基因定位,最终根据氨基酸序列的相似性,选取了HS-18中4个dig（DSF inactivation gene）基因,分别命名为dig1、dig2、dig3、dig4。通过分子生物学手段,得到dig各个单基因和多基因敲除缺失突变体和互补体。根据含有5 m M DSF的MM*固体平板上各菌株产生的透明圈大小及各菌株对MM*液体培养基中0.5 m M DSF淬灭情况的高效液相色谱定量分析,证明了dig1、dig2、dig3、dig4对外源添加的DSF淬灭过程的重要作用。异源表达dig1、dig2、dig3、dig4的DH5α也显着提升了对DSF的淬灭能力。利用原核表达载体p ET28b对dig1、dig2、dig3、dig4在IPTG诱导下蛋白表达的同时,分别检测对DSF的淬灭能力,结果显示表达的Dig蛋白可以显着提升大肠杆菌BL21（DE3）对DSF的淬灭效果。在DSF过表达的突变体XC1△rpf C中分别表达dig1、dig2、dig3、dig4,借助高效液相色谱检测各菌株培养液中内源DSF的产量,结果显示,异源表达dig的△rpf C的内源DSF产量相比于携带空质粒的△rpf C显着降低。异源表达dig1、dig2、dig3、dig4的XC1中的许多毒力因子的产量也显着降低,如:胞外蛋白酶、纤维素酶、聚半乳糖醛酸酶、生物膜的产量、运动性能力等。HS-18及dig对XC1的生物防治效果的研究表明HS-18显着削弱XC1的致病力,dig1、dig2、dig3、dig4对HS-18削弱XC1的毒力十分重要。q-RT PCR及报告菌株检测结果表明在添加DSF的培养条件下,DSF对dig的启动子具有诱导作用,HS-18中dig1、dig2、dig3、dig4的表达量显着上调。综上所述,本研究分离了一株高效灭活DSF群体感应信号的菌株Pseudomonas sp.HS-18,该菌株至少具有4个编码DSF失活酶的基因,即dig1,dig2,dig3和dig4。多个DSF灭活基因的存在以及dig基因可以被DSF信号分子高度诱导的特性,提供了解释菌株HS-18中对DSF高效淬灭活性的分子基础。本研究还证明了菌株HS-18对DSF介导的细菌感染的优异的生物防治潜力,以及dig基因在生物防治中的关键作用。这些研究结果不仅为生物技术应用提供了一种有前途的生防菌和有效的DSF灭活酶,而且还提供了有用的线索以解析在微生物-微生物互作过程中,微生物如何检测和响应另一微生物产生的DSF群体感应信号的分子机制。
刘君彦[4]（2019）在《食品体系中乳杆菌的压力应答机制及其与酵母的群体相互作用》文中认为食品工业是关系国计民生的生命产业,是一个国家经济发展水平和人民生活质量的重要标志。食品安全是社会关注的焦点,各类食品安全问题中微生物污染问题居于首位。传统食品微生物安全问题集中于由致病微生物引起的食物中毒,而由腐败微生物引起的食品腐败变质,同样属于重要的食品微生物安全问题。食品是化学及生物组成复杂的体系,食品中微生物通常是多种属以群体形式存在。微生物在食品中的角色差异及群体作用,使其存在共生、协同或拮抗作用。因此,根据食品体系中化学与微生物组成,了解微生物的行为及其群体相互作用对实现腐败微生物的控制尤为重要。本文针对经微生物检测合格的食品中出现活的但不可培养（VBNC）状态乳杆菌导致食品在货架期内腐败变质的实际事件,基于食品体系中多微生物共存且互相影响的实际情况,同时考虑微生物的特定生长模式,研究食品腐败乳杆菌VBNC状态的形成和特征,从基因功能和转录层面上揭示了乳杆菌的压力应答（VBNC状态形成）机制,并探究食品体系中腐败细菌（乳杆菌）和发酵真菌（酵母）的群体相互作用及其调控机制,针对假丝酵母形成菌丝的典型特性,探究乳杆菌通过影响假丝酵母葡萄糖信号传导通路调控BLP1基因表达而抑制菌丝形成的机制。主要研究内容和结果如下:（1）模拟食品体系及其储藏环境,研究乳杆菌VBNC状态形成条件与特性,并从基因功能和转录层面探究其形成机制。选取典型食品腐败乳杆菌,采用连续传代法和低温储藏法分别进行VBNC状态诱导,第一代时106 cells/mL以上活菌进入VBNC状态,105至196天和17至32代后全部活菌处于VBNC状态。VBNC状态乳杆菌菌体缩小,具有与正常状态相似的乳酸、乙酸与双乙酰代谢能力和食品腐败能力。基于乳杆菌VBNC状态的表型特征,对典型乳杆菌进行全基因组学研究,并选取代表VBNC状态形成过程的正常状态、半胁迫状态与VBNC状态进行转录学研究,从基因功能和转录水平上获得乳杆菌VBNC状态形成机制。乳杆菌在食品体系中连续传代或其储藏环境的低温压力条件下,通过启动7个压力应答因子抵抗外界压力,并下调18个转运、7个代谢过程、28个酶活性、4个生物合成等相关基因的表达降低自身需求从而适应环境压力,最终进入VBNC状态。（2）基于乳杆菌与酵母在食品体系中共存的实际情况,探究乳杆菌与酵母的群体相互作用模型。根据乳杆菌和酵母在食品体系中的比例差异及部分酵母的特殊生长模式,探究不同浓度比例乳杆菌和不同生长模式酵母群体相互作用过程中的表型变化,并从基因转录水平上探究其相互作用机制。具有不同生长模式的酿酒酵母与假丝酵母和乳杆菌相互作用模型相似,表型方面,乳杆菌在自身生长不受影响的基础上抑制酵母的生长;分子机制方面,乳杆菌启动lamBDCA群感效应（QS）系统,部分菌体对假丝酵母产生粘附,并释放信号分子对酵母产生刺激,酵母激活压力应答基因,但基础生理活动、细胞周期、减数分裂与配对通路带来的生长与增殖率下降,以及饥饿调整通路、高渗压力生存通路、细胞壁重塑通路与维持细胞壁完整性的WSC1/2/3基因下调导致部分菌体死亡,使酵母菌量下降,同时双方代谢均发生变化。（3）基于假丝酵母形成菌丝的典型特征,从表型和基因通路层面探究乳杆菌对假丝酵母菌丝形成的调控作用。从表型层面探究乳杆菌对假丝酵母菌丝形成的影响,针对菌丝形成关键基因BLP1,研究调控BLP1基因表达的表型和信号传导通路,进而深入探究乳杆菌调控BLP1基因表达并抑制菌丝形成的分子机制。结果表明,乳杆菌启动QS系统增加细胞表面粘附能力,对假丝酵母产生粘附作用,并释放信号因子,刺激假丝酵母葡萄糖阻遏通路中HGT19转运因子表达上调,将葡萄糖转运进入胞内,同时HXK2基因的表达上调,使Hxk2激酶合成增加,将葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸,GLC7与REG1基因的上调,增强Glc7/Reg1磷酸酶复合体的生成,使其识别葡萄糖-6-磷酸,抑制SNF1基因的表达,导致Snf1激酶无法合成,激活MIG1/2转录抑制因子,同时HCM1转录诱导因子表达下调,BLP1基因表达被抑制,因此阻断菌丝形成。（4）结合乳杆菌压力应答、与酵母的群体相互作用和调控假丝酵母菌丝形成机制进行深入分析,总结其压力应答及与酵母群体互作的内在机制。在（2）中所述QS系统介导的群体作用模式下,由于酿酒酵母和假丝酵母生长模式和自身基因组的差异,与乳杆菌的相互作用的表型和分子机制中也存在部分差异,包括生长抑制率和具体的信号分子、压力应答基因及代谢通路的差异,以及乳杆菌对假丝酵母菌丝形成的调控。群体相互作用刺激乳杆菌启动3-5个压力应答基因并下调氨基酸和脂肪酸代谢,为乳杆菌VBNC状态形成的部分内在诱因,但可能由于缺少剩余部分压力应答基因的启动和代谢、转运等通路的下调作用,未达到VBNC状态形成阈值,乳杆菌保持生长。本论文考察了食品体系中腐败乳杆菌的压力应答（VBNC状态形成）及其与不同生长模式酵母的群体相互作用,获得的分子机制为食品体系中腐败微生物引起的假阴性检测和食品体系中化学和生物组成变化的双重控制提供崭新的思路和科学依据。
马润亭[5]（2018）在《绿针假单胞菌GP72中吩嗪合成的群体感应调控与基因簇的过表达》文中研究指明绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）GP72是一株从青椒根际分离得到的生防根际促生菌,分泌吩嗪类化合物吩嗪-1-羧酸（PCA）和2-羟基吩嗪（2-OH-PHZ）,其对植物病原真菌有很强的抑制作用,因此研究其合成的调控机制并通过分子生物学方法提高吩嗪类化合物产量具有重要的意义。前期研究显示,吩嗪的合成受到phzI/phzR双元调控系统的调控,phzI基因产生信号分子AHLs,和phzR产生的蛋白结合调控下游吩嗪合成基因簇的表达。通过对菌株GP72的全基因组DNA序列比对分析,发现其中包含基因aurI、csaI和hdtS,均有文献报道能合成AHLs,且双元调控系统aurI/aurR、csaI/csaR可能会调控吩嗪类化合物的产量。首先,以菌株GP72中的aurI、csaI、hdtS、phzI四个基因为研究对象,分别构建过表达质粒pBbB5k-aurI、pBbB5kk-csaI、pBbB5k-hdtS、pBbB5k-phzI,再转入大肠杆菌DH5α,获得四株表达菌株。pBbB5k是一个包含强启动子序列的表达载体,在IPTG诱导下才能启动下游基因表达。紫色杆菌CV026和根癌农杆菌NTL4可以作为指示菌检测AHLs,CV026对短链信号分子敏感,NTL4对长链信号分子敏感,用CV026和NTL4做显色实验,初步确定四个基因均能产生AHLs。aurI、csaI、phzI产生的信号分子能使CV026显紫色,NTL4显蓝色,而hdtS产生的信号分子只能使NTL4显蓝色,说明aurI、csaI、phzI可以同时产生长链信号分子和短链信号分子,hdtS只能产生长链信号分子。将四株表达菌株发酵,通过HPLC和LC-MS分析和确定发酵液中具体的信号分子种类。接下来构建了四个基因的敲除突变株GP72ΔaurI、GP72ΔcsaI、GP72ΔhdtS、GP72ΔphzI,发酵测定生长曲线和吩嗪类化合物产量。和GP72野生型相比,GP72ΔphzI突变株的吩嗪类化合物产量降为野生型的一半,GP72ΔaurI突变株的吩嗪类化合物产量是野生型的4倍左右,GP72ΔcsaI、GP72ΔhdtS突变株的产量和野生型无异,且四株突变菌株的生长曲线和野生型一致,说明phzI正调控吩嗪合成,aurI负调控吩嗪合成,csaI、hdtS基因虽然产生信号分子,但可能不调节吩嗪合成。为了研究双元调控系统aurI/aurR对吩嗪类化合物的合成影响,我们又构建了单敲菌株GP72ΔaurR、双敲菌株GP72ΔaurIΔaurR。发酵结果显示,GP72ΔaurI、GP72ΔaurR、GP72ΔaurIΔaurR的吩嗪类化合物产量均为野生株的4倍左右,说明aurI和aurR基因二者共同作用调控吩嗪产量。构建包含吩嗪合成启动子的转录融合质粒,其β-半乳糖苷酶活性可以反应吩嗪合成启动子的转录水平。测定β-半乳糖苷酶活性,突变株的酶活是野生型酶活的4倍左右,由此证明aurI/aurR双元调控系统共同作用负调控吩嗪合成。为了研究吩嗪合成基因簇的双拷贝对吩嗪类化合物产量的影响,在GP72野生型中过表达吩嗪合成基因簇,发酵48 h后吩嗪类化合物产量达到407 mg/L,提高23倍左右,证明增加基因簇的拷贝数可以使吩嗪类化合物产量提高。利用pUC18-mini-Tn7T-Gm载体,通过位点特异重组的方法,在假单胞菌特有的glms基因下游整合一个基因簇,测序验证后发酵测吩嗪类化合物产量。和野生株相比,含有双倍吩嗪合成基因簇菌株的吩嗪类化合物产量无明显提高,整合在glms基因下游的基因簇不表达。绿针假单胞菌GP72具有良好的生防应用前景,本论文在一定程度上阐释了GP72中的调控机理,为全面了解绿针假单胞菌GP72的群体感应调控系统及其对吩嗪合成的调控机制提供了理论依据,在此基础上我们可以设计遗传改造的靶标,构建高产吩嗪类化合物的工程菌株。
曾艳华[6]（2018）在《AHL合成酶基因的多样性分布及其表达活性对缺氧环境的响应》文中提出以酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactone,AHL）作为信号分子的群体感应（Quorum sensing,QS）系统在革兰氏阴性细菌中分布最广,也是目前研究最多的QS系统。已有的关于细菌QS的研究大多基于实验室可培养的方法,且主要集中在QS系统对下游基因与菌群生理行为的调控方面。传统可培养方法的局限性加之目前缺乏AHL合成酶基因的通用引物,限制了我们对基于AHL的QS系统在生态环境中分布及多样性的认识。本文首先设计了一对针对土壤中代表性细菌-根瘤菌科（Rhizobiacae）的AHL合成酶基因的通用引物,并将这对引物分别应用于陆生与湿地植物根际微生物群落,发现不同植物根际所处生境对AHL合成酶基因的分布与多样性有很大影响,其中环境因素尤其是O2很可能起着重要的影响作用。缺氧环境在自然界中普遍存在,然而自然环境中O2浓度的变化是如何影响细菌QS系统基因表达和信号分子合成的目前还不清楚。研究缺氧环境下细菌QS系统的变化可以为定向调控细菌下游生理行为,特别是与污染物修复相关的生理活动提供重要的环境因素依据。为了研究缺氧环境对细菌QS系统的影响,本文从获取具有环境修复价值的研究对象出发进行了菌株的筛选,筛选标准是具有芳香烃降解潜力的AHL产生菌,得到如下结论:具有芳香烃降解与AHL合成双重潜力的细菌在系统分类上具有高度多样性,在被调查的688株Proteobacteria中,超过11%的细菌基因组中同时含有环羟化双加氧酶（ringhydroxylatingdioxygenase,RHD）和AHL合成酶基因;利用富集筛选的方法,从海洋、湿地植物根际以及土壤等环境中筛选到10株既能降解菲或芘又能产AHL的细菌,其中6株属于鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales）,四株属于根瘤菌目（Rhizobiales）,而这两类细菌在基因组搜索法得到的数据中同样也是优势菌群。分别从以上优势菌群Rhizobiacae和Sphingomonads中选取了具有污染修复潜力的代表性菌株Ensifer adhaerens X097 和Novosphingobium pentaromnaicivorans US6-1作为研究对象,详细表征了两株菌的QS系统,并分别以平板生物膜和静置培养方式作为缺氧环境的代表,研究了缺氧环境对两株细菌AHL合成酶基因表达与AHL合成的影响。得到的主要结论有:（1）在X097和US6-1中,两种缺氧环境均促进了 AHL的合成与AHL合成酶基因的表达。（2）在X097中,位于质粒上的ensIl和ensI2基因分别负责合成多种中短链的AHL,而染色体上ensI3负责合成一种长链的C14-HSL;通过SWISS-MODEL预测的AHL合成酶的三级结构中,质粒上的EnsI1和EnsI2的三级结构更相似,说明质粒和染色体上的AHL合成酶在系统进化、产物合成以及蛋白质三级结构三个方面都显示出很大差异;在缺氧环境下,X097合成的AHL信号分子的种类更多,AHL合成酶基因表达量更高,而且质粒上的AHL合成酶基因比染色体上的对缺氧环境的响应更敏感。（3）US6-1基因组中含有一对novI/novR,当分别敲除ovI或novR后,US6-1均不再合成AHL;US6-1静置培养合成的、以及外源添加的AHL都会在生长期后期被US6-1当作碳、氮源利用,说明US6-1兼具AHL合成和淬灭的能力;US6-1在振荡培养条件下不能合成AHL,而在静置培养条件下可以合成多种AHL,其机制在于有氧环境下novI只有很低水平的转录,缺氧环境则促进了novI的转录和表达,而novR的表达在两种环境下没有显着性差异;（4）探究了两类 O2 响应因子 fnr（fumarate nitrate regulator）和hk（histidine kinase）基因敲除对US6-1合成A1HL的影响,发现缺氧环境下单个fnr的敲除对AHL合成基本无影响,同时敲除任意两个fnr均会提高AHL的产量,同时敲除三个fnr减慢了 AHL的降解速率。位于质粒上的hk3的敲除对AHL合成的影响很小,染色体上的hk1或hk2的敲除虽使AHL的合成提前却降低了 AHL的产量,基因敲除实验的结果共同表明,多个氧气响应因子介导了菌株US6-1的QS系统对缺氧环境的响应;（5）根据转录组测序数据预测到脂肪酸合成途径中的两个关键基因fabZ和fabK在缺氧环境下可能会影响US6-1合成AHL;缺氧环境下由于novI基因表达量的变化会导致很多下游基因的表达量出现显着性变化,包括一系列与环境应激相关的基因,如金属铜和亚碲酸盐矿物耐受基因,以及可能参与PAHs、苯甲酸、氨基苯甲酸酯,阿特拉津等降解代谢的基因等。（6）比较了静置培养条件下菌株US6-1与novI缺失突变株的菲降解率,发现缺氧胁迫下AHL合成酶基因的缺失显着性降低了菌株US6-1对菲的降解率。
黄宇萍[7]（2017）在《CRISPR/Cas9系统介导的小菜蛾（Plutella xylostella）基因编辑》文中提出小菜蛾Plutella xylostella（L.）是重要的世界性农业害虫,主要危害十字花科蔬菜。该虫世代周期短、重叠严重,基因组杂合度高,在高强度的杀虫剂选择压力下,抗药性发展迅速,防治愈发困难。自基因组破译以来,由于缺乏高效的遗传操作平台,小菜蛾的遗传研究进展缓慢。由于其灵活性与适应性,CRISPR/Cas9技术已在功能基因组学、转基因生物构建、转录调控以及基因治疗等研究领域发挥巨大作用,成为基因组编辑的主导技术。在小菜蛾中建立基于CRISPR/Cas9系统的高效遗传操作技术体系,可应用于其基因功能研究乃至种群的遗传调控。因此,结合已有的资源（基因组数据）优势,本论文基于CRISPR/Cas9技术在小菜蛾中进行了相关研究,获得以下成果:1.率先在小菜蛾中应用CRISPR/Cas9技术实现内源基因Pxabd-A的敲除。Pxabd-A在小菜蛾中存在不同的剪切体（isoform A与isoformB）,其序列仅在Ⅱ号外显子上存在五个氨基酸（DFPFP）的差异。表达谱分析表明,Pxabd-A在生长发育的各个时期均有表达,以蛹期表达量最高。通过直接注射体外转录的Cas9 mRNA和基因特异性sgRNA的方法对Pxabd-A进行编辑,可介导目标位点的插入与缺失突变,且G0代的嵌合体突变率达90%。嵌合体幼虫呈现腹节及腹足发育畸形,成虫表现为生殖器发育缺陷。该实验利用CRISPR/Cas9系统可获得生殖系基因敲除的小菜蛾,且Pxabd-A缺失的表型和基因变异均可稳定遗传至下一代,同时解析了该基因在小菜蛾腹节与生殖器发育过程中的重要作用。2.利用CRISPR/Cas9系统对小菜蛾内源基因PxAntp与PxUbx进行编辑,验证该系统在小菜蛾中进行基因编辑的普遍性。直接注射体外转录的Cas9 mRNA与sgRNA靶向基因（PxAntp与PxUbx）,可成功介导靶基因的定点编辑,呈现相应的突变表型:PxAntp突变后的幼虫,其T1、T2胸节发育异常,T2具有T1胸节的某些特征,进而影响蛹的形态和成虫翅的发育;在突变的PxUbx幼虫中,其T1-3胸节的界限被打破,皱缩或扭曲,影响成虫翅的发育。畸形个体的突变检测显示在靶点序列附近存在不同形式的插入或缺失突变。这些结果证明了 CRISPR/Cas9系统可对小菜蛾内源基因PxAntp与PxUbx进行编辑,诱导表型效应。在一定程度上,该系统可替代目前在鳞翅目中广泛应用但效率较低的RNAi策略,用于基因的功能分析。3.鉴定小菜蛾内源的U6启动子并用于小RNA的表达。本实验鉴定了 6个PxU6启动子（PxU6:1-6）,均含有Pol Ⅲ型启动子的基本特征元件:PSEA和TATA box。在小菜蛾细胞系中,不同的PxU6启动子均可驱动shRNA表达,介导EGFP的沉默。其中PxU6:3启动子驱动表达的效率最强。基于PxU6启动子的shRNA表达质粒可以用于细胞系内的shRNA的筛选及全基因组建库。4.U6:sgRNA表达质粒参与介导小菜蛾细胞（in vitro）与个体（in vivo）水平的基因定点编辑。将PxU6:3:sgRNA与Cas9表达质粒直接转染细胞,可高效介导小菜蛾细胞系中EGFP敲除。此外,PxU6:3启动子可在小菜蛾体内驱动sgRNA的表达以指导Cas9蛋白完成对Pxabd-A靶点序列的切割,介导基因突变从而诱发可稳定遗传的表型。内源性的U6启动子高效驱动sgRNA在细胞系和体内转录,可为细胞系中进行全基因组的sgRNA筛选以及转基因CRISPR/Cas9在小菜蛾中的建立奠定基础。5.tRNA-gRNA表达策略的应用及CRISPR衍生的gene drive系统的构建。利用果蝇和水稻的tRNAGly来构建PxU6:3:tRNA:sgRNA-abd-A表达质粒,注射该表达质粒至小菜蛾胚胎中,sgRNA可被转录释放并指导Cas9蛋白靶向Pxabd-A,引起靶点突变,产生的表型与注射体外转录的sgRNA所介导的一致。在小菜蛾中应用tRNA-sgRNA表达策略,可打破靶点和启动子的限制,使得CRISPR多位点编辑更为便利,并为可调控的CRISPR/Cas9系统在小菜蛾中的应用奠定基础。此外,实验通过鉴定的PxU6:3启动子驱动sgRNA靶向Px016319,尝试着在小菜蛾内构建基于CRISPR的gene drive系统,为隐性基因功能的研究及害虫遗传调控策略的建立奠定基础。综上所述,本研究初步建立了适用于小菜蛾的基因组编辑技术平台。首次利用CRISPR/Cas9系统对非模式昆虫小菜蛾的内源基因进行编辑,获得稳定突变品系;鉴定了物种特异性的内源PxU6启动子,在细胞系和小菜蛾体内驱动小RNA的表达介导基因沉默或敲除。鉴定的PxU6启动子为转基因CRISPR/Cas9以及gene drive系统在小菜蛾中的构建与应用奠定了基础,将促进小菜蛾基因功能研究及种群调控的研究。
何伟[8]（2016）在《特异型细菌发光传感器的构建及其对土壤汞、菲复合污染检测的应用研究》文中认为随着经济和社会发展,大量化石能源的燃烧利用,以及污灌、泄漏、治理不善,使得汞、菲污染程度逐年增加。以汞、菲分别作为代表的重金属和多环芳烃污染在土壤环境中的影响非常巨大。除了一部分汞、菲污染能够以气态形式进入全球大气环流外,90%的污染物则通过沉降,以复合污染的形式存赋于土壤环境中,并对土壤生态造成危害。由于土壤环境复杂,该类复合污染物在土壤中的实际生物有效性,尤其是对土壤微生物的有效性十分复杂,因此评价起来也十分困难。作为传统化学分析和毒性检验的有益补充,生物传感器尤其是基于基因工程微生物构建的全细胞生物传感器（EMWCB）,已经用于各种环境样品中的污染物生物有效性评价。与化学分析法不同,利用EMWCBs不仅能够定性亚致死剂量下的环境毒物,还可以定量或半定量测定污染物的生物有效性,因此能够提供更多的生物学相关信息。同时,该类传感器具有相对较高的底物特异性,能更好地反映复合污染中的不同物质,免受其他物质的干扰。目前,利用特异型报告菌评价实际土壤样品中复合汞、菲污染物的生物有效性仍属于空白。另外,虽然EMWCBs在时间和经济成本上具有优势,但如何提高汞、菲特异型微生物传感器的遗传稳定性,如何在保持细胞活力的同时最大可能地降低最低检测限,以及如何将其应用于受复合污染的实际土壤样品的检测,都仍是需要解决的问题。因此,基于前期的污染物降解及抗逆微生物的分离筛选,本研究以土壤汞、菲单一及复合污染为模型,采用特异型发光微生物传感器对其进行生物有效性评价。从多角度阐述该技术的可靠性、适用性,分析实际土壤环境中汞、菲的微生物有效性特点,同时探讨影响土壤汞、菲生物有效性的因素和作用机制。首先,本研究融合构建了以汞诱导调控基因与特异型启动子及绿色荧光蛋白基因的信号表达系统merR-PmerT-egfp,并通过三亲结合将该报告系统转座插入到Pseudomonas putida染色体DNA的报告菌BMB-ME。同时也构建了基于芳香族化合物诱导调控基因phnR与特异性启动子PphnS以及荧光素酶基因luxCDABE的报告菌BMB-PL。无论报告基因系统是否存在于染色体DNA上还是构建在质粒载体上,宿主菌均能在分别有汞、菲污染物为底物时表达绿色荧光蛋白或荧光素酶,并激发或自发强烈荧光信号。报告菌BMB-ME对连续剂量的Hg处理表现出强烈的底物特异性,且该系列报告菌能特异性地对Hg2+识别并表达强烈的荧光信号,其信号表达强度显着高于其他HM离子诱导（P<0.01）。报告菌BMB-PL对细胞色素P450处理6h 50mg·L-1的低环PAH:萘、蒽、菲及其代谢产物水杨酸时,菲的RLU显着高于其他低环PAHs（P<0.05）。将报告菌进行海藻酸钙包埋和滤纸片吸附固定化,菌体活力在一周内能稳定保存。该研究首次构建了基于细菌染色体的light-on型全细胞微生物传感器,提高了报告菌的遗传稳定性和底物特异型,并且优化和建立了对汞、菲单一及复合污染生物有效性评价的实验测定方法。为该技术的实际应用典型了基础。接着,本研究以典型的江西红壤为模型,对其中的汞、菲单一以及复合污染物的生物有效性用所构建的报告菌进行了效能评价。其中,在模拟原位的条件下对红壤样品中的汞、菲进行设置了总碳,工作时间,含水量和温度四个主要影响因素各三个水平的正交实验,确定了报告菌BMB-ME和BMB-PL最佳工作条件。同时,对单一及复合Hg、PHE处理红壤中污染物生物有效性进行了检测。结果表明0-60 mg kg-1 PHE和0-240μg kg-1 Hg2+处理的红壤样品中,复合污染条件下的Hg生物有效性曲线变化不明显,而PHE的生物有效性受Hg干扰较大。因此,我们又对红壤中不同组分的Hg进行了提取,并分别用冷原子吸收和BMB-ME对其做定量测定。结果发现残渣态汞是土壤中汞污染的主要存在形态,其含量约占汞污染总量的30%。但Hg的生物有效性则由剩下的不足10%的BA汞和15%的水溶性残汞所主导。另外,在15天和30天不同老化时间水平上,无论是高剂量处理（100μgkg-1）还是低剂量处理（10μg kg-1）的各组分汞污染物均呈生物有效性下降趋势。我们还分别进行了 CVAAS、RP-HPLC和报告菌法对汞、菲的测定比较。报告菌BMB-ME能一定浓度范围内对红壤汞污染进行定量测定,且与分析法对汞的检出率在0.05水平上不存在差异。而BMB-PL虽然报告能在0-240 μg kg-1范围内反映污染物的浓度变化趋势,但与分析法仍有较大差距,其PHE检出率仅为分析法的10-20%。该部分研究首次建立和优化了模拟近原位条件下全细胞微生物传感器对土壤复合汞、菲污染物生物有效性的评价技术体系,并且加深了复合污染条件下的生物有效态污染物的相互作用认识。然后,本研究采用BMB-ME1和BMB-PL在标准土壤样品GSF-1中拟合了汞、菲污染物生物有效性的sigmoid特征曲线,并计算了报告菌的检测限（约19.6～111.63μg·kg-1 b-Hg和21.5～110.9μg·kg-1 b-PHE）。本研究接着针对南京、上海、宁波三处大型石化炼油企业周边和长三角地区（苏、浙、沪）土壤进行大规模采样,并用报告菌对其中汞、菲污染物生物有效性进行评价,同时以GC-MS和CVAAS等分析手段对测定结果进行验证。结果表明,污染物总量与其有效态含量在变化趋势上呈极显着相关,污染物生物有效性约占其化学总量的10%。另外,NJ和NB两地的炼油厂土壤中b-Hg检出率分别为35%和80%,其中NJ样品中b-Hg的最高含量为84.4 μg·kg-1,均显着高于SH和非炼油厂周边土壤。SH炼油厂周边土壤中b-PHE检出率达到了 60%,且其最高含量达到了 63μg·kg-1,而b-Hg的含量则较低。25个长三角随机样点采集到的土壤样品中b-Hg和b-PHE的检出率分别为35%和0%,该结果表明长三角地区土壤b-Hg分布范围大,污染程度严重;而土壤b-PHE污染程度相对较轻,且分布主要集中在重化工污染企业周边土壤中。同时,本研究还将长三角人口和三年大气PM10污染空间分布数据进行了插值处理,并与b-Hg、b-PHE数据进行比较。研究发现,长三角地区土壤中b-PHE变化和空间分布与人口密度相关不显着,而土壤中b-Hg含量的高低与人口密度分布关系密切。PM10分布似乎对b-PHE影响很小,几乎所有的高浓度b-PHE集中在炼油厂场地土壤。而PM10对YRD 土壤b-Hg的分布及浓度具有显着的影响。由西到东,b-Hg随PM10呈明显的下降趋势。该研究结果一方面首次验证了报告菌法用于大范围环境调查的可行性,另一方面也首次在大尺度上发现了土壤汞、菲的生物有效性空间地理分布特点和规律,为重点区域典型环境污染物的生物有效性评价提供了重要的参考。最后,本研究以典型江西红壤为模型,还分别设计了种植水稻、油菜、花生、未种植作物的农田红壤单一、复合污染处理。同时以固定剂量和连续剂量污染实验以模拟污水灌溉的不同情况。基于前期构建的全细胞细菌传感器,并结合土壤酶活力、土壤DGGE结果,开展了不同种植作物的红壤多样性进行RDA或CCA分析,对一定时间农田污染物的生物有效性和生态毒性的综合评价。研究发现,污染物的生物有效性与污染时间在细菌群落变化水平上均呈负相关。另外,固定剂量Hg、PHE污染的各种红壤中微生物种群无显着差异,而当连续剂量Hg污染时,种植了水稻的红壤中的微生物种群与未种植作物的微生物种群有显着差异,且前者与b-Hg负相关明显。这说明种植了水稻的红壤能够在一定程度上缓解连续剂量的汞污染,其抗性显着高于种植了花生、油菜和未种植作物的红壤。该结果全面客观地反映了作物种植类型对Hg、PHE污染物毒性的缓解作用特点;首次利用综合手段对土壤微生物及污染物的生物有效性进行分析;基本建立了以污染物生物有效性来评价土壤健康状况的新体系;发现了水稻土能够在细菌多样性水平上缓解Hg、PHE污染的一般规律。对受污染的农田质量改造具有一定的指导意义。总之,本研究基于特异型细菌发光传感器,以汞、菲为典型的重金属和多环芳烃污染物为代表,对其在土壤中的单一及复合污染生物有效性评价进行了方法的建立、效果的评价、实际环境样品的测定和污染物生物有效性与土壤细菌群落的变化关系研究。从多角度阐述了土壤汞、菲污染物的生物有效性特点和作用于土壤微生物群落的机制,为微生物发光传感器应用于土壤复合污染物生物有效性评价建立了可靠的理论和实践基础。
金凯明[9]（2016）在《基因组工程构建高产代谢产物农药申嗪霉素的细胞工厂》文中提出申嗪霉素是假单胞菌产生的一种次级代谢产物,化学名称为吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid,简称PCA）,能有效防治一系列重要农作物病害,如水稻纹枯病、瓜类蔓枯病和甜椒疫病等,具有高效、安全和对环境友好等特点。目前,主要通过微生物发酵的方法生产申嗪霉素。由于现有工程菌株申嗪霉素发酵效价偏低,导致其生产和使用成本较高。因此,有必要开展基础与应用研究,提高合成效率,促进申嗪霉素在生产中的推广与应用。假单胞菌PA1201具有两个高度同源的申嗪霉素合成基因簇,其中phzC基因的生物学功能还不清楚。本研究发现PhzC蛋白属于II型3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP）合成酶。敲除phzC基因显着降低申嗪霉素产量,过表达phzC基因明显提高申嗪霉素产量。PhzC蛋白包含有两个DAHP合成酶结构域。过表达PhzC蛋白的C-末端结构域,申嗪霉素产量增加38%;过表达N-末端结构域对PCA产量没有影响。点突变分析发现7个潜在的活性位点和1个保守的氨基酸残基对PhzC蛋白的酶活性是必需的。另外,DAHP合成酶缺陷突变株在回补pBBR-phzC后,可以恢复菌株生长,且外源添加不同浓度申嗪霉素后不影响菌株生长。这些结果表明PhzC蛋白是DAHP合成酶,其酶活性不受申嗪霉素的反馈抑制。本研究对假单胞菌PA1201的申嗪霉素合成途径及次级代谢途径进行了系统地遗传和代谢改造,所得工程菌株PA-IV的申嗪霉素产量是野生型菌株的56倍。以“开源节流”的原则对PA1201基因组进行改造,所采用的策略如下:（1）敲除吩嗪修饰基因phzM、phzS和phzH,阻断申嗪霉素转化;（2）置换aroG基因的启动子和单拷贝插入phzC基因,提高菌株的DAHP合成酶活性,使得更多的碳源流向莽草酸途径;（3）敲除或抑制其它分支酸利用途径,使得更多的分支酸流向申嗪霉素合成途径;（4）敲除5’-UTR和启动子置换,提高申嗪霉素合成基因簇phz1和phz2的表达;（5）用高活性启动子置换外排泵MexGHI-OpmD基因簇的启动子,加速申嗪霉素外排至细胞外;（6）叠加敲除21个非必需的次级代谢生物合成基因簇,减少细胞内冗余的代谢。工程菌株PA-IV进一步通过分批补料发酵后,申嗪霉素产量达到9882 mg/L。假单胞菌M18是目前申嗪霉素工业化生产菌株,其基因组全长为6327754-bp。本研究首先敲除M18基因组中的限制性修饰系统和CRISPR细菌免疫系统,显着提高了菌株的遗传转化效率,为后续遗传改造和基因组删减奠定了基础。其次,将5个菌株特异性基因组岛、2个前噬菌体和20个次级代谢生物合成基因簇系统敲除,减少了细胞内冗余的代谢和调控。最后,利用链特异性转录组测序技术,分析比较了M18全基因表达谱,结合必需基因数据,鉴定了22个低转录或不转录区域。叠加敲除其中13个大片段区域,最终获得基因组简化菌株MDS44,其基因组减少了740306-bp（占整个基因组的11.7%）。简化菌株MDS44的生长比野生型菌株略好,申嗪霉素产量是野生型菌株的5.45倍,转化效率显着提高,其它特性正在评估之中。本研究获得的申嗪霉素高产菌株PA-IV将能显着降低申嗪霉素的生产成本,促进其推广应用。基因组简化菌株MDS44具有良好的特性,为构建优势小基因组细胞工厂奠定了基础。
张巧铃[10]（2014）在《Bt生物被膜产生菌的筛选与鉴定》文中认为目前应用最为广泛的微生物杀虫剂之一——苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）,由于其田间应用持效期较短,进一步发展受到限制。主要原因之一是Bt易受外界环境因素（如紫外、高温、干旱等）和自身因素（如定殖、毒力等）的影响。生物被膜是细菌适应环境的一种特殊的生长状态,能调控细菌对环境胁迫的适应能力,与细菌的定殖、侵染、毒力等多种特性密切相关。本研究通过筛选并鉴定产生物被膜Bt菌株,旨在探索生物被膜对Bt生物防治效果的影响。本研究对88株Bt菌株进行生物被膜产生菌的筛选,获得了一株高效形成生物被膜的Bt菌株XL6,其分离自内蒙古自治区。Bt XL6菌株释放的伴胞晶体为菱形,存在晶胞粘连现象,只有1条23kb的质粒。Bt XL6菌株可以表达130kDa的原毒素,并且可被胰蛋白酶进一步消化形成60kDa的活性毒素。Bt XL6菌株中含有生物被膜相关基因约74种。此外,Bt XL6菌株在LBP、LB培养基气-液界面能形成清晰的膜状结构。进一步利用mini-Tn10转座子,构建Bt XL6菌株随机插入突变体库,筛选2株生物被膜形成能力显着降低的突变株,找到其插入位点。这2株突变株插入位点均位于ggedf基因上游。GGDEF结构域包含5个保守氨基酸,分别为甘氨酸2个、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸。与野生菌株Bt XL6相比,突变株的群游能力、生长速度下降。此外,通过同源重组验证了ggdef基因对生物被膜形成的影响。因此,ggdef基因调控生物被膜的形成。为了研究生物被膜的定殖,携带gfp基因的pSTK质粒电转化至Bt XL6菌株中。对数期的细胞能够在接触表面,甚至在根表面迅速形成生物被膜。本研究结果将为高效持久的Bt杀虫剂的研制提供研究思路。
二、应用gfp对盐单胞菌C6可能转座酶A基因启动区的鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用gfp对盐单胞菌C6可能转座酶A基因启动区的鉴定（论文提纲范文）
（1）原核生物Argonaute（pAgo）蛋白介导细菌基因组编辑及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 细菌经典遗传操作系统 |
| 1.2.1 转座酶系统 |
| 1.2.2 位点特异性重组系统 |
| 1.2.3 同源重组系统 |
| 1.3 基于新型基因编辑技术的细菌遗传操作系统研究进展 |
| 1.3.1 基于CRISPR/Cas9 基因编辑技术的细菌遗传操作系统研究进展 |
| 1.3.2 基于碱基编辑器的细菌遗传操作系统研究进展 |
| 1.4 原核生物Ago(pAgo)蛋白的研究进展 |
| 1.4.1 Ago蛋白概述 |
| 1.4.2 Ago蛋白介导RNA干扰 |
| 1.4.3 pAgo蛋白的DNA水解酶活性 |
| 1.4.4 pAgo蛋白在基因编辑中的应用 |
| 第二章 研究目的及意义 |
| 第三章 材料和方法 |
| 3.1 质粒、菌株及其培养条件 |
| 3.2 主要试剂耗材 |
| 3.3 实验仪器 |
| 3.4 培养基配制 |
| 3.5 主要试剂配制 |
| 3.5.1 主要缓冲液 |
| 3.5.2 蛋白表达及纯化试剂 |
| 3.5.3 SDS-PAGE及 Western Blot相关试剂 |
| 3.5.4 IP及 Chip实验试剂 |
| 3.6 引物设计及基因合成 |
| 3.7 NgAgo系统能否介导大肠杆菌靶基因缺失的研究 |
| 3.7.1 大肠杆菌aste基因敲除的相关质粒的构建 |
| 3.7.2 NgAgo能否介导大肠杆菌aste基因缺失的检测 |
| 3.8 NgAgo介导细菌基因敲除是否依赖g DNA靶向的DNA酶活性的研究 |
| 3.8.1 DNA酶活性位点突变的NgAgo相关质粒的构建 |
| 3.8.2 DNA酶活性位点突变的NgAgo能否介导GX-PM基因缺失的检测 |
| 3.8.3 T7E1 方法检测NgAgo蛋白的DNA酶活性 |
| 3.8.4 不引入外源g DNA时 NgAgo能否介导GX-PM靶基因缺失的检测 |
| 3.8.5 NgAgo介导细菌靶基因敲除是否依赖提高同源重组效应的检测 |
| 3.9 NgAgo提高同源重组效率的机制研究 |
| 3.9.1 NgAgo蛋白两端融合Flag标签是否影响其介导基因缺失的检测 |
| 3.9.2 应用IP偶联质谱方法鉴定NgAgo在细菌中的互作蛋白 |
| 3.9.3 Co-IP检测NgAgo蛋白与细菌内源性recA的互作 |
| 3.9.4 Co-IP检测DNase I处理后NgAgo蛋白与recA的互作 |
| 3.9.5 重组蛋白recA及 NgAgo的原核表达质粒的构建 |
| 3.9.6 重组蛋白recA及 NgAgo的表达及纯化 |
| 3.9.7 重组蛋白NgAgo与 recA互作的检测 |
| 3.9.8 SPR方法检测重组蛋白NgAgo与 recA的互作亲和力 |
| 3.9.9 EMSA方法检测NgAgo蛋白能否增加recA蛋白与ss DNA的结合 |
| 3.9.10 NgAgo蛋白能否增强recA蛋白介导的DNA链交换能力的检测 |
| 3.9.11 Chip-q PCR方法检测NgAgo蛋白能否增加recA与细菌内同源靶序列的结合 |
| 3.10 NgAgo介导细菌基因组编辑的主要结构域的相关研究 |
| 3.10.1 NgAgo蛋白的截短体能否介导GX-PM靶基因缺失的检测 |
| 3.10.2 NgAgo不同截短体能否与recA互作的检测 |
| 3.10.3 DNA酶活性位点突变的NgAgo蛋白C端能否介导细菌靶基因缺失的检测 |
| 3.10.4 DNA酶活性位点突变的NgAgo蛋白C端与recA互作的检测 |
| 3.10.5 DNA酶活性位点突变的NgAgo蛋白C端能否增强recA介导的同源重组效率的检测 |
| 3.10.6 NgAgo蛋白MID及 PIWI结构域介导GX-PM靶基因缺失的检测 |
| 3.10.7 NgAgo蛋白MID及 PIWI结构域与recA互作的检测 |
| 3.11 不同原核生物Ago蛋白能否介导细菌基因组编辑的相关研究 |
| 3.11.1 不同pAgo蛋白介导GX-PM靶基因缺失相关质粒的构建 |
| 3.11.2 不同pAgo蛋白能否介导GX-PM菌株靶基因缺失的检测 |
| 3.11.3 不同pAgo蛋白能否与细菌recA互作的检测 |
| 3.11.4 DNA酶活性位点突变的pAgo蛋白相关质粒的构建 |
| 3.11.5 DNA酶活性位点突变的pAgo能否介导细菌基因缺失的检测 |
| 3.11.6 DNA酶活性位点突变的pAgo与细菌recA互作的检测 |
| 3.12 数据统计分析 |
| 第四章 结果与分析 |
| 4.1 NgAgo介导不同细菌靶基因的敲除 |
| 4.1.1 敲除大肠杆菌aste基因的相关质粒的构建 |
| 4.1.2 NgAgo介导大肠杆菌aste基因的缺失 |
| 4.2 NgAgo介导细菌基因缺失不依赖自身DNA酶活性及外源g DNA |
| 4.2.1 NgAgo蛋白的DNA酶活性位点突变质粒的构建 |
| 4.2.2 NgAgo介导细菌靶基因缺失不依赖自身DNA酶活性 |
| 4.2.3 NgAgo介导细菌靶基因缺失不依赖外源g DNA |
| 4.2.4 NgAgo介导细菌靶基因敲除依赖于提高同源重组效应 |
| 4.3 NgAgo增强recA介导的同源重组效率 |
| 4.3.1 NgAgo蛋白两端融合Flag标签不影响其介导细菌靶基因缺失 |
| 4.3.2 细菌中NgAgo互作蛋白的鉴定分析 |
| 4.3.3 NgAgo蛋白与细菌内源性recA互作 |
| 4.3.4 NgAgo蛋白与内源性recA蛋白互作不受DNase I的影响 |
| 4.3.5 重组蛋白recA及 NgAgo表达质粒的构建 |
| 4.3.6 重组蛋白recA及 NgAgo的纯化 |
| 4.3.7 重组蛋白NgAgo与 recA直接互作 |
| 4.3.8 重组蛋白NgAgo与 ErecA互作亲和力的分析 |
| 4.3.9 重组蛋白NgAgo与 PmrecA互作亲和力的分析 |
| 4.3.10 NgAgo蛋白并不能显着增加recA蛋白与ss DNA的结合 |
| 4.3.11 NgAgo蛋白能显着增强recA蛋白介导的DNA链交换能力 |
| 4.3.12 NgAgo蛋白能显着增加recA与细菌内同源靶序列的结合 |
| 4.4 NgAgo介导细菌基因组编辑的主要结构域的鉴定 |
| 4.4.1 C端是NgAgo介导细菌基因缺失的主要区域 |
| 4.4.2 NgAgo蛋白C端介导不同细菌基因缺失不依赖自身DNA酶活性 |
| 4.4.3 DNA酶活性位点突变的NgAgo蛋白C端同样显着增强recA介导的同源重组效应 |
| 4.4.4 PIWI结构域是NgAgo介导细菌基因组编辑的主要结构域 |
| 4.5 原核生物Ago蛋白均能介导细菌基因组编辑且不依赖DNA酶活性 |
| 4.5.1 不同pAgo蛋白介导细菌基因缺失相关质粒的构建 |
| 4.5.2 不同pAgo蛋白介导细菌靶基因的缺失 |
| 4.5.3 不同pAgo蛋白与细菌recA互作 |
| 4.5.4 不同pAgo蛋白的DNA酶活性位点突变质粒的构建 |
| 4.5.5 不同pAgo介导细菌基因组编辑不依赖自身DNA酶活性 |
| 4.5.6 DNA酶活性位点突变的Tt Ago蛋白与细菌recA互作 |
| 4.5.7 DNA酶活性位点突变的Aa Ago蛋白与细菌recA互作 |
| 第五章 讨论 |
| 5.1 pAgo介导细菌基因组编辑的机制 |
| 5.2 pAgo作为细菌遗传操作工具的优势 |
| 5.3 pAgo蛋白应用前景的展望 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 附录三 |
| 附录四 |
| 个人资料 |
| 致谢 |
（2）拮抗细菌Burkholderia seminalis R456的铁代谢及其调控机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述——细菌铁代谢与其调控机制的研究进展 |
| 1.1 细菌铁代谢的嗜铁素途径 |
| 1.1.1 ornibactin运输的铁代谢通路 |
| 1.1.2 pyochelin运输的铁代谢通路 |
| 1.1.3 不同嗜铁素之间的协调机制 |
| 1.1.4 嗜铁素直接参与的拮抗等功能 |
| 1.2 细菌铁代谢的Fur调控 |
| 1.2.1 Fur蛋白的结构 |
| 1.2.2 Fur蛋白的调控机制 |
| 1.2.3 调控Fur表达的机制 |
| 1.2.4 Fur-box |
| 1.3 HGT驱动的铁代谢进化 |
| 1.3.1 嗜铁素合成基因NRPS的 HGT进化 |
| 1.3.2 铁吸收转运的HGT进化 |
| 1.3.3 HGT间接影响铁代谢 |
| 1.3.4 HGT的检测方法 |
| 1.4 NRPS途径合成嗜铁素参与铁代谢 |
| 1.4.1 NRPS和 PKS的组成 |
| 1.4.2 嗜铁素相关NRPS的检索 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 水平转移基因簇(NRPS-R456)参与嗜铁素合成的全局调控 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 培养基与试剂 |
| 2.1.3 细菌基因组DNA提取和质粒提取 |
| 2.1.4 PCR体系 |
| 2.1.5 酶切及连接反应 |
| 2.1.6 热激转化实验 |
| 2.1.7 电击转化实验 |
| 2.1.8 嗜铁素基因簇的生物信息学分析 |
| 2.1.9 突变体和回补体构建 |
| 2.1.10 荧光定量PCR |
| 2.1.11 CAS检测总嗜铁素的合成 |
| 2.1.12 一步生长曲线 |
| 2.1.13 生物膜检测 |
| 2.1.14 游动性检测 |
| 2.1.15 嗜铁素的分离纯化 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 生信鉴定NRPS-R456来源于藻类 |
| 2.2.2 拮抗菌株R456对铁胁迫具有适应性 |
| 2.2.3 NRPS-R456能够影响嗜铁素合成 |
| 2.2.4 NRPS-R456能够影响游动性和生物膜合成 |
| 2.2.5 NRPS-R456影响铁胁迫下的生长速率 |
| 2.2.6 NRPS-R456合成一种新型嗜铁素 |
| 2.2.7 NRPS-R456 影响ornibactin和 pyochelin的合成 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 Fur与 NRPS-R456 的相互作用及其在铁代谢中的作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株和载体 |
| 3.1.2 培养基与试剂 |
| 3.1.3 细菌基因组DNA提取和质粒提取 |
| 3.1.4 PCR体系 |
| 3.1.5 酶切及连接反应 |
| 3.1.6 热激转化实验和电击转化实验 |
| 3.1.7 Fur蛋白的生物信息学分析 |
| 3.1.8 突变体和回补体的构建 |
| 3.1.9 一步生长曲线 |
| 3.1.10 ICP-MS测定胞内铁含量 |
| 3.1.11 H2O2耐受性检测 |
| 3.1.12 过氧化氢酶CAT的酶活测定 |
| 3.1.13 Fur原核表达,纯化及抗体制备 |
| 3.1.14 Western blot检测Fur蛋白的表达 |
| 3.1.15 免疫蛋白共沉淀钓取互作蛋白 |
| 3.1.16 细菌双杂 |
| 3.1.17 荧光定量PCR鉴定fur基因的表达 |
| 3.1.18 酵母单杂 |
| 3.1.19 细胞质蛋白的提取,和质谱分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 生信分析确定Fur的蛋白结构 |
| 3.2.2 Fur突变影响在铁胁迫下的生长速率 |
| 3.2.3 Fur缺失上调高铁条件下的胞内铁浓度 |
| 3.2.4 Fur缺失降低过氧化氢耐受性 |
| 3.2.5 Fur缺失降低过氧化氢酶活 |
| 3.2.6 Fur与 NRPS-R456 基因簇的表达有关 |
| 3.2.7 酵母单杂验证Fur对 NRPS-R456 存在调控 |
| 3.2.8 蛋白质谱鉴定Fur突变下调NRPS蛋白的表达 |
| 3.2.9 免疫蛋白共沉淀钓取Fur的互作蛋白 |
| 3.2.10 细菌双杂验证钓取蛋白和Fur存在互作 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 转座插入鉴定出NRPS-R456调控的铁代谢与其拮抗功能相关 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细菌和载体 |
| 4.1.2 培养基与试剂 |
| 4.1.3 细菌基因组DNA提取和质粒提取 |
| 4.1.4 PCR体系 |
| 4.1.5 酶切及连接反应 |
| 4.1.6 热激转化实验和电击转化实验 |
| 4.1.7 转座子突变体库的构建 |
| 4.1.8 转座子转化成功的鉴定 |
| 4.1.9 反向PCR鉴定转座子的插入位点 |
| 4.1.10 突变体与回补体的构建 |
| 4.1.11 一步生长曲线 |
| 4.1.12 拮抗效果检测 |
| 4.1.13 过氧化氢耐受性检测 |
| 4.1.14 游动性和生物膜检测 |
| 4.1.15 荧光定量PCR鉴定铁代谢相关基因的表达 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 成功构建R456转座子突变体库 |
| 4.2.2 筛选出多个铁代谢和拮抗功能减弱突变体 |
| 4.2.3 NRPS-R456转座突变体的双重表型减弱 |
| 4.2.4 NRPS-R456与ΔR456_584 的铁代谢减弱有关 |
| 4.2.5 NRPS-R456转座突变对菌株生长无明显影响 |
| 4.2.6 NRPS-R456转座突变后过氧化氢耐受性降低 |
| 4.2.7 NRPS-R456转座突变后生物膜合成明显减弱 |
| 4.2.8 NRPS-R456转座突变后游动性明显减弱 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 全文小结与研究展望 |
| 5.1 全文小结 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 本研究用到的菌株和质粒 |
| 附录2 本研究用到的PCR引物列表 |
| 附录3 ornibactin同系衍生物质谱及结构分析 |
| 附录4 缩略词对照表 |
| 附录5 蛋白质非标定量质谱鉴定出的差异蛋白 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）DSF群体淬灭菌Pseudomonas sp. HS-18的分离鉴定及其淬灭机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 农药的滥用及细菌抗药性的危害 |
| 1.2 细菌群体感应研究概况 |
| 1.3 革兰氏阳性细菌的群体感应研究概况 |
| 1.4 革兰氏阴性细菌的群体感应研究概况 |
| 1.4.1 AHL群体感应系统研究概况 |
| 1.4.2 DSF群体感应系统研究概况 |
| 1.4.3 HHQ和 PQS群体感应系统研究概况 |
| 1.4.4 3-OH-PAME群体感应系统研究概况 |
| 1.4.5 IQS群体感应系统研究概况 |
| 1.4.6 AI-2群体感应系统研究概况 |
| 1.4.7 其它群体感应系统研究概况 |
| 1.5 群体淬灭研究概况 |
| 1.6 革兰氏阳性细菌群体淬灭研究概况 |
| 1.7 革兰氏阴性细菌群体淬灭研究概况 |
| 1.7.1 针对AHL家族信号的群体淬灭研究概况 |
| 1.7.2 针对DSF家族信号的群体淬灭研究概况 |
| 1.7.3 针对PQS家族信号的群体淬灭研究概况 |
| 1.7.4 针对3-OH-PAME家族信号的群体淬灭研究概况 |
| 1.7.5 针对AI-2家族信号的群体淬灭研究概况 |
| 1.8 本项目研究目的、思路与意义 |
| 第二章 DSF淬灭菌的分离、筛选与鉴定及淬灭特性的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 实验仪器与试剂材料 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 引物 |
| 2.2.5 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 采集样本中细菌的分离 |
| 2.3.2 具有DSF淬灭能力的细菌的初筛 |
| 2.3.3 具有DSF淬灭能力的细菌的复筛 |
| 2.3.4 测定HS-18对XC1的生物防治效果 |
| 2.3.5 菌株HS-18的鉴定 |
| 2.3.6 菌株HS-18系统发育树的构建 |
| 2.3.7 HS-18淬灭性能的测定 |
| 2.4 结论与讨论 |
| 第三章 DSF淬灭菌Pseudomonas sp.HS-18 基因组测序及分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 实验仪器与试剂材料 |
| 3.2.3 引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细菌基因组DNA的提取 |
| 3.3.2 细菌基因组DNA质量检测 |
| 3.3.3 基因组测序策略 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 HS-18基因组DNA的提取 |
| 3.4.2 基因组测序及分析情况 |
| 3.5 结论与讨论 |
| 第四章 HS-18中淬灭基因的与淬灭酶的鉴定与功能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株与质粒 |
| 4.2.2 实验仪器与试剂材料 |
| 4.2.3 培养基 |
| 4.2.4 引物 |
| 4.2.5 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 菌株HS-18抗性筛选结果 |
| 4.3.2 DSF淬灭基因的定位及相关序列的扩增 |
| 4.3.3 dig的敲除与互补 |
| 4.3.4 dig缺失突变体与互补体的生长曲线 |
| 4.3.5 dig缺失突变体与互补体对DSF淬灭效果检验 |
| 4.3.6 异源表达dig的 DH5α对 DSF淬灭效果检验 |
| 4.3.7 BL21(DE3)-p ET28b-dig中 Dig重组酶的表达和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果 |
| 4.3.8 BL21(DE3)-p ET28b-dig-中Dig的蛋白表达对DSF淬灭效果检验 |
| 4.3.9 Dig在大肠杆菌BL21(DE3)中的纯化 |
| 4.4 结论与讨论 |
| 第五章 HS-18在DSF诱导下的dig表达量分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株与质粒 |
| 5.2.2 实验仪器与试剂材料 |
| 5.2.3 培养基 |
| 5.2.4 引物 |
| 5.2.5 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 用于提取RNA的HS-18的培养结果 |
| 5.3.2 HS-18在DSF诱导条件下总RNA的提取 |
| 5.3.3 实时荧光定量PCR(q-RT PCR)验证结果 |
| 5.3.4 HS-18中Pdig-lac Z融合子的构建 |
| 5.3.5 DSF对 dig启动子的诱导作用的β-半乳糖苷酶活性检测结果 |
| 5.4 结论与讨论 |
| 第六章 dig对致病菌毒力因子产量的影响及生物防治作用 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌株与质粒 |
| 6.2.2 实验仪器与试剂材料 |
| 6.2.3 培养基 |
| 6.2.4 引物 |
| 6.2.5 实验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 异源表达 dig 的 DSF 介导致病的致病菌的构建 |
| 6.3.2 dig对野油菜黄单胞菌内源DSF产量影响的测定 |
| 6.3.3 dig对野油菜黄单胞菌XC1胞外酶产量影响的测定 |
| 6.3.4 dig对野油菜黄单胞菌XC1运动性影响的测定 |
| 6.3.5 dig对野油菜黄单胞菌XC1生物膜产量影响的测定 |
| 6.3.6 dig对致病菌XC1的生物防治效果 |
| 6.4 结论与讨论 |
| 第七章 全文总结与展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.3 工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（4）食品体系中乳杆菌的压力应答机制及其与酵母的群体相互作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乳杆菌概述 |
| 1.2 酵母概述 |
| 1.2.1 酿酒酵母 |
| 1.2.2 假丝酵母 |
| 1.3 细菌的压力应答 |
| 1.3.1 VBNC状态的形成与特性 |
| 1.3.2 VBNC状态的形成机制 |
| 1.4 多微生物相互作用 |
| 1.4.1 乳杆菌与酿酒酵母的相互作用 |
| 1.4.2 乳杆菌与假丝酵母的相互作用 |
| 1.4.3 群感效应 |
| 1.5 本课题的研究背景、意义和内容 |
| 1.5.1 研究背景和意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 乳杆菌VBNC状态的诱导及特性 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料与设备 |
| 2.2.2 VBNC状态的诱导 |
| 2.2.3 VBNC状态的鉴定 |
| 2.2.4 SEM观察菌体形态 |
| 2.2.5 食品腐败和产酸、双乙酰能力检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 乳杆菌VBNC状态的形成 |
| 2.3.2 VBNC状态乳杆菌的特性 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 乳杆菌VBNC状态的形成机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料与设备 |
| 3.2.2 全基因组测序与组装 |
| 3.2.3 基因预测与功能分析 |
| 3.2.4 转录组测序与序列比对 |
| 3.2.5 基因表达与功能富集分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 全基因组功能谱 |
| 3.3.2 食品腐败和VBNC状态相关基因 |
| 3.3.3 乳杆菌不同状态转录谱 |
| 3.3.4 VBNC状态形成过程中关键基因与通路调控 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 乳杆菌与酿酒酵母的群体相互作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料与设备 |
| 4.2.2 共培养体系与生长测定 |
| 4.2.3 形态观察 |
| 4.2.4 转录组测序与序列比对 |
| 4.2.5 基因表达与功能富集分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 共培养体系中菌体生长情况 |
| 4.3.2 共培养体系中菌体形态变化 |
| 4.3.3 共培养体系中乳杆菌转录谱 |
| 4.3.4 共培养体系中乳杆菌关键基因与通路调控 |
| 4.3.5 共培养体系中酿酒酵母转录谱 |
| 4.3.6 共培养体系中酿酒酵母关键基因与通路调控 |
| 4.3.7 乳杆菌与酿酒酵母群体相互作用机制 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 乳杆菌与假丝酵母的群体相互作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料与设备 |
| 5.2.2 共培养体系与生长测定 |
| 5.2.3 形态观察 |
| 5.2.4 转录组测序与序列比对 |
| 5.2.5 基因表达与功能富集分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 共培养体系中菌体生长情况 |
| 5.3.2 共培养体系中菌体形态变化 |
| 5.3.3 共培养体系中乳杆菌转录谱 |
| 5.3.4 共培养体系中乳杆菌关键基因与通路调控 |
| 5.3.5 共培养体系中假丝酵母转录谱 |
| 5.3.6 共培养体系中假丝酵母关键基因与通路调控 |
| 5.3.7 乳杆菌与假丝酵母群体相互作用机制 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 乳杆菌对假丝酵母菌丝形成的调控机制 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料与设备 |
| 6.2.2 共培养体系与生长测定 |
| 6.2.3 形态观察 |
| 6.2.4 菌株的构建 |
| 6.2.5 BLP1 基因表达的定性及定量检测 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 乳杆菌和菌丝态假丝酵母共培养时生长变化 |
| 6.3.2 乳杆菌对假丝酵母菌丝形成和BLP1 基因表达的影响 |
| 6.3.3 调控BLP1 基因表达的表型 |
| 6.3.4 葡萄糖信号传导通路对BLP1 基因表达的调控 |
| 6.3.5 乳杆菌对假丝酵母菌丝形成的调控机制 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 乳杆菌的压力应答与群体互作的内在机制 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验材料与方法 |
| 7.2.1 不同共培养体系中乳杆菌转录谱的比对分析 |
| 7.2.2 酿酒酵母和假丝酵母转录谱的比对分析 |
| 7.2.3 共培养体系和VBNC状态过程中乳杆菌转录谱的比对分析 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 乳杆菌与不同生长模式酵母的作用规律 |
| 7.3.2 群体相互作用对乳杆菌VBNC状态的影响 |
| 7.3.3 乳杆菌的压力应答与群体互作的内在机制 |
| 7.4 本章小结 |
| 结论和展望 |
| 一、结论 |
| 二、创新点 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）绿针假单胞菌GP72中吩嗪合成的群体感应调控与基因簇的过表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 吩嗪类化合物 |
| 1.1.1 吩嗪类化合物的简介 |
| 1.1.2 吩嗪类化合物的作用 |
| 1.2 吩嗪类化合物的生物合成 |
| 1.2.1 吩嗪合成基因簇 |
| 1.2.2 莽草酸途径 |
| 1.2.3 吩嗪合成修饰基因 |
| 1.3 吩嗪类化合物生物合成的调控 |
| 1.3.1 双组分调控系统 |
| 1.3.2 群体感应系统 |
| 1.3.3 转录后调控 |
| 1.3.4 环境因素 |
| 1.4 本论文研究的目的和意义 |
| 第二章 绿针假单胞菌GP72中AHLs信号分子的鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验所用菌株、质粒及引物 |
| 2.2.2 培养基和菌株生长条件 |
| 2.2.3 仪器和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 绿针假单胞菌GP72 基因组DNA的提取 |
| 2.3.2 质粒提取 |
| 2.3.3 电泳定向实验检验DNA大小 |
| 2.3.4 aurI、csaI、hdtS和 phzI基因片段的克隆 |
| 2.3.5 PCR产物的回收纯化 |
| 2.3.6 构建aurI、csaI、hdtS、phzI的重组质粒 |
| 2.3.7 重组质粒转化DH5α细胞 |
| 2.3.8 AHLs信号分子的萃取 |
| 2.3.9 AHLs信号分子的平板检测 |
| 2.3.10 AHLs信号分子的LC-MS分析 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 aurI、csaI、hdtS、phzI基因的扩增 |
| 2.4.2 指示菌NTL4 的平板检测结果 |
| 2.4.3 指示菌CV026 的平板检测结果 |
| 2.4.4 aurI基因产生的信号分子LC-MS检测结果 |
| 2.4.5 csaI基因产生的信号分子LC-MS检测结果 |
| 2.4.6 hdtS基因产生的信号分子LC-MS检测结果 |
| 2.4.7 phzI基因产生的信号分子LC-MS检测结果 |
| 2.4.8 不同菌株中aurI、csaI、hdtS和 phzI基因合成信号分子的比较 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 群体感应基因对吩嗪类化合物产量的调控 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验所用菌株、质粒和引物 |
| 3.2.2 培养基和菌株生长条件 |
| 3.2.3 仪器和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 基因组DNA提取 |
| 3.3.2 质粒的提取 |
| 3.3.3 电转感受态细胞的制备 |
| 3.3.4 大肠杆菌S17 感受态细胞制备 |
| 3.3.5 敲除基因质粒的构建 |
| 3.3.6 重组质粒转化S17 感受态细胞 |
| 3.3.7 两次同源重组筛选阳性克隆 |
| 3.3.8 突变株的发酵 |
| 3.3.9 生长曲线和吩嗪类化合物产量的测定 |
| 3.3.10 回补菌株的构建 |
| 3.3.11 突变株β-半乳糖苷酶活性的测定 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 无痕敲除aurI、csaI、hdtS、phzI基因 |
| 3.4.2 基因敲除株生长曲线和吩嗪合成 |
| 3.4.3 回补菌株的生长和吩嗪合成 |
| 3.4.4 无痕敲除aurR、aurI/aurR基因 |
| 3.4.5 aurR、aurI/aurR基因敲除株生长曲线和吩嗪合成 |
| 3.4.6 aurI/aurR基因回补菌株的生长和吩嗪合成 |
| 3.4.7 β-半乳糖苷酶活性测定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 双拷贝基因簇对吩嗪类物质产量的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验所用菌株、质粒及引物 |
| 4.2.2 培养基和菌株生长条件 |
| 4.2.3 仪器和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 吩嗪合成基因簇过表达突变株的构建 |
| 4.3.2 过表达菌株生长曲线的测定 |
| 4.3.3 过表达菌株吩嗪类化合物产量的测定 |
| 4.3.4 位点特异重组整合吩嗪合成基因簇 |
| 4.3.5 同源臂同源重组整合吩嗪合成基因簇 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 基因簇过表达菌株的构建 |
| 4.4.2 过表达菌株的生长曲线和吩嗪类化合物产量 |
| 4.4.3 整合吩嗪合成基因簇的验证 |
| 4.4.4 整合吩嗪合成基因簇菌株的发酵 |
| 4.4.5 同源重组整合吩嗪合成基因簇 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 相关基因序列 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
（6）AHL合成酶基因的多样性分布及其表达活性对缺氧环境的响应（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 AHL产生菌在环境中的分布与AHL合成机制 |
| 1.1.1 产AHL细菌在环境中的分布与多样性 |
| 1.1.2 AHL信号分子合成机制 |
| 1.2 缺氧环境对细菌群体感应系统的影响 |
| 1.2.1 细菌缺氧生存环境的普遍性 |
| 1.2.2 细菌对缺氧环境的响应机制 |
| 1.2.3 缺氧环境对细菌群体感应系统的影响 |
| 1.3 根瘤菌科群体感应系统与环境应用 |
| 1.3.1 根瘤菌科系统发育分类与环境应用 |
| 1.3.2 根瘤菌科群体感应系统 |
| 1.3.3 Ensifer adhaerens在环境修复中的应用 |
| 1.4 Sphingomonads群体感应系统与环境应用 |
| 1.4.1 Sphingomonads系统发育分类与环境应用 |
| 1.4.2 Sphingomonads群体感应系统 |
| 1.4.3 菌株US6-1在环境修复中的应用 |
| 1.5 论文选题依据与研究方案 |
| 1.5.1 论文选题依据 |
| 1.5.2 研究方案 |
| 2 陆生与湿地植物根际中AHL合成酶基因的多样性分布 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.2 根际样品采集 |
| 2.1.3 样品处理与菌株分离 |
| 2.1.4 产AHL细菌的检测与鉴定 |
| 2.1.5 AHL信号分子萃取与TLC鉴定 |
| 2.1.6 根瘤菌科AHL合成酶基因通用引物设计 |
| 2.1.7 单菌株中AHL合成酶基因扩增 |
| 2.1.8 根际样品中AHL合成酶基因扩增和克隆文库构建 |
| 2.2 研究结果与讨论 |
| 2.2.1 引物RAHL352F/RAHL461R特异性和效率分析 |
| 2.2.2 两种陆生植物根际AHL合成酶基因多样性 |
| 2.2.3 两种湿地植物根际AHL产生菌多样性 |
| 2.2.4 两种湿地植物根际AHL合成酶基因多样性 |
| 2.2.5 陆生和水生植物根际AHL合成酶基因多样性比较 |
| 2.3 本章小结 |
| 3 具有降解芳香烃和合成AHL双重潜力的菌株的多样性分布 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 主要试剂和仪器 |
| 3.1.2 基因组搜索具有芳香烃降解和AHL合成双重潜力的细菌 |
| 3.1.3 系统发育树构建与分析 |
| 3.1.4 样品采集与富集 |
| 3.1.5 PAHs降解菌和AHL产生菌的筛选 |
| 3.1.6 菌株鉴定 |
| 3.1.7 AHL信号分子萃取 |
| 3.1.8 AHL信号分子TLC鉴定 |
| 3.1.9 AHL信号分子GC-MS鉴定 |
| 3.1.10 基因序列号 |
| 3.2 研究结果与讨论 |
| 3.2.1 具有降解芳香烃和产AHL双重潜力的细菌多样性 |
| 3.2.2 RHDα和AHL合成酶基因系统发育树分析 |
| 3.2.3 环境中具有降解PAHs和产AHL双重功能的菌株筛选分离 |
| 3.2.4 Sphingomonadales产AHL分析 |
| 3.3 本章小结 |
| 4 缺氧环境对菌株X097 AHL合成酶基因活性表达的影响 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.1 主要试剂和仪器 |
| 4.1.2 实验菌株及其培养条件 |
| 4.1.3 X097基因组测序及E.adhaerens QS系统组成基因注释 |
| 4.1.4 根瘤菌科AHL合成酶基因多样性调研和系统发育树分析 |
| 4.1.5 AHL合成酶基因体外原核表达 |
| 4.1.6 AHL合成酶蛋白质三级结构预测 |
| 4.1.7 AHL信号分子TLC和GC-MS分析 |
| 4.1.8 X097生长方式及细胞收集时期确定 |
| 4.1.9 荧光定量PCR实验 |
| 4.1.10 基因序列号 |
| 4.2 研究结果与讨论 |
| 4.2.1 根瘤菌科细菌AHL合成酶基因丰度与多样性分析 |
| 4.2.2 三株Ensifer adhaerens群体感应系统基因组成多样性分析 |
| 4.2.3 X097 AHL合成酶体外表达产AHL分析 |
| 4.2.4 AHL合成酶蛋白质三级结构预测 |
| 4.2.5 缺氧环境对X097合成AHL和AHL合成酶基因表达量的影响 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 缺氧环境对菌株US6-1 AHL合成酶基因活性表达的影响及影响机制 |
| 5.1 实验材料与方法 |
| 5.1.1 主要试剂和仪器 |
| 5.1.2 质粒、实验菌株及其培养条件 |
| 5.1.3 AHL合成酶基因原核表达 |
| 5.1.4 AHL信号分子萃取与检测 |
| 5.1.5 AHL信号分子的TLC和LC-MS/MS鉴定 |
| 5.1.6 振荡与静置培养条件下US6-1生长曲线测定 |
| 5.1.7 振荡培养条件下US6-1对3-OH-C8与C8-HSL的降解检测 |
| 5.1.8 振荡与静置培养条件下US6-1细胞SAM含量测定 |
| 5.1.9 振荡与静置培养条件下US6-1细胞NAD/NADH比值测定 |
| 5.1.10 转录组测序与荧光定量PCR实验 |
| 5.1.11 目的基因敲除 |
| 5.1.12 菲降解率测定 |
| 5.2 研究结果与讨论 |
| 5.2.1 US6-1 AHL合成酶基因原核表达与体外产AHL鉴定 |
| 5.2.2 缺氧环境对US6-1合成AHL的影响 |
| 5.2.3 缺氧环境对US6-1细胞NAD/NADH和SAM含量的影响 |
| 5.2.4 US6-1对AHL的降解利用 |
| 5.2.5 缺氧环境对US6-1 novI和novR基因表达的影响 |
| 5.2.6 缺氧环境下氧气响应因子fnr敲除对US6-1合成AHL的影响 |
| 5.2.7 缺氧环境下氧气响应因子hk敲除对US6-1合成AHL的影响 |
| 5.2.8 由转录组数据预测的缺氧环境下可能影响US6-1产AHL的因素 |
| 5.2.9 缺氧环境下由于novI的调控而出现显着性表达量差异的基因统计 |
| 5.2.10 缺氧环境下novI基因缺失对US6-1降解菲的影响 |
| 5.3 本章小结 |
| 6 研究结论、创新点及展望 |
| 6.1 研究结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历及攻读博士期间发表论文情况 |
（7）CRISPR/Cas9系统介导的小菜蛾（Plutella xylostella）基因编辑（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 昆虫的遗传转化与基因组编辑 |
| 1.1.1 转座子介导的遗传转化 |
| 1.1.2 位点特异性整合酶 |
| 1.1.3 归巢内切酶 |
| 1.1.4 人工核酸酶技术 |
| 1.1.5 RNA靶向的核酸酶技术 |
| 1.2 CRISPR/Cas9系统及应用 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9系统介导的基因敲除 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9系统介导的基因敲入 |
| 1.2.3 基于CRISPR/Cas9系统的转录激活与抑制 |
| 1.2.4 基于CRISPR/Cas9系统的荧光原位杂交 |
| 1.3 害虫的遗传调控 |
| 1.3.1 基于辐射的昆虫不育技术 |
| 1.3.2 释放显性致死昆虫的遗传调控技术 |
| 1.3.3 Gene drive系统 |
| 1.4 立题意义与总体思路 |
| 1.4.1 立题意义 |
| 1.4.2 总体思路 |
| 第二章 CRISPR/Cas9系统介导Pxabd-A敲除 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试小菜蛾品系 |
| 2.1.2 小菜蛾Pxabd-A的克隆 |
| 2.1.3 Pxabd-A进化树的构建 |
| 2.1.4 Pxabd-A蛋白3D结构模型预测 |
| 2.1.5 Pxabd-A表达模式分析 |
| 2.1.6 体外转录获得Cas9 mRNA和sgRNA |
| 2.1.7 胚胎的显微注射 |
| 2.1.8 表型的鉴定与突变检测 |
| 2.1.9 G_1代个体的表型观察与基因型检测 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 Pxabd-A的序列结构和特征 |
| 2.2.2 Pxabd-A的进化分析 |
| 2.2.3 Pxabd-A蛋白3D结构模型 |
| 2.2.4 Pxabd-A的表达模式分析 |
| 2.2.5 Pxabd-A破坏后的表型效应 |
| 2.2.6 CRISPR/Cas9系统介导Pxabd-A定点突变 |
| 2.2.7 CRISPR/Cas9系统介导的突变可稳定遗传 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 CRISPR/Cas9系统介导PxUbx与PxAntp敲除 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 基因特异性sgRNA的设计及体外转录 |
| 3.1.2 胚胎的显微注射 |
| 3.1.3 表型观察及突变检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 PxAntp sgRNA靶点的选择 |
| 3.2.2 PxUbx sgRNA靶点的选择 |
| 3.2.3 CRISPR/Cas9系统介导的PxAntp缺失表型 |
| 3.2.4 CRISPR/Cas9系统介导的PxUbx缺失表型 |
| 3.2.5 CRISPR/Cas9系统介导PxUbx与PxAntp的定点突变 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 小菜蛾内源PolⅢ型U6启动子的鉴定与分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 小菜蛾细胞系的培养 |
| 4.1.2 小菜蛾内源U6启动子的克隆 |
| 4.1.3 U6:shRNA表达质粒的构建及细胞内的RNAi分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 PxU6启动子的鉴定与分析 |
| 4.2.2 克隆的PxU6启动子的表达效率 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 U6:sgRNA表达载体介导小菜蛾细胞系与个体内基因敲除 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试昆虫与细胞系 |
| 5.1.2 U6:sgRNA-EGFP表达质粒的构建及细胞转染 |
| 5.1.3 PxU6:3:sgRNA-abd-A表达载体的构建及胚胎显微注射 |
| 5.1.4 表型观察及靶点突变分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 小菜蛾细胞中PxU6:3:sgRNA介导EGFP的敲除 |
| 5.2.2 U6:sgRNA表达质粒参与介导Pxabd-A定点靶向 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 tRNA-gRNA表达策略的应用与基于CRISRP的gene drive系统 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 小菜蛾品系及其饲养 |
| 6.1.2 质粒的构建 |
| 6.1.3 RNA的体外转录获得 |
| 6.1.4 小菜蛾的胚胎显微注射 |
| 6.1.5 观察与检测 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 tRNA-sgRNA表达质粒参与介导的Pxabd-A敲除 |
| 6.2.2 基于CRISPR的gene drive构建 |
| 6.3 小结与讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的学术论文和研究成果 |
| 致谢 |
（8）特异型细菌发光传感器的构建及其对土壤汞、菲复合污染检测的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 土壤重金属和多环芳烃复合污染研究现状 |
| 1.1.1 土壤重金属和多环芳烃污染物来源及危害 |
| 1.1.2 土壤HM和PAH的复合污染 |
| 1.1.3 土壤复合污染物的生物有效性 |
| 1.2 全细胞微生物传感器技术 |
| 1.2.1 全细胞微生物传感器技术原理 |
| 1.2.2 全细胞微生物传感器类型 |
| 1.2.3 全细胞微生物传感器用于复合污染物检测 |
| 1.3 全细胞微生物传感器检测土壤复合污染的应用研究 |
| 1.3.1 全细胞微生物传感器用于复合无机污染物的生物有效性评价 |
| 1.3.2 全细胞微生物传感器用于复合有机污染物的生物有效性评价 |
| 1.3.3 全细胞微生物传感器用于复合无机加有机污染物的生物有效性评价 |
| 1.4 本论文研究思路 |
| 1.4.1 本研究的内容 |
| 1.4.2 本研究的意义 |
| 1.4.3 拟解决的关键科学问题 |
| 1.4.4 技术路线 |
| 第2章 Hg、PHE微生物传感器的构建、表达及性能优化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 供试试剂和培养基 |
| 2.1.3 试剂与器材 |
| 2.1.4 DNA提取 |
| 2.1.5 DNA合成和测序 |
| 2.1.6 PCR扩增体系和条件 |
| 2.1.7 大肠杆菌转化子的快检 |
| 2.1.8 三亲结合构建基于细菌染色体的报告基因系统 |
| 2.1.9 报告菌对底物的剂量效应测试 |
| 2.1.9.1 不同浓度Hg~(2+)诱导BMB-ME信号表达测试 |
| 2.1.9.2 细胞色素P450处理低环PAH |
| 2.1.9.3 不同浓度PHE诱导BMB-PL信号表达测试 |
| 2.1.10 报告菌的底物特异性测试 |
| 2.1.11 报告菌的细胞固定化及效果评价 |
| 2.1.11.1 海藻酸钙包埋固定 |
| 2.1.11.2 滤纸片吸附固定 |
| 3.1.11.3 菌体存活率测定 |
| 2.1.12 数据统计与分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 启动子片段的克隆 |
| 2.2.2 Hg特异型报告菌的构建 |
| 2.2.3 PHE特异型报告菌的构建 |
| 2.2.4 所构建的各报告菌株表达效果 |
| 2.2.5 报告菌BMB-ME和BMB-PL的底物特异性 |
| 2.2.6 报告菌BMB-ME和BMB-PL对底物的灵敏度测定 |
| 2.2.7 报告菌细胞固定化效果及评价 |
| 2.2.7.1 固定化效果及信号表达 |
| 2.2.7.2 固定化报告菌活力维持 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 微生物传感器对红壤中Hg、PHE单一及复合污染生物有效性评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 供试试剂和培养基 |
| 3.1.3 试剂与器材 |
| 3.1.4 红壤样品采集与处理 |
| 3.1.5 红壤汞、菲污染物的添加及老化处理 |
| 3.1.6 微宇宙培养实验及红壤汞、菲污染生物有效性的测定 |
| 3.1.7 BMB-ME和BMB-PL测定红壤汞、菲最佳条件的优化 |
| 3.1.8 单一Hg污染红壤浸提液的制备 |
| 3.1.9 单一PHE污染红壤的索氏提取 |
| 3.1.10 检测菌株BMB-ME对红壤中各种形态Hg污染测定程序 |
| 3.1.11 仪器分析方法测定Hg、PHE污染物 |
| 3.1.11.1 土壤样品中菲的HPLC测定 |
| 3.1.11.2 CVAAS测定样品中总汞含量 |
| 3.1.12 报告菌原位测定红壤Hg、PHE污染的条件优化 |
| 3.1.13 重金属复合污染对报告菌测定Hg污染的影响测定 |
| 3.1.14 数据统计与分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 报告菌原位检测模拟红壤中Hg、PHE的条件优化 |
| 3.2.2 单一及复合Hg、PHE污染红壤中污染物生物有效性的检测 |
| 3.2.3 复合HM污染红壤中Hg的生物有效性检测 |
| 3.2.4 红壤中不同组分Hg污染的测定比较 |
| 3.2.5 分析法和报告菌法对连续剂量Hg、PHE测定比较 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 大尺度生物有效态汞、菲的空间地理分布研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株和培养条件 |
| 4.1.2 试剂与器材 |
| 4.1.3 试剂和标准物质 |
| 4.1.4 土壤样品采集与处理 |
| 4.1.5 混合接触法测定土壤Hg、PHE生物有效性步骤 |
| 4.1.6 土壤与报告菌的混合比例确定 |
| 4.1.7 土壤总PAH污染物分析 |
| 4.1.8 数据来源和分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 土壤与报告菌的混合比例确定 |
| 4.2.2 标准污染土壤样品的Hg、PHE生物有效性测定 |
| 4.2.3 炼油厂周边污染土壤样品的Hg、PHE生物有效性测定 |
| 4.2.4 长三角土壤复合Hg、PHE污染的生物有效性测定 |
| 4.2.5 长三角土壤Hg、PHE污染生物有效性的空间地理分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 Hg、PHE对农田红壤微生态毒性的综合评价 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 菌株和培养条件 |
| 5.1.2 土壤样品采集和污染物处理 |
| 5.1.3 土壤基本理化指标测定 |
| 5.1.3.1 土壤速效K的测定 |
| 5.1.3.2 土壤有效磷的测定 |
| 5.1.3.3 土壤pH测定 |
| 5.1.3.4 土壤总氮含量的测定 |
| 5.1.4 实验设计及红壤污染物处理 |
| 5.1.5 土壤酶活力测定 |
| 5.1.6 细菌16S rDNA DGGE分析 |
| 5.1.7 报告菌测定 |
| 5.1.8 土壤可溶性有机碳的测定 |
| 5.1.9 数据统计与分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 种植不同作物的红壤基本理化指标测定 |
| 5.2.2 单一汞、菲处理和作物种类对红壤中细菌多样性的影响分析 |
| 5.2.2.1 固定剂量PHE处理的红壤细菌多样性分析 |
| 5.2.2.2 连续剂量Hg处理的红壤细菌多样性分析 |
| 5.2.2.3 固定剂量Hg处理的细菌多样性分析 |
| 5.2.3 连续及固定剂量汞、菲处理的污染物生物有效性分析 |
| 5.2.4 连续及固定剂量汞、菲处理的红壤酶活性分析 |
| 5.2.5 汞、菲处理不同种植作物红壤细菌类群的多因子分析 |
| 5.2.5.1 固定剂量菲处理的红壤细菌类群RDA分析 |
| 5.2.5.2 连续剂量汞处理的红壤细菌类群CCA分析 |
| 5.2.5.3 固定剂量汞处理的红壤细菌类群CCA分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 研究展望 |
| 附录A |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（9）基因组工程构建高产代谢产物农药申嗪霉素的细胞工厂（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 假单胞菌生物防治 |
| 1.1.1 植物根际促生假单胞菌 |
| 1.1.2 根际竞争能力是生物防治的必要条件 |
| 1.1.3 提升假单胞菌生物防治效率 |
| 1.2 吩嗪化合物生物合成及调控 |
| 1.2.1 吩嗪化合物 |
| 1.2.2 吩嗪的生物合成 |
| 1.2.3 假单胞菌吩嗪生物合成调控 |
| 1.3 小基因组细胞工厂研究进展 |
| 1.3.1 小基因组细胞工厂简介 |
| 1.3.2 获得小基因组的两种途径 |
| 1.3.3 构建小基因组细胞工厂的流程 |
| 1.3.4 模式菌株小基因组细胞工厂研究进展 |
| 1.4 本研究目的和意义 |
| 第二章 PhzC蛋白在PCA生物合成中的功能分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 本章使用菌株、质粒和引物 |
| 2.2.2 培养基、缓冲液 |
| 2.2.3 抗生素、酶及化学试剂 |
| 2.2.4 大肠杆菌超级感受态制备方法 |
| 2.2.5 转化感受态大肠杆菌方法、聚合酶链式反应(PCR)、DNA凝胶电泳 |
| 2.2.6 大肠杆菌质粒小量提取、DNA凝胶回收、铜绿假单胞菌基因组DNA提取 |
| 2.2.7 铜绿假单胞菌基因无痕敲除方法 |
| 2.2.8 铜绿假单胞菌PCA发酵培养方法 |
| 2.2.9 PCA提取和检测方法 |
| 2.2.10 phzC基因定点突变方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 DAHP合成酶对PCA合成的影响 |
| 2.3.2 phzC基因在PCA合成中的作用 |
| 2.3.3 PhzC蛋白结构域预测及其对PCA产量的影响 |
| 2.3.4 PhzC蛋白活性位点分析 |
| 2.3.5 PhzC蛋白反馈抑制分析 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 改造PCA合成途径和次级代谢途径构建申嗪霉素高产菌株 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 本章使用菌株、质粒和引物 |
| 3.2.2 培养基、缓冲液 |
| 3.2.3 化学试剂 |
| 3.2.4 细胞毒性测定方法 |
| 3.2.5 果蝇毒性测定方法 |
| 3.2.6 ubiC基因替换方法 |
| 3.2.7 制备铜绿假单胞菌感受态方法 |
| 3.2.8 启动子替换方法 |
| 3.2.9 Western boltting |
| 3.2.10 分批补料(Fed-batch)发酵 |
| 3.2.11 其它材料和方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 构建低毒、安全的PA1201 菌株 |
| 3.3.2 阻断PCA转化途径,提高申嗪霉素产量 |
| 3.3.3 重组分支酸代谢途径,提高申嗪霉素产量 |
| 3.3.4 过表达DAHP合成酶基因,提高申嗪霉素产量 |
| 3.3.5 改造吩嗪合成基因簇启动子,提高申嗪霉素产量 |
| 3.3.6 增强外排泵表达,提高申嗪霉素产量 |
| 3.3.7 改造次级代谢生物合成基因簇,提高申嗪霉素产量 |
| 3.3.8 优化培养基,提高申嗪霉素产量 |
| 3.3.9 Fed-batch发酵生产申嗪霉素 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 M18基因组精简优化 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 本章使用菌株、质粒和引物 |
| 4.2.2 测定电转化效率方法 |
| 4.2.3 测定接合转移效率方法 |
| 4.2.4 铜绿假单胞菌总RNA提取和纯化方法 |
| 4.2.5 原核链特异性转录组文库构建方法 |
| 4.2.6 实时荧光定量PCR |
| 4.2.7 其它材料与方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 提高转化效率,优化遗传操作体系 |
| 4.3.2 次级代谢生物合成基因簇系统敲除 |
| 4.3.3 大片段DNA区域系统敲除 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 研究工作总结 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 研究工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 遗传和代谢改造PA1201 基因组所用引物 |
| 附录Ⅱ M18 基因组精简优化所用引物 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的主要成果 |
（10）Bt生物被膜产生菌的筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 研究背景 |
| 2 细菌生物被膜 |
| 2.1 细菌生物被膜的发展简史 |
| 2.2 细菌生物被膜的概念及组成 |
| 2.3 细菌生物被膜的结构与特性 |
| 2.4 细菌生物被膜的形成 |
| 2.5 影响细菌生物被膜形成的因素 |
| 2.6 细菌生物被膜检测方法 |
| 2.7 细菌生物被膜的基因表达与蛋白表达 |
| 2.8 生物被膜菌和浮游细菌的生物学特性比较 |
| 2.9 细菌生物被膜的意义 |
| 3 Bt生物被膜 |
| 3.1 Bt生物被膜研究概况 |
| 3.2 芽胞杆菌生物被膜形成的调控网络 |
| 4 绿色荧光蛋白的应用 |
| 5 全内反射荧光显微术原理及其应用 |
| 6 芽胞杆菌功能基因组学研究方法 |
| 6.1 转座子插入突变 |
| 6.2 同源重组敲除技术 |
| 7 本研究的立题依据和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、质粒与植物材料 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 试剂 |
| 2 仪器 |
| 3 方法 |
| 3.1 Bt生物被膜产生菌的筛选 |
| 3.2 高效产生物被膜Bt菌的鉴定 |
| 3.3 生物被膜形成相关基因的分析 |
| 3.4 生物被膜的生防应用探索 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 Bt生物被膜产生菌的筛选 |
| 1.1 固体表面Bt生物被膜产生菌筛选 |
| 1.2 气-液界面Bt生物被膜产生菌筛选 |
| 2 高效产生物被膜Bt菌的鉴定 |
| 2.1 生长曲线测定 |
| 2.2 形态学观察 |
| 2.3 大质粒图谱分析 |
| 2.4 杀虫晶体蛋白分析 |
| 2.5 生物被膜相关基因分析 |
| 2.6 气-液界面生物被膜形态评估 |
| 3 生物被膜形成相关基因的分析 |
| 3.1 遗传转化体系的建立 |
| 3.2 生物被膜缺失突变株的获得与表型分析 |
| 3.3 生物被膜相关基因的分析与功能验证 |
| 4 生物被膜的生防应用探索 |
| 4.1 生物被膜形成速度与状态分析 |
| 4.2 生物被膜定殖能力的分析 |
| 4.3 生物被膜抗紫外线能力的分析 |
| 第四章 小结与讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、应用gfp对盐单胞菌C6可能转座酶A基因启动区的鉴定（论文参考文献）
- [1]原核生物Argonaute（pAgo）蛋白介导细菌基因组编辑及其机制研究[D]. 付磊. 华中农业大学, 2020
- [2]拮抗细菌Burkholderia seminalis R456的铁代谢及其调控机制研究[D]. 王晓璇. 浙江大学, 2020(07)
- [3]DSF群体淬灭菌Pseudomonas sp. HS-18的分离鉴定及其淬灭机制的研究[D]. 王惠杉. 华南农业大学, 2019(02)
- [4]食品体系中乳杆菌的压力应答机制及其与酵母的群体相互作用[D]. 刘君彦. 华南理工大学, 2019(01)
- [5]绿针假单胞菌GP72中吩嗪合成的群体感应调控与基因簇的过表达[D]. 马润亭. 上海交通大学, 2018(01)
- [6]AHL合成酶基因的多样性分布及其表达活性对缺氧环境的响应[D]. 曾艳华. 浙江大学, 2018(08)
- [7]CRISPR/Cas9系统介导的小菜蛾（Plutella xylostella）基因编辑[D]. 黄宇萍. 福建农林大学, 2017(01)
- [8]特异型细菌发光传感器的构建及其对土壤汞、菲复合污染检测的应用研究[D]. 何伟. 南京师范大学, 2016
- [9]基因组工程构建高产代谢产物农药申嗪霉素的细胞工厂[D]. 金凯明. 上海交通大学, 2016(03)
- [10]Bt生物被膜产生菌的筛选与鉴定[D]. 张巧铃. 福建农林大学, 2014(11)