交感神经系统中的神经肽

一、交感神经系统中的神经肽（论文文献综述）

黄锦^[1]（2021）在《PACAP/PAC1受体介导电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症的作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的:骨髓抑制是肿瘤化疗常见副作用之一,最先表现为白细胞减少症,诱发感染严重限制了化疗药的临床应用。临床研究发现针灸可有效改善化疗致白细胞减少症,但作用机制尚未完全阐明。本研究基于前期已建立的电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症效应平台,以交感神经修复为切入点,探讨交感神经释放垂体腺苷酸环化酶激活肽（Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP）作用于PAC1受体介导电针促进化疗后骨髓造血恢复的作用机制,并在肺癌化疗小鼠模型中验证电针改善造血功能的效应,为针刺在肿瘤化疗中“减毒增效”的作用提供科学依据,促进临床应用和推广。方法:研究内容一PACAP/PAC1受体介导电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症的机制研究实验一电针改善顺铂致小鼠骨髓造血功能低下的治疗效应研究复制前期效应平台,将雄性Balb/c小鼠随机分为对照组（Veh组）、化疗组（Cis组）、化疗加电针组（EA组）。化疗药顺铂剂量选用3mg/kg,一周2次,共2周。电针干预与化疗药同一天开始,选穴为双侧足三里、三阴交穴,一周3次,共2周。动态观察各组小鼠体重变化。通过对胫骨骨髓进行苏木素&伊红（Hematoxylin&Eosin,H&E）染色观察电针对化疗所致骨髓萎缩的影响。通过流式细胞术检测小鼠骨髓造血干祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cells,HSPCs）及其亚群的数量变化,包括HSPCs、长期造血干细胞（Long-term HSCs,LT-HSCs）、短期造血干细胞（Short-term HSCs,ST-H SCs）、多能祖细胞（Multipotent progenitors,MPPs）、淋系祖细胞（Common lymphoid progenitors,CLPs）、髓系祖细胞（Common myeloid progenitors,CMPs）、粒细胞-巨噬细胞祖细胞（Granulocyte-macrophage progenitors,GMPs）、巨核/红系祖细胞（Megakar yocytic/erythroid progenitors,MEPs）,观察电针对化疗后骨髓造血功能的影响。实验二电针促进顺铂小鼠骨髓交感神经修复和PACAP分泌的作用研究通过胫骨骨髓交感神经纤维酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase,Th）免疫荧光染色探讨交感神经分布,定量逆转录PCR（Quantitative reverse transcription PCR,RT-q PCR）检测骨髓内神经营养因子家族如神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）、脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor,BDNF）的基因含量,明确电针对化疗后骨髓交感神经损伤的修复作用。最后,通过酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测骨髓内PACAP蛋白含量,明确电针对骨髓PACAP含量的调节作用。实验三PACAP/PAC1受体介导电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症的机制研究在电针治疗顺铂小鼠的同时,分别给予高、低剂量PAC1拮抗剂（PACAP6-38）。首先,通过热板实验动态观察各组小鼠热痛潜伏时间的变化,明确电针及其拮抗剂对外周神经损伤的影响。其次,利用普通血常规检测外周血细胞数量（白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞）,观察PAC1拮抗剂对电针改善白细胞减少症的影响。最后,通过流式细胞术检测骨髓造血干祖细胞及其亚群数量,以及碘化丙啶（Propidium iodide,PI）染色观察骨髓各细胞周期（G0/G1、S、G2/M、S+G2/M）数量的变化,明确PACAP/PAC1受体介导电针改善骨髓造血的作用。实验四外源性PAC1激动剂改善顺铂致小鼠白细胞减少症的作用研究利用高、低剂量PAC1激动剂（PACAP1-38）干预化疗小鼠,动态观察PAC1激动剂对化疗小鼠热痛潜伏时间、外周血细胞（白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞）、骨髓造血干祖细胞及其亚群和细胞周期数量的变化,明确PAC1激动剂对化疗小鼠外周神经损伤、骨髓造血功能低下和白细胞减少症的影响。研究内容二电针改善顺铂致肺癌小鼠白细胞减少症的治疗效应研究实验五电针改善顺铂致肺癌小鼠白细胞减少症的治疗效应研究建立Lewis肺癌荷瘤小鼠,随机分为肿瘤组（T组）、肿瘤+化疗组（TC组）、肿瘤+化疗+电针组（EA组）,化疗药顺铂剂量选用5mg/kg,每周2次,共2周,电针干预方式同实验一。通过游标卡尺动态观察小鼠肿瘤体积,取材后检测瘤体组织重量和面积,明确电针联合化疗对肿瘤生长的影响。通过普通血常规检测外周血细胞（白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞）,进一步利用流式细胞术检测白细胞亚群数量（中性粒细胞、单核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞）,观察电针对肺癌顺铂小鼠外周血白细胞的影响。为了进一步明确电针对肺癌顺铂小鼠骨髓造血功能的影响,通过流式细胞术检测小鼠骨髓造血干祖细胞及其亚群、细胞周期数量的变化。结果:1.电针可改善化疗导致的骨髓萎缩,提高化疗小鼠骨髓多能祖细胞（MPPs）、髓系祖细胞（CMPs）的数量。电针治疗14天可改善化疗导致的小鼠体重减轻。胫骨骨髓HE染色发现化疗后小鼠骨髓组织骨髓细胞排列稀疏,可见大量空腔,骨髓细胞密度下降,电针治疗可见骨髓细胞呈密集分布。半定量分析发现电针可增加化疗小鼠的骨髓细胞密度,具有统计学差异。流式细胞结果发现化疗导致骨髓HSPCs、MPPs、CMPs、GMPs和MEPs的数量下降,电针治疗可提高MPPs和CMPs的数量,且HSPCs的数量较化疗组升高62%,MEPs的数量升高59%,但无统计学差异。2.电针可修复化疗导致骨髓交感神经纤维退变和上调骨髓PACAP蛋白含量,可能与促进骨髓神经营养相关因子Ngf和Bdnf的基因表达有关。骨髓内交感神经纤维Th免疫荧光染色结果及半定量分析发现,化疗干预后骨髓Th阳性表达下降,电针治疗后交感神经纤维分布增多,表明电针可修复化疗导致骨髓交感神经纤维退变。化疗后骨髓内Ngf、Bdnf基因含量、PACAP蛋白含量均下降,电针治疗均可上调Ngf、Bdnf基因含量及PACAP蛋白含量。3.高剂量PAC1拮抗剂可减弱电针改善顺铂小鼠热痛迟钝,拮抗电针增加顺铂小鼠外周血白细胞、骨髓造血干祖细胞（HSPCs）、多能祖细胞（MPPs）的数量及G2/M增殖期的骨髓细胞数量的作用。电针治疗14天,化疗小鼠热痛潜伏时间明显延长,电针可缩短化疗小鼠热痛潜伏时间,高剂量PAC1拮抗剂可拮抗电针治疗作用。外周血白细胞亚群数量结果发现,化疗后小鼠白细胞和淋巴细胞数量下降,电针治疗可提高白细胞和淋巴细胞的数量,高剂量PAC1拮抗剂可拮抗电针的治疗作用。骨髓造血干祖细胞及其亚群数量结果发现,化疗干预后MPPs、CMPs和MEPs数量下降,电针治疗可提高化疗小鼠HSPCs和MPPs的数量,而高、低剂量PAC1拮抗剂使电针上升HSPCs数量的效应消失,高剂量PAC1拮抗剂小鼠MPPs的数量较电针组下降。此外,化疗可导致骨髓G2/M期细胞数量下降,相反,电针治疗可提高G2/M增殖期的细胞数量,高、低剂量PAC1拮抗剂均可拮抗电针治疗作用。4.高剂量PAC1激动剂可改善化疗导致的热痛迟钝,提高外周血白细胞、骨髓造血干祖细胞（HSPCs）、多能祖细胞（MPPs）的数量和G2/M增殖期的骨髓细胞数量。电针治疗第14天,高、低剂量PAC1激动剂可缩短化疗小鼠的热痛潜伏时间。高剂量PAC1激动剂可提高化疗小鼠白细胞数量,对淋巴细胞无改善作用。骨髓造血干祖细胞及其亚群、细胞周期结果表明,高剂量PAC1激动剂可提高化疗小鼠HSPCs的数量,高、低剂量PAC1激动剂可提高化疗小鼠MPPs和G2/M增殖期的细胞数量。5.电针联合化疗可抑制肺癌小鼠的肿瘤生长,电针治疗可提高肺癌化疗小鼠的外周血中性粒细胞数量、骨髓造血干祖细胞（HSPCs）、多能祖细胞（MPPs）、髓系祖细胞（CMPs）和巨核/红系祖细胞（MEPs）的数量,增加骨髓S增殖期的细胞数量。皮下Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤种植后第14天到第21天,与肿瘤组相比,单纯化疗与电针联合化疗治疗均可抑制肿瘤生长,且这两种干预方式均可降低瘤体重量和瘤体面积。普通血常规和流式细胞分析结果均发现,化疗导致小鼠外周血中性粒细胞下降,电针治疗可提高中性粒细胞的数量。骨髓造血干祖细胞及其亚群、细胞周期结果发现,化疗后小鼠MPPs和GMPs的数量下调,S增殖期的细胞数量下降,电针治疗可提高MPP s、HSPCs、CMPs和MEPs的数量以及S增殖期的细胞数量。电针组小鼠骨髓GMPs数量虽较化疗组小鼠升高60%,但无统计学差异。结论:1.电针可修复化疗损伤的骨髓交感神经,通过PACAP/PAC1受体促进造血干祖细胞增殖,改善顺铂致小鼠白细胞减少症。2.电针可改善肺癌小鼠化疗后骨髓造血功能低下和白细胞减少症。

张波^[2]（2021）在《神经肽Y在骨折愈合中的作用及成骨机制研究》文中指出研究背景随着全球老龄化进程的加快,骨质疏松带来的骨折及社会、家庭负担逐渐加重。此外,严重的创伤性骨折、肿瘤切除、先天性疾病会导致巨大的节段性骨缺损,给临床工作带来很多困难。生长因子（growth factors）、多肽（peptides）及小分子（small molecules）联合人造骨移植材料（Synthetic bone graft substitutes）可以明显诱导成骨细胞的转移、分化和成熟。研究表明超过2cm的骨折后缺损就需要生物活性因子的介入,否则将难以愈合。因此,生长因子、多肽及小分子正成为国内外研究骨折缺损修复的热点。神经肽Y（neuropeptide Y,NPY）是位于大脑和周围神经系统的重要神经递质。NPY具有促进骨折愈合、改善膝关节骨性关节炎、治疗骨质疏松脆性骨折的多重作用,是一种重要的骨骼神经营养因子。NPY在周围组织骨细胞、成骨细胞、破骨细胞中可通过直接和间接激活多个通路来促进骨合成及代谢。NPY可能会参与增强成骨细胞介导的骨合成、抑制破骨细胞介导的骨吸收,是骨折愈合的关键因子。此外,NPY对关节软骨修复、维护骨代谢均衡也具有关键的作用。研究表明,关节滑膜、关节软骨、半月板和软骨下骨等关节组织都含有丰富的神经肽。NPY是重要的交感神经肽,其对髋、膝等关节的神经滋养作用正受到越来越多的关注,并被认为是改善骨性关节炎（osteoarthritis,OA）的潜在治疗靶点。同时,NPY是治疗绝经后骨质疏松症（Postmenopausal osteoporosis,PMO）的重要神经营养因子。在人体及啮齿类动物模型中,NPY通过NPY Y1受体（NPY receptor Y1,NPY1R）和 NPYY2 受体（NPY receptor Y2,NPY2R）调节体内骨量平衡。NPY沉默的小鼠在面对冷刺激时表现为体内皮质酮水平升高,骨量丢失,其骨丢失速度是野生型小鼠的3倍;其分子生物学机制是沉默NPY的小鼠体内中枢和外周组织缺乏NPY,不能通过其相应的NPY2R受体抑制皮质酮的产生,继而对抗应激反应造成的骨量丢失。换言之,NPY具有在应激状态下促进体内骨合成的作用。然而,NPY通过什么信号通路调控骨折后骨代谢及骨形成,仍有待于进一步研究。综上所述,探究NPY与机体成骨的相应分子生物学机制,对改善骨折后巨大骨缺损的预后具有重要意义及研究价值。本研究体内实验中,通过建立C57BL/6小鼠胫骨骨折模型,探究了 NPY及成骨相关基因在骨折初期的细胞分布及表达情况,揭示出NPY可参与骨折早期炎症反应,可能起到骨诱导的作用;在体外实验中,我们合成了 NPY小干扰RNA（siRNA）及NPY过表达质粒,并将其转染入小鼠前成骨MC3T3-E1细胞,进一步检测了 MC3T3-E1细胞成骨相关基因和蛋白的表达情况,揭示了 NPY基因通过上调Runx2、Osterix基因表达促进细胞成骨的分子生物学机制。第一部分神经肽Y在小鼠骨折愈合中的作用及相关机制研究研究目的:1.检测小鼠胫骨闭合骨折愈合过程中NPY在小鼠血清中的表达情况。2.检测小鼠骨折组织愈合过程中成骨相关因子NPY,NPY1R,Runx2,Osterix mRNA及蛋白表达情况。3.分析NPY在小鼠骨折愈合中的生物学效应。研究方法:1.建立C57BL/6小鼠的闭合胫骨骨折模型以18只SPF级C57BL/6雄性小鼠为实验对象,在异氟醚诱导麻醉下人工掰断一侧胫骨建立小鼠胫骨闭合骨折模型,密切监测小鼠饮食及饮水情况。2.动态观察小鼠骨折过程中骨痂形成、重塑分别于建模后第0、1、7、14天,随机取3只小鼠,进行IVIS（?）SpectrumCT检测,观察骨折部位骨痂形成情况。3.检测小鼠骨折愈合过程中血清NPY的表达情况分别于建模后第1、7、14天,随机取出3只小鼠,取血后,采用酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检验 C57BL/6 小鼠血清中NPY的表达水平。4.检测小鼠骨折愈合过程中成骨相关基因及蛋白的表达分别于建模后第1、7、14天,随机取出3只小鼠处死,并取骨折处组织提取RNA,应用RT-PCR技术检测组织样本中NPY,NPY1R,Runx2,Osterix mRNA的表达。取上述小鼠骨折处组织,切片石蜡包埋,行苏木精/伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）或固定在 70%乙醇中分别行 NPY,NPY1R,Runx2,Osterix 的免疫组织化学染色（Immunohistochemical staining,IHC）。利用AI图像分析系统（Alpathwell）自动读取石蜡切片免疫染色区域图像,分析测定阳性染色的灰度值。研究结果:1.成功建立了 C57BL/6小鼠胫骨闭合骨折模型通过大体观察小鼠生活状态,术后第1天,小鼠运动较少,可能小鼠患处有轻微疼痛,但不影响进食和饮水。术后第2天,小鼠可逐渐活动。术后2周,小鼠患肢即可负重行走,有时可见双侧肢体同时站立的情况。提示患肢术后2周有足够强度及硬度支撑体重。2.宏观及微观角度观察动物模型中骨折愈合良好从宏观角度,我们应用IVIS（?）SpectrumCT三维成像系统动态观测小鼠骨折愈合情况。CT显示术后14天骨折线模糊不清,骨折端骨性骨痂形成,提示建模成功。从微观角度我们应用HE染色,观察建模第14天骨折处出现初级骨化中心,并可见新生骨小梁结构,骨性骨痂形成提示建模成功。3.动物模型中血清NPY表达情况应用ELISA法检测了小鼠骨折后14天细胞外血清中NPY的表达情况。NPY不同时间点（建模后第1、7、14天）浓度范围为925.35pg/ml-1055.2pg/ml。NPY浓度在检测的14天的时间段内有一过性下降后逐渐增高趋势,但整体差异无明显统计学意义（P=0.152）。4.小鼠骨折愈合过程中成骨相关基因及蛋白表达情况应用RT-PCR法检测了小鼠骨折愈合过程中成骨相关基因mRNA表达情况,结果显示:NPY mRNA在骨折早期纤维性骨痂组织中高表达,在软骨痂中中等表达,在骨痂中低表达。建模后第7、14天NPY mRNA的表达量分别是第1天的27%和9%,差异具有统计学意义（P<0.001）。NPY1R mRNA表达总体差异性不显着（P=0.133）。建模后第7、14天NPY1R mRNA的表达量分别是第1天NPY1R mRNA的1.6倍和3.8倍。建模后第7、14天Runx2 mRNA的表达量分别是第1天Runx2 mRNA的7.9倍和65.6倍。建模后第7、14天OsterixmRNA的表达量分别是第1天Osterix mRNA的124.0倍和775.1倍。应用蛋白免疫组化染色和AI图像分析系统做了小鼠骨折愈合过程中成骨相关蛋白分析,结果表明:NPY蛋白在骨折早期纤维性骨痂组织中高表达,建模后第7、14天NPY蛋白表达量分别是第1天NPY蛋白的37%和55%,差异有统计学意义（P<0.05）。NPY1R蛋白在小鼠骨折早期组织中高表达。建模后第7、14天NPY1R蛋白表达量分别是第1天NPY1R蛋白的8.2%和21%,差异有统计学意义（P<0.001）。建模后第7、14天Runx2蛋白表达量分别是第1天Runx2蛋白的15%和19%,差异具有统计学意义（P<0.001）。建模后第7、14天的Osterix蛋白表达量分别是第1天Osterix蛋白的12%和10%,差异有统计学意义（P<0.001）。研究结论:1.NPY基因及蛋白共同参与骨折早期炎症反应,可能起到骨诱导的作用。2.骨折愈合相应成骨因子NPY、NPY1R、Runx2和Osterix的表达存在时间及空间特异性。第二部分神经肽Y在小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中的表达和生物学功能研究目的:1.检测过表达或干扰NPY后在MC3T3-E1细胞中NPY mRNA和蛋白的表达情况。2.观测NPY对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。研究方法:1.构建3种NPY siRNA序列构建针对 NPY 基因的 siRNA1、siRNA2、siRNA3 序列。应用 RFect siRNA转染试剂法转染后,应用反转录定量（RT-qPCR法）检测转染3种siRNA 48小时后细胞NPY mRNA的表达情况,筛选出干扰效率最高的NPY siRNA序列。2.构建NPY过表达质粒并测序验证构建NPY过表达质粒,测序验证后应用RFect DNA转染试剂将NPY过表达质粒及对照质粒载体转染入MC3T3-E1细胞,验证NPY细胞内表达情况。3.检测不同干预组MC3T3-E1细胞中NPY mRNA的表达情况将NPY siRNA、scrambled siRNA、NPY过表达质粒、空白质粒分别转染入MC3T3-E1细胞中,应用RT-qPCR法于第4、7天检测NPY mRNA的表达情况。4.检测过表达或干扰NPY后MC3T3-E1细胞中NPY蛋白的表达情况按照分组分别于MC3T3-E1细胞中加入对应的干扰或过表达质粒,应用半定量蛋白检测（Western blot）法于第4、7天检测各组中NPY的蛋白表达情况。5.观察过表达或干扰NPY后MC3T3-E1细胞成骨变化复苏MC3T3-E1细胞,加入成骨诱导培养液培养,按照分组分别加入对应的干扰或过表达质粒,14天后,分别行茜素红、碱性磷酸酶（ALP）、β-catenin免疫荧光染色后镜下观察细胞成骨情况。研究结果:1.成功筛选出干扰效率最佳的NPY siRNA成功制备三种包含目的基因NPY的siRNA1、siRNA2、siRNA3,验证NPY siRNA3在胞内干扰效率最高,为75%。因此,选用siRNA3做后续实验。2.成功制备NPY过表达质粒NPY过表达质粒构建成功后,测序验证符合NPY序列。3.过表达及干扰NPY后检测细胞NPY基因表达的影响过表达NPY可显着促进细胞NPY mRNA的表达,第4天增加了 3.9倍,第7天增加了 4.3倍（P<0.001）。应用siRNA干扰NPY后,可显着减低NPY mRNA的表达,在第4天下降了 75%（P<0.05）,第7天下降了 55%。4.过表达及干扰NPY后检测细胞NPY蛋白表达的影响过表达NPY可显着促进细胞NPY蛋白的表达,第4、7天,NPY蛋白分别增加了 1.2倍和1.5倍（P<0.05）。应用siRNA干扰NPY后,可显着降低细胞NPY蛋白的表达,第4、7天,NPY蛋白分别降低了 45%和35%（P<0.05）。5.过表达及干扰NPY后检测细胞成骨分化的影响茜素红染色显示过表达NPY后MC3T3-E1细胞数目增多,体积较大,核染色较深,胞内粒子增多,可见较多的紫红色钙结节;应用siRNA干扰NPY后,细胞数目较少,核染色较浅,可见较少的紫红色钙结节。ALP染色显示过表达NPY后细胞数目增多,体积较大,核染色较深,胞内黄色钙盐沉积较多,可见较多蓝色颗粒或块状沉淀。应用siRNA干扰NPY后,细胞数目较少,核染色较浅,蓝色颗粒较少。β-catenin免疫荧光细胞染色显示过表达NPY后细胞核数目增多,细胞质内绿色荧光较多,应用siRNA干扰NPY后,细胞核数目较少,胞质内绿色荧光较少。研究结论:1.干扰NPY可抑制MC3T3-E1细胞成骨分化。2.过表达NPY可促进MC3T3-E1细胞成骨分化。第三部分神经肽Y上调Runx2、Osterix表达促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨的机制研究研究目的:揭示NPY上调MC3T3-E1细胞成骨特异性转录因子Runx2、Osterix表达,促进MC3T3-E1细胞成骨分化的机制。研究方法:1.过表达及干扰NPY后检测MC3T3-E1细胞中Runx2、Osterix、ALP、OCN mRNA的表达情况将NPY siRNA和NPY过表达质粒分别转染入MC3T3-E1细胞中,应用RT-qPCR 法于第 4、7 天观察 Runx2、Osterix、ALP、OCN mRNA 的表达情况。2.过表达及干扰NPY后检测MC3T3-E1细胞中Runx2、Osterix、ALP、OCN蛋白的表达情况将NPY siRNA和NPY过表达质粒分别转染入MC3T3-E1细胞中应用Western blot法于第4、7天检测各组中Runx2、Osterix、ALP、OCN的表达情况。研究结果:1.NPY上调MC3T3-E1细胞Runx2、Osterix基因的表达1.1过表达或干扰NPY后检测细胞Runx2和Osterix基因表达的影响过表达NPY可明显上调MC3T3-E1细胞Runx2和Osterix基因的表达,Runx2 mRNA较对照组在第4、7天分别增加了 5.4倍和6倍。Osterix mRNA在第4、7天分别增加了 2.7倍和3倍。应用siRNA干扰NPY后,Runx2 mRNA在第4、7天分别下降了 50%和35%。Osterix mRNA在第4、7天分别下降了 80%（P<0.001）和 55%。1.2过表达或干扰NPY后检测细胞Runx2和Osterix蛋白表达的影响过表达NPY可显着上调MC3T3-E1细胞Runx2和Osterix蛋白的表达,Runx2蛋白较对照组第4、7天分别增长了 1.6和1.2倍;Osterix蛋白表达第4、7天分别增长了 1.6和2.1倍（P<0.05）。应用siRNA干扰NPY后,Runx2蛋白表达第4、7天分别下降了 40%和55%;Osterix蛋白表达第4、7天分别下降了 60%和55%（P<0.05）。2.NPY促进MC3T3-E1细胞成骨分化2.1 过表达或干扰NPY后检测细胞ALP和OCN基因表达的影响过表达NPY显着上调MC3T3-E1细胞ALP和OCN基因的表达,ALP mRNA较对照组第4、7天分别增加了 3.7倍和4.9倍,OCN mRNA在第4天和第7天分别增加了 4.0倍和4.3倍（P<0.001）。应用siRNA干扰NPY后,ALP mRNA在第4、7天分别降低了 56%（P<0.05）和26%,OCN mRNA第4天和第7天分别降低了 60%（P<0.05）和 35%。2.2过表达或干扰NPY后检测细胞ALP和OCN蛋白表达的影响过表达NPY明显上调MC3T3-E1细胞ALP和OCN蛋白的表达,ALP蛋白较对照组第4、7天均增加了 1.6倍;OCN蛋白第4、7天分别增加了 1.4和1.6倍（P<0.05）。应用siRNA干扰NPY后,ALP蛋白第4天和第7天分别减少了 60%和60%;OCN蛋白第4、7天分别减少了 64%和78%（P<0.05）。研究结论:1.NPY通过上调Runx2、Osterix基因的表达促进MC3T3-E1细胞成骨。2.NPY有望成为创伤后促进骨折愈合的靶点。课题的创新性和局限性课题的创新性:（1）本课题系统阐述了小鼠骨折愈合早、中期不同细胞NPY、NPY1R、Runx2和Osterix的mRNA及蛋白分布表达情况,并部分揭示了 NPY可参与骨折早期炎症反应,可能起到骨诱导的作用。（2）本课题成功筛选出干扰效率最高NPY siRNA并制备了 NPY过表达质粒,验证了 NPY在小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中的表达和生物学功能,从而为深入研究NPY的分子生物学机制创造了条件。（3）本课题揭示了 NPY可上调Runx2和Osterix表达促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的生长、分化,阐明了 NPY调控前成骨细胞成骨分化的潜在生物学机制。课题的局限性:（1）体外细胞学实验研究了单一成骨细胞系,后续可增加人体原代培养成骨细胞系,来进一步阐述NPY的生物学效应。（2）本研究仅建立了创伤性骨折模型,而未建立骨质疏松脆性骨折模型,今后可行进一步的研究来阐述NPY在不同类型骨折中的作用及相关机制。

田叶红^[3]（2021）在《基于肿瘤神经新生学说探讨p75NTR介导的电针围刺的抑瘤机制》文中指出神经新生已成为肿瘤的重要获得性特征之一,研究表明通过基因技术特异性操控乳腺癌神经,激活交感神经促进乳腺癌进展,激活副交感神经抑制乳腺癌生长。神经调控肿瘤的分子机制成为肿瘤研究的热点,阻断神经为抗肿瘤治疗提供重要靶标。然而,目前针对神经生长的相关因子及受体的抑制剂研究正处于初始阶段。围刺为传统中医刺法,可沟通局部经脉、络脉、浮络和皮部之间的联系,以理气活血、化瘀通络。针对肿瘤的围刺,即以肿瘤局部为中心,沿肿瘤边缘进行多针包围性针刺。前期研究显示电针围刺后肿瘤组织内p75神经营养因子受体（p75 neurotrophin receptor,p75NTR）表达明显增多,与抑瘤率变化趋势一致,且参与调控了肿瘤内的轴突导向因子Sema3a表达,提示围刺可能影响肿瘤神经。但围刺是否能够调控肿瘤神经及相关机制,仍有待进一步的研究阐明。本研究第一部分为文献综述,包括两方面:一是从临床应用角度,对围刺疗法及瘤周注射在肿瘤的运用和疗效进行整理、总结;二是从现代医学角度,梳理和总结了肿瘤神经新生及p75NTR在乳腺癌中的研究进展。第二部分为实验研究:目的:1比较不同围刺法对乳腺癌移植瘤肿瘤生长及癌细胞凋亡的影响;2观察电针围刺对肿瘤神经、神经递质、神经营养因子（NTs）及相应受体的影响;3通过有参转录组测序获取电针围刺相关的差异基因表达,并通过生物信息学分析探索电针围刺调控肿瘤神经的候选靶基因和相关分子机制;4以p75NTR为突破口,通过电针围刺后抑制p75NTR信号转导,观察p75NTR对电针围刺调控神经、细胞凋亡及肿瘤生长的影响。方法:构建4T1乳腺癌小鼠移植瘤模型,实验一分为TG组（模型组）、ETG组（电针围刺组）、ATG组（毫针围刺组）,TG组小鼠每天抓握3min,ETG组予电针围刺3min/天,ATG组予毫针围刺3min/天,于干预后1周、2周、3周取材,绘制生长曲线、计算抑瘤率,TUNEL检测肿瘤细胞凋亡,比较电针与毫针围刺对肿瘤生长、癌细胞凋亡的影响。实验二分为TG组、ETG组、NG组（空白组）、ENG组（空白电针组）,TG组、ETG组干预同实验一,NG组、ENG组均为正常小鼠,其中NG组每天抓握3分钟,ENG组电针围刺,其针刺部位、方法与ETG组一致,通过HE、IHC、ELISA检测,以明确电针围刺对肿瘤神经、神经递质、NTs及受体的影响。实验三样本来自实验二,取TG组与ETG组干预1周的肿瘤组织冰冻样本,每组各3个,共6个样本用于有参转录测序,并通过生物信息分析,以探索电针围刺对肿瘤神经的调控作用及潜在机制。基于前期研究电针围刺对p75NTR的上调作用,实验四分为TG组、ETG组、ETTG组（TP组,即p75NTR抑制剂组）,TG组、ETG组干预同前,ETTG组电针干预同ETG组,并在电针后15分钟腹腔注射p75NTR受体抑制剂TAT-Pep5（75μg/kg·d）,以明确抑制p75NTR信号传导对肿瘤神经、肿瘤细胞凋亡及肿瘤生长的影响。结果:1电针与毫针围刺抑制4T1小鼠乳腺癌肿瘤生长的比较（1）肿瘤生长曲线显示,ETG组肿瘤生长最慢,TG组最快,ATG介于ETG组与TG组之间;在实验干预第15天,三组肿瘤生长曲线开始趋于一致。肿瘤体积的组间比较显示,ETG组肿瘤体积于实验干预第5-18天较TG组显着缩小（p<0.05）,ATG组肿瘤体积于实验干预第6-14天较TG组显着缩小（p<0.05）。（2）三个取材时点的瘤重比较,ETG组瘤重最小,TG组瘤重最大,ATG组瘤重介于ETG组与TG组之间。（3）在三个取材时点,ETG组抑瘤率分别为36.93%、46.49%、27.89%,ATG组抑瘤率分别30.79%、26.61%、21.67%。（4）TUNEL染色结果显示,ETG组在三个取材时点的癌细胞凋亡指数均显着高于ATG组与TG组（p<0.05）,且在实验干预2周的凋亡指数最高,ATG组的凋亡指数与TG组相当。2电针围刺对4T1小鼠乳腺癌神经的影响（1）HE染色、IHC标记PGP 9.5均提示4T1小鼠乳腺癌肿瘤组织和癌旁组织有神经支配。（2）β3-tubulin+神经:ETG组β3-tubulin+神经束在实验干预1周、2周均少于TG组,至实验干预3周两组无差别;ETG组神经纤维在三个取材时点均多于TG组;IPP半定量分析β3-tubulin+表达面积显示,ETG组在三个取材时点β3-tubulin+表达面积均显着少于TG组（p<0.05）。（3）TH+交感神经:TH+神经纤维呈细丝状,分布于肿瘤间质,且多围绕在血管周围,ETG组在三个取材时点的TH+神经纤维均显着少于TG组。（4）血清神经递质:ENG组NE、ACH、AD较NG组均有一过性升高趋势,其中仅干预3周的AD差异有显着统计学意义;ETG组NE、ACH、SP含量较TG组有一过性升高趋势,其中仅第3周NE差异有显着统计学意义。（5）肿瘤组织神经递质:ETG组在三个取材时点的NE含量均低于TG组,其中干预2周、3周差异有统计学意义;ETG组 ACH水平均低于TG组,其中干预2周差异有统计学意义。（6）血清NTs:NGF、BDNF、NT-3、NT-4含量在三个取材时点组间比较均无差异。（7）肿瘤组织NTs:ETG组在干预1周、2周的NGF含量均明显高于TG组（p<0.05）,ETG组在干预3周的NT-3水平显着高于TG组（p<0.05）,BDNF、NT-4水平在ETG与TG组均无差异,ETG组proNGF相对表达量在三个取材时点均显着高于TG组（p<0.05）。（8）NTs相关受体:ETG组在三个取材时点的p75NTR相对表达量均显着高于TG组（p<0.05）,TrkA、TrkB相对表达量在ETG与TG组均无差异。3有参转录组测序探索电针围刺对肿瘤神经的作用相较于TG组,ETG组共获得116个差异基因,其中66个上调基因,50个下调基因,GO功能注释分析显示电针围刺相关的差异基因主要与免疫反应、细胞死亡与稳态、氧化应激、物质与能量代谢等生物学过程相关,KEGG通路富集分析显示电针围刺相关的差异表达基因主要与神经、免疫反应、物质与能量代谢相关,其中在神经的生物学过程中,包含四个神经递质兴奋性突触通路和一个神经轴突导向通路,涉及1 1个差异基因,5-HT2、VGCC、COX、TRPC1、Ablim 下调,Gi/o、PLA2、GLS、CREB、Boc、Netin-G2上调,涵盖胞吐、钙离子内流、神经兴奋性、神经保护、轴突导向、神经递质释放的反馈抑制调节、突触可塑性等生物学功能。4 p75NTR介导电针围刺调控肿瘤神经及癌细胞凋亡的机制腹腔注射TAT-Pep5以抑制p75NTR信号传导,观察电针围刺对肿瘤神经、癌细胞凋亡的影响。（1）β3-tubulin+神经:ETTG组β3-tubulin+神经总数和神经纤维较ETG组和TG组均有减少趋势（p>0.05）,而β3-tubulin+神经束比ETG组和TG组有增多趋势（p>0.05）,此外,ETTG组在实验干预1周、2周β3-tubulin+表达面积显着高于ETG组（p<0.05）。（2）TH+神经:ETTG组TH+神经纤维在三个取材时点均显着多于ETG组（p<0.05）;ETTG组在干预1周、2周的TH+神经纤维与TG组相当,至干预3周明显少于TG组（p<0.05）。（3）肿瘤组织神经递质（NE、ACH）:ETTG组肿瘤组织NE含量介于TG组与ETG组之间;ETTG组肿瘤组织ACH含量在三个取材时点均高于ETG组,其中实验干预2周的差异有统计学意义,但与TG组无差异。（4）肿瘤组织NGF、proNGF:ETTG组在三个取材时点的NGF含量均显着高于TG组（p<0.05）,在实验干预1周与ETG组相当,2周显着低于ETG组,3周高于ETG组;对于proNGF,在三个取材时点ETTG组proNGF表达均与ETG组相当,而显着高于TG组（p<0.05）。（5）肿瘤生长:ETTG组瘤体、瘤重均介于ETG组与TG组之间,三个取材时点ETTG组的抑瘤率显着低于ETG组（p<0.05）。（6）癌细胞凋亡:ETTG组在三个取材时点的凋亡指数均显着低于ETG组（p<0.05）,而与TG组相当。结论:1单纯电针与毫针围刺均可抑制肿瘤生长,电针围刺较毫针围刺抑瘤作用更强、更持久,其中电针围刺的抑瘤机制之一为癌细胞凋亡增加。2电针围刺调控肿瘤神经,具体表现为促进神经新生、抑制神经浸润（PNI）和交感神经形成,调节肿瘤组织神经递质（ACH、AD、NE）、NTs（NGF、proNGF、NT-3）水平,上调 p75NTR 表达,可能为电针围刺抑瘤潜在分子机制。3电针围刺可能通削弱胞吐、抑制钙离子内流、调节神经兴奋性等作用抑制神经递质释放,及通过促进神经保护和轴突导向而诱导神经轴突生成,以调控肿瘤微环境。4电针围刺上调p75NTR/proNGF信号转导诱导癌细胞凋亡而直接抑制肿瘤生长,同时经由p75NTR介导以抑制PNI和交感神经支配,下调肿瘤组织NE、ACH水平,以调控肿瘤微环境而发挥间接抑瘤作用。

周辉^[4]（2021）在《神经相关因子在结直肠癌患者中的表达及迷走神经对免疫微环境的影响》文中研究指明结直肠癌是消化道的常见恶性肿瘤之一,发病率呈逐年升高的趋势。对于结直肠癌的治疗,目前仍采用以手术治疗为主、化疗为辅的治疗方案。近年来随着靶向药物治疗的发展,化疗联合靶向药物治疗为结直肠癌患者带来了更好的临床效果,同时免疫治疗的突破进展,为结直肠癌晚期患者带来新的希望。尽管这些治疗方法可以适当延长结直肠癌患者的中位生存期,但复杂的细胞相互作用、免疫微环境、免疫治疗的毒性反应等仍需我们寻找新的目标靶点,以改善结直肠癌患者的生存率。越来越多的证据显示,肿瘤微环境中存在神经新生,且神经发生与血管生成一样,也是肿瘤侵袭行为的一个重要特征。目前普遍被接受的观点是,癌细胞和神经之间相互作用,相互促进。癌细胞可以分泌神经营养因子、神经因子和轴突诱导分子,诱导神经纤维以类似血管生成和淋巴管生成的方式形成新生神经,另一反面,新生的神经释放的各类因子（包括各种神经递质）诱导肿瘤细胞及基质细胞增殖,导致免疫细胞活性抑制,形成有利于肿瘤细胞存活和增殖的微环境。自主神经系统与消化系统疾病密切相关。迷走神经对结直肠癌的作用及机制研究尚少,且存在争议,因此需要我们深入的研究迷走神经在结直肠癌中的相关作用途径,为结直肠癌寻找新的治疗方向提供理论依据。本研究通过免疫组化法检测结直肠癌组织中的自主神经分布,并检测α9n ACh R在肿瘤组织中的表达情况,分析与临床病理参数及预后的关系,了解自主神经系统在结直肠癌中的作用。Elisa法检测迷走神经递质乙酰胆碱、神经肽P物质及其他神经递质5-羟色胺、血管活性肠肽在结直肠癌中的表达及临床意义,了解迷走神经是否通过神经因子的释放作用于结直肠癌。构建小鼠原位移植瘤模型来模拟结直肠癌的肿瘤微环境,观察不同迷走神经状态（切断或刺激）下,肿瘤微环境中炎症因子的变化及外周血中免疫细胞的疲乏状态,来说明迷走神经可能通过神经因子的作用,改变肿瘤微环境的免疫状态,发挥其促进肿瘤发生发展的作用。第一部分自主神经及乙酰胆碱相关受体α9n ACh R在结直肠癌中的表达及其临床意义目的:探讨交感神经,副交感神经的数量、分布以及乙酰胆碱相关受体α9n ACh R表达与人结直肠癌进展及预后的关系。方法:1.以酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）作为交感神经标记物,以囊泡乙酰胆碱转运体（vesicular acetylcholine transporter,VACh T）作为副交感神经的标记物,采用免疫组化法（S-P）检测90例结直肠癌组织中的自主神经分布,并检测α9n ACh R在肿瘤组织中的表达情况。2.采用统计方法分析交感神经、副交感神经及α9n ACh R与结直肠癌临床病理参数及预后的关系。结果:1.临床病理特征结肠癌35例（38.89%）,直肠癌55例（61.11%）。男性43例（47.78%）,女性47例（52.22%）。根据术后病理,TNM分期:T分期:T1,2例（2.22%）,T2,20例（22.22%）,T3,29例（32.22%）,T4,39例（43.33%）。淋巴结转移阴性48例（53.33%）,淋巴结转移阳性42例（46.67%）。2.交感神经多位于邻近肿瘤细胞的间质内。交感神经阳性的患者淋巴结转移率低于交感神经阴性患者（P=0.018）,肿瘤微环境中交感神经阳性者的患者预后优于交感神经阴性的患者（P=0.036）。3.副交感神经大多分布于肿瘤周边,在血管周边亦发现副交感神经。年龄>60的病人副交感神经阳性率高于年龄≤60的病人（P=0.034）;淋巴结转移阳性病人的副交感神经阳性率高于淋巴结转移阴性的病人（P=0.011）;随着T分期的增高,副交感神经阳性率逐渐升高,肿瘤微环境中副交感神经阳性的患者预后差于副交感神经阴性的患者（P=0.005）。4.α9n ACh R在结直肠癌细胞的细胞膜及细胞质中阳性表达。年龄>60的病人α9n ACh R阳性率高于年龄≤60的病人（P=0.026）;淋巴结转移阳性病人的α9n ACh R阳性率高于淋巴结转移阴性的病人（P=0.023）;随着T分期的增高,α9n ACh R阳性率逐渐升高,与α9n ACh R阴性者相比,表达阳性者的预后差（P=0.005）。小结:交感神经多见于肿瘤早期,提示预后较好;副交感神经和α9n ACh R多见于肿瘤晚期,提示预后较差。副交感神经可能通过α9n ACh R促进结直肠癌的进展。第二部分乙酰胆碱、P物质、5-羟色胺、血管活性肠肽在结直肠癌患者中的表达目的:检测结直肠患者血浆中乙酰胆碱、P物质、5-羟色胺、血管活性肠肽的表达情况,探讨迷走神经相关递质在结直肠癌患者血浆中的临床表达意义。方法:1.采用Elisa的方法检测46例结直肠癌患者外周血标本中乙酰胆碱、P物质、5-羟色胺、血管活性肠肽的表达。2.评价乙酰胆碱、P物质、5-羟色胺、血管活性肠肽的表达情况;采用统计方法分析乙酰胆碱、P物质、5-羟色胺、血管活性肠肽与结直肠癌患者临床病理参数之间的关系。结果:1.临床病理特征结肠癌21例（45.65%）,直肠癌25例（54.35%）。男性27例（58.70%）,女性19例（41.30%）,≤60岁17例（36.96%）,>60岁29例（63.04%）。根据术后病理,TNM分期:T分期:T1,8例（17.39%）,T2,7例（15.22%）,T3,7例（15.22%）,T4,24例（52.17%）。淋巴结转移阴性14例（30.43%）,淋巴结转移阳性32例（69.57%）。术前CEA正常（1-5ng/ml）28例（60.87%）,增高（>5ng/ml）18例（39.13%）。2.乙酰胆碱与年龄、性别、肿瘤部位、CEA水平无相关性（P>0.05）;淋巴结转移阳性患者的乙酰胆碱表达量显着高于淋巴结转移阴性患者的乙酰胆碱表达量（P=0.044）;乙酰胆碱的表达量与T分期呈正相关（P<0.05）。3.P物质与年龄、性别、肿瘤部位、CEA水平、T分期无显着相关性（P>0.05）;淋巴结转移阳性患者的P物质表达量显着高于淋巴结转移阴性患者的P物质表达量（P=0.009）。4.5-羟色胺与年龄、性别、肿瘤部位、CEA水平无相关性（P>0.05）;淋巴结转移阳性患者的5-羟色胺表达量显着高于淋巴结转移阴性患者的5-羟色胺表达量（P=0.007）;5-羟色胺的表达与T分期呈正相关（P=0.030）。5.血管活性肠肽与年龄、性别、肿瘤部位、CEA水平无相关性（P>0.05）;淋巴结转移阳性患者的血管活性肠肽表达量显着高于淋巴结转移阴性患者的血管活性肠肽表达量（P=0.014）;血管活性肠肽的表达与T分期呈正相关（P=0.039）。小结:结直肠癌患者血浆中迷走神经递质乙酰胆碱及其他神经递质5-羟色胺、血管活性肠肽的表达均与T分期呈正相关;淋巴结转移阳性的患者中乙酰胆碱、5-羟色胺、血管活性肠肽及神经肽P物质的表达均明显高于淋巴结转移阴性的患者。第三部分迷走神经通过对免疫微环境的作用影响结直肠癌的发生、发展目的:通过构建小鼠结直肠癌原位移植瘤模型,建立迷走神经切断的小鼠结直肠癌模型,探讨不同迷走神经状态对移植瘤的大小的影响。研究不同迷走神经状态,肿瘤组织中炎性细胞因子的水平,来了解肿瘤微环境中的炎症状态,同时了解淋巴细胞的疲乏状态,探究迷走神经对肿瘤微环境中免疫状态的影响。方法:1.构建小鼠结直肠癌原位移植瘤模型,进而建立迷走神经切断模型。2.统计学分析不同迷走神经状态,小鼠结直肠癌原位移植模型的成瘤大小情况。3.免疫组化染色测定IL-1,IL-10,IL-8细胞因子的表达水平。4.流式细胞术测定PD-1及Tim-3在CD4+T细胞上的表达水平。结果:1小鼠原位移植瘤模型的建立迷走神经刺激组、迷走神经切断组及对照组小鼠均成活,4周后均有肉眼成瘤,并在体视显微镜下成功实施小鼠颈部单侧迷走神经切断。HE染色镜下观察所有小鼠结直肠种植肿瘤标本均证实为肿瘤组织。2三组小鼠成瘤情况三组小鼠均未见淋巴结转移。迷走神经切断组、迷走神经刺激组及对照组三组小鼠肿瘤体积分别为（0.247±0.051）mm3,（0.528±0.076）mm3,（0.487±0.051）mm3。迷走神经刺激组与迷走神经切断组相比,成瘤体积显着增大,差异具有统计学意义（P<0.05）;对照组与迷走神经切断组相比,成瘤体积显着增大,差异具有统计学意义（P<0.05）,而迷走神经刺激组与对照组成瘤体积相比差异无统计学意义（P>0.05）。3免疫组化结果3.1迷走神经切断组、迷走神经刺激组及对照组三组肿瘤组织中IL-1的阳性表达率分别为40%（4/10）,100%（10/10）,50%（5/10）。迷走神经刺激组与迷走神经切断组及对照组相比,IL-1的阳性表达率显着增大（刺激组vs.切断组:P<0.05;刺激组vs.对照组:P<0.05）,而迷走神经切断组与对照组IL-1的阳性表达率相比差异无统计学意义（P>0.05）。3.2迷走神经切断组、迷走神经刺激组及对照组三组肿瘤组织中IL-8的阳性表达率分别为30%（3/10）,100%（10/10）,40%（4/10）。迷走神经刺激组与迷走神经切断组及对照组相比,IL-8的阳性表达率显着增大（刺激组vs.切断组:P<0.05;刺激组vs.对照组:P<0.05）,而迷走神经切断组与对照组IL-8的阳性表达率相比差异无统计学意义（P>0.05）。3.3迷走神经切断组、迷走神经刺激组及对照组三组肿瘤组织中IL-10的阳性表达率分别为20%（2/10）,100%（10/10）,40%（4/10）。迷走神经刺激组与迷走神经切断组及对照组相比,IL-10的阳性表达率显着增大（刺激组vs.切断组:P<0.05;刺激组vs.对照组:P<0.05）,而迷走神经切断组与对照组IL-10的阳性表达率相比差异无统计学意义（P>0.05）。4.流式细胞术结果4.1迷走神经切断组、迷走神经刺激组及对照组三组外周血中CD4+T细胞表面PD-1+的表达率分别为（0.692士0.409）%,（1.126士0.472）%,（0.754士0.281）%。迷走神经刺激组CD4+T细胞表面PD-1+的表达率显着高于迷走神经切断组及对照组（刺激组vs.切断组:P<0.05;刺激组vs.对照组:P<0.05）,而迷走神经切断组与对照组CD4+T细胞表面PD-1+的表达率相比差异无统计学意义（P>0.05）。4.2迷走神经切断组、迷走神经刺激组及对照组三组外周血中CD4+T细胞表面Tim-3+的表达率分别为（0.979士0.359）%,（1.466士0.600）%,（0.978士0.592）%。迷走神经刺激组CD4+T细胞表面Tim-3+的表达率显着高于迷走神经切断组及对照组（刺激组vs.切断组:P<0.05;刺激组vs.对照组:P<0.05）,而迷走神经切断组与对照组CD4+T细胞表面Tim-3+的表达率相比差异无统计学意义（P>0.05）。5相关性分析刺激组中IL-1表达与PD-1+表达呈正相关（P=0.002）;IL-8表达与PD-1+表达呈正相关（P=0.025）;IL-10表达与PD-1+表达呈正相关（P=0.001）。IL-1表达与Tim-3+表达呈正相关（P=0.002）;IL-8表达与Tim-3+表达呈正相关（P=0.025）;IL-10表达与Tim-3+表达呈正相关（P=0.005）。小结:小鼠原位结直肠癌移植模型成功建立。结果表明迷走神经刺激组小鼠成瘤体积较迷走神经切断组显着增大,迷走神经参与了结直肠癌的发生。迷走神经刺激上调了肿瘤组织中IL-1、IL-8、IL-10的表达水平,反映了淋巴细胞向肿瘤组织的募集,促进肿瘤的炎性微环境的形成,同时,促进淋巴细胞中PD-1、Tim-3的表达,诱导淋巴细胞的疲乏状态,形成肿瘤的免疫逃逸,IL-1、IL-8、IL-10的表达与淋巴细胞中PD-1、Tim-3的表达呈正相关,进而形成了肿瘤免疫抑制微环境。结论:1.交感神经多见于肿瘤早期,提示预后较好;副交感神经和α9n ACh R多见于肿瘤晚期,提示预后较差。副交感神经可能通过α9n ACh R促进结直肠癌的进展。2.结直肠癌患者血浆中迷走神经递质乙酰胆碱、神经肽P物质及其他神经递质5-羟色胺、血管活性肠肽的表达均与T分期呈正相关;淋巴结转移阳性的患者中乙酰胆碱、5-羟色胺、血管活性肠肽的表达均明显高于淋巴结转移阴性的患者。3.小鼠原位结直肠癌移植模型成功建立。结果表明迷走神经刺激组小鼠成瘤体积较迷走神经切断组显着增大,迷走神经参与了结直肠癌的发生。迷走神经刺激上调了肿瘤组织中IL-1、IL-8、IL-10的表达水平,反应了淋巴细胞向肿瘤组织的募集,促进肿瘤的炎性微环境的形成,同时,促进淋巴细胞中PD-1、Tim-3的表达,诱导淋巴细胞的疲乏状态,形成肿瘤的免疫逃逸,IL-1、IL-8、IL-10的表达与淋巴细胞中PD-1、Tim-3的表达呈正相关,进而形成了肿瘤免疫抑制微环境。

李占峰^[5]（2020）在《内源性孤啡肽通过调节交感神经活性与去甲肾上腺素转运蛋白影响大鼠缺血性心律失常》文中研究指明目的:急性心肌缺血早期可以引发严重的室性心律失常,对患者的预后有重大的影响,并可导致猝死。缺血性室性心律失常发生的病理过程是在各种因素参与下进行的,在此过程中,心脏感觉神经和交感神经激活程度的过度增加扮演了重要角色。在前期研究中,本课题组发现在急性心肌缺血早期时,通过拮抗内源性孤啡肽受体,可以减少缺血性心律失常的发生,然而其具体的机制仍不明朗。本研究旨在探讨内源性孤啡肽参与缺血性心律失常与心脏交感神经活性和去甲肾上腺素转运蛋白表达的关系,为进一步研究缺血性心律失常的机制提供实验依据。方法:实验动物为健康成年雄性SD大鼠,67周龄,质量250270g。大鼠急性心肌缺血模型是通过对大鼠左冠状动脉前降支结扎制备的。本实验由三部分组成:第一部分拮抗内源性孤啡肽受体对大鼠急性心肌缺血早期（15min内）室性心律失常发生的影响大鼠分成三组:即假手术组（Sham组）、冠脉结扎组（CAO组）和孤啡肽拮抗剂（UFP-101）预处理组（U+CAO组）。Sham组开胸、冠脉下穿线但不结扎;CAO组开胸并结扎冠脉;U+CAO组在开胸冠脉结扎前10min,将特异性孤啡肽拮抗剂UFP-101（1×10-9mol/L）按1ml/kg经尾静脉注射,另外两组尾静脉注射等量的生理盐水。记录并分析术前10min至心肌缺血后15min内的室性心律失常数据。第二部分拮抗内源性孤啡肽受体对大鼠急性心肌缺血早期（15min内）血浆去甲肾上腺素水平及心率变异度的影响记录并分析术前10min至心肌缺血后15min内的心率变异度（HRV）;心肌缺血15min后,用注射器从左心室缓慢匀速抽取1ml血液,收集在含有K-EDTA的试管中,离心得到血浆,将血浆样本在-80℃下保存待测。血浆样本采用酶联免疫吸附测定试验（ELISA）检测。第三部分拮抗内源性孤啡肽受体对大鼠急性心肌缺血早期（15min内）去甲肾上腺素转运蛋白表达的影响心肌缺血15min后,利用蛋白质印迹法（Western blot）检测大鼠缺血区心肌中去甲肾上腺素转运蛋白的总蛋白及膜蛋白表达。结果:1.各组大鼠急性心肌缺血后15min内室性心律失常的发生情况Sham组大鼠冠脉下穿线后,仅发生室性早搏,而室性心动速和心室颤动没有发生。与Sham组相比,CAO组的室性早搏次数、室速+室颤发生频次、室速+室颤持续时间、心律失常评分均上升,且差异有统计学意义（P<0.05或P<0.017）,与Sham组相比,U+CAO组的室性早搏次数上升,而室速+室颤发生频次、室速+室颤持续时间、心律失常评分差异无统计学意义（P>0.05）;与U+CAO组相比,CAO组的室性早搏次数、室速+室颤发生频次、室速+室颤持续时间、心律失常评分进一步上升,且差异有统计学意义（P<0.05或P<0.017）。2.各组大鼠急性心肌缺血后15min血浆去甲肾上腺素水平比较与Sham组相比,U+CAO组、CAO组的血浆去甲肾上腺素水平均升高,且差异有统计学意义（P<0.05）;与U+CAO组相比,CAO组的血浆去甲肾上腺素水平进一步升高,且差异有统计学意义（P<0.05）。3.各组大鼠急性心肌缺血后15min心率变异度比较与Sham组相比,U+CAO组、CAO组的SDNN、RMSSD、HF值均降低,且差异有统计学意义（P<0.05）,而U+CAO组、CAO组两组间SDNN、RMSSD、HF值差异无统计学意义（P>0.05）;与Sham组相比,U+CAO组、CAO组的LF/HF值升高,且差异有统计学意义（P<0.05）;与U+CAO组相比,CAO组的LF/HF值进一步升高,且差异有统计学意义（P<0.05）。4.各组大鼠急性心肌缺血后15min去甲肾上腺素转运蛋白的表达Sham组、U+CAO组、CAO组三组间去甲肾上腺素转运蛋白总蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）;与Sham组相比,CAO组去甲肾上腺素转运蛋白膜蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）,U+CAO组去甲肾上腺素转运蛋白膜蛋白表达水平下调,差异有统计学意义（P<0.05）;与CAO组相比,U+CAO组去甲肾上腺素转运蛋白膜蛋白表达水平下调,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:急性心肌缺血早期,心脏交感神经活性增高和去甲肾上腺素转运蛋白功能变化可以引发缺血性心律失常,而拮抗内源性孤啡肽受体是可以降低心脏交感神经活性和调节去甲肾上腺素转运蛋白膜蛋白表达变化的原因之一,即拮抗内源性孤啡肽受体可通过减弱心脏交感神经活性及调节去甲肾上腺素转运蛋白膜蛋白表达进而减少大鼠急性缺血性心律失常的发生。

吴伟强^[6]（2020）在《运动调控外周NPY表达对动脉粥样硬化影响的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景随着人们生活水平的不断提高,动脉粥样硬化性心血管病（atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD）已经成为目前威胁人类健康的主要疾病之一。大量研究表明,有规律的体育锻炼可以有效防治ASCVD的发生发展。然而,运动抗动脉粥样硬化作用的分子机制尚不完全清楚。神经肽Y（neuropeptide Y,NPY）是一种36-氨基酸残基肽,广泛分布于所有支配心血管系统的交感神经中。NPY除了起源于神经元外,还可在多种血管细胞中合成和释放,包括内皮细胞（endothelial cells,ECs）、免疫细胞和巨核细胞/血小板。既往研究发现NPY及其受体参与动脉粥样硬化的进展,可引起血管收缩,促进血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMC）增殖和肥大,刺激血管内皮细胞增殖和向毛细血管样管分化。此外,NPY还参与了巨噬细胞的活化,促进炎症因子的释放,调节巨噬细胞的粘附与迁移。这些作用均可加重动脉粥样硬化的进展。研究表明,与正常血管组织相比,NPY及其受体在人和动物的动脉粥样硬化斑块中表达明显增高。大量证据表明运动可以改变心血管系统的交感神经兴奋性,而交感神经正是外周NPY的主要来源之一。此外,运动改变大脑和外周NPY表达的作用也得到了证实。因此,我们推测运动的抗动脉粥样硬化作用与改变外周NPY的表达有关。为验证上述假设,我们选用ApoE-/-小鼠,并喂食高脂肪食物建立动脉粥样硬化小鼠模型。同时,用不同的运动模式进行干预,以观察运动对NPY表达及动脉粥样硬化斑块的影响。同时采用体外细胞实验,探讨NPY影响巨噬细胞迁移的作用及机制,以进一步验证动物实验结果。目的1.观察运动抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的形成是否是通过改变NPY相关通路来实现的。2.探讨NPY对巨噬细胞迁移的作用及机制。方法1.运动对小鼠动脉粥样硬化的影响及其机制研究ApoE-/-小鼠被喂食高脂肪食物,并被随机分为高频次运动组、低频次运动组和不动组。在整个运动干预过程中,高频次运动组的小鼠每周运动5天,低频次运动组的小鼠每周运动1到2天,而不运动对照组的小鼠不进行运动干预。运动干预8周后,收集血清检测血脂及NPY的表达水平。收集的全主动脉,一部分使用油红O试剂检测整体斑块水平,另一部使用实时定量聚合酶连锁反应（real time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测动脉中NPY及其受体和相关炎症因子mRNA的表达水平。通过组织学和形态学分析测量主动脉根部斑块的形成及其稳定性。苏木素-伊红（hematoxylin eosin,HE）染色、油红O染色、Masson染色分别用于检测主动脉根部的斑块形成、脂质沉积及胶原蛋白的含量。同时,用免疫组化检测巨噬细胞、平滑肌细胞、NPY及Y1受体在斑块中的含量。2.NPY影响巨噬细胞迁移的作用机制研究体外培养Raw264.7巨噬细胞系,分别给予磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）和不同浓度的NPY进行干预,24h后通过qRT-PCR及蛋白质印记（western blot,WB）检测基质金属蛋白酶-8（matrix metalloproteinase-8,MMP-8）的表达水平。为了进一步探究NPY促进巨噬细胞合成MMP-8的机制,我们分别采用NPY受体拮抗剂及ERK1/2受体拮抗剂和NPY一起干预Raw264.7细胞。并用qRT-PCR检测MMP-8 mRNA的变化,WB检测MMP-8、P-ERK1/2和T-ERK1/2的表达。此外,细胞迁移实验用于检测NPY对巨噬细胞迁移的影响。结果1.运动可减缓动脉粥样硬化斑块的形成,增强斑块的稳定性运动可以抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的形成。同时,运动能够减少主动脉根部斑块中巨噬细胞及脂质的含量,增加平滑肌及胶原蛋白的含量,从而提高动脉粥样硬化斑块的稳定性。然而,在此次研究中我们发现高频次运动组与低频次运动组在缓解动脉粥样硬化斑块形成及提高斑块稳定性上并没有显着差异。此外,运动并没有改善高脂饮食条件下ApoE-/-小鼠的体重、血糖及血脂水平。2.运动抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块进展的作用与改变NPY相关通路有关血清ELISA实验证实规律运动组及偶然运动组明显减少血清NPY的含量。有趣的是,血中NPY的表达水平与斑块负荷有显着的相关性。qRT-PCR的结果也证实运动可以下调动脉血管中NPY及其受体mRNA的表达水平。此外,免疫组化的结果显示在两个运动组中NPY及Y1受体在斑块中的表达水平也出现明显的下调,特别是在巨噬细胞高表达区域。运动还可以减少动脉血管中炎症因子的表达水平。已有研究表明,NPY可以通过Y1受体调节巨噬细胞炎症因子的释放,再结合前述的结果,我们可以猜测运动能够通过减少巨噬细胞NPY及Y1受体的表达,从而抑制斑块中炎症因子的表达,抑制动脉粥样硬化的进展。3.NPY促进巨噬细胞迁移NPY能促进Raw264.7细胞MMP-8 mRNA和蛋白的表达,并有明显的剂量效应关系。这个作用可被Y1受体拮抗剂和ERK1/2抑制剂所抑制。NPY促进ERK1/2通路的激活,而这亦能被Y1受体拮抗剂所抑制。此外,NPY能促进Raw264.7细胞穿过I型胶原蛋白增加细胞迁移。同样的,Y1受体拮抗剂、ERK1/2抑制剂和金属蛋白酶组织抑制剂-1（tissue inhibitors of metalloproteinase-1,TIMP-1）能够减弱NPY的促迁移作用。结论1.运动可抑制动脉粥样硬化斑块形成,提高斑块稳定性。而在高脂饮食条件下,高频次运动与低频次运动在抗动脉粥样硬化作用上无显着差异。2.运动可通过抑制外周NPY及其受体的表达,下调斑块内巨噬细胞表面Y1受体的表达,抑制巨噬细胞的激活,从而减少斑块内炎症因子的表达,延缓斑块的形成与发展。3.NPY通过激活Y1受体,增加ERK1/2的磷酸化,促进Raw264.7细胞合成MMP-8,降解细胞外基质,从而促进Raw264.7细胞迁移。

吴昱青^[7]（2020）在《多巴胺在抑制金黄色葡萄球菌感染引起的巨噬细胞炎症反应中的作用研究》文中研究表明目的:DA（Dopamine,多巴胺）是一种重要的儿茶酚胺类神经递质,其缺失与帕金森氏病发生密切相关,此外,在调节机体免疫功能中DA也发挥着重要的作用。已有研究表明,帕金森氏病人易发院内菌如金黄色葡葡球菌感染,严重的帕金森氏病人甚至会出现脓毒症症状,然而,目前DA在调控免疫炎症反应中的具体作用机制尚不明确。本研究旨在探索DA在控制金黄色葡萄球菌感染引起的炎症反应中的作用及分子机制,为临床脓毒症、脑膜炎等感染性炎症疾病防治提供新的线索。方法:1)用模拟金黄色葡萄球菌病原分子的TLR2（Toll-like receptor 2,Toll样受体2）受体配体Pam3（Pam3CSK4,三酰脂肽）和金黄色葡萄球菌刺激小鼠BMDMs（Bone marrow derived-macrophages,骨髓来源的巨噬细胞）细胞,检测DA处理后炎症因子的表达情况。2)用RNA测序分析Pam3和DA刺激后BMDMs细胞内与炎症相关通路的变化,并通过Western blot验证相关通路变化。3)运用多巴胺受体敲除小鼠和多巴胺受体激动剂等确定DA发挥作用的主要受体。4)通过免疫共沉淀实验、点突变实验、蛋白质体外结合实验等确定多巴胺受体发挥抑制炎症作用的结构域,对鉴别出的结构域在BMDMs细胞上进行突变体恢复实验来验证结构域功能。5)通过体内脓毒症和脑膜炎小鼠模型检测相关多巴胺信号通路分子在感染性炎症反应中的作用。结果:1)DA处理后Pam3和金黄色葡萄球菌感染激活的炎症因子表达降低。2)RNA测序结果提示主要通过抑制NFkB（Nuclear transcription factor-kB,核转录因子kB）信号通路来抑制炎症反应。Western blot实验验证了这一结果。3)DRD5（Dopamine receptor 5,多巴胺受体5）敲除后,DA抑制炎症作用消失,表明DA通过其受体DRD5发挥抑制炎症作用。4)DRD5通过其结构基序EFD和IYX（X）I/L招募负调节蛋白ARRB2和PP2A进入TLR2信号中的TRAF6-IKK复合物中,负调节TRAF6介导的NFkB炎症反应。5)小鼠体内实验发现DA能够通过DRD5-ARRB2-PP2A轴减轻脓毒血症小鼠的炎症反应并提高其存活率,同时DRD5激动剂SKF38393也能通过该轴减弱脑膜炎引起的神经炎症。结论:DA激活DRD5后,通过DRD5受体EFD和IYX（X）I/L结构基序将负调节蛋白ARRB2/PP2A招募入TLR2信号中的TRAF6-IKK复合物中,进而控制NFkB炎症信号,抑制金黄色葡萄球菌引起的脓毒症和脑膜炎。因此,本研究结果提示DA-DRD5信号轴可作为今后相关炎症疾病的潜在干预靶标。

季娉婷^[8]（2020）在《小梁网-Schlemm’s管自主神经标记物表达的研究》文中提出背景:青光眼（Glaucoma）是一类以视神经萎缩和视野缺损为主要特征的严重不可逆性致盲眼病,眼内压（Intraocular Pressure,IOP）被认为是目前青光眼的主要可控危险因素。小梁网-Schlemm’s管（Schlemm’s canal,SC）是房水排出通道的主要阻力位点,也是影响眼压波动的关键部位。临床研究已证实,SC的开合状态与眼压的波动具有相关性:SC管径变大时,眼压降低;SC管径变小时,眼压升高,且SC的塌陷程度与眼压升高程度呈正相关。研究团队前期研究发现,自主神经可能通过调控SC的开合状态对眼压调控起到一定的作用,但SC是否具备自主神经调控的解剖基础,自主神经在控制SC调控眼压中的作用和机制尚不明确。目的:证实SC具备自主神经调控的解剖基础,探讨自主神经在控制SC调控眼压中的作用。方法:本实验拟通过以下途径探讨自主神经在调控SC中的作用:（1）检测小梁网-SC局部神经分布:通过遗体捐献眼,利用免疫组织化学方法检测小梁组织,利用血管标记物CD31定位SC,并用蛋白质基因产物9.5（PGP9.5）检测小梁网-SC局部神经分布特点;（2）明确小梁网-SC局部分布自主神经的种类:利用免疫荧光方法,双重标记PGP9.5与交感神经标记物酪氨酸羟化酶（TH）和多巴胺β-羟化酶（DβH）、副交感神经标记物血管活性肠肽（VIP）、感觉神经标记物降钙素基因相关肽（CGRP）和2型囊泡谷氨酸转运蛋白（VGlu T2）,明确自主神经的种类。（3）探讨自主神经在SC调控中的作用:建立慢性高眼压大鼠模型,检测高眼压动物模型小梁网-SC局部自主神经标记物表达;收集慢性闭角型青光眼患者的小梁及SC组织,检测自主神经标记物的表达与分布,并与正常组样本比较,以探讨自主神经在SC调控中的作用。结果:正常人Schlemm’s管具备自主神经调控的解剖基础。Schlemm’s管管周分布有副交感神经纤维以及交感神经纤维,但无感觉神经纤维分布;小梁网上有副交感神经纤维、交感神经纤维与感觉神经纤维分布。相较于正常组,慢性高眼压大鼠模型小梁网-SC局部组织多巴胺β-羟化酶表达显着升高,而酪氨酸羟化酶、血管活性肠肽、降钙素基因相关肽和2型囊泡谷氨酸转运蛋白表达无明显差异;慢性闭角型青光眼患者小梁网-SC局部组织多巴胺β-羟化酶、降钙素基因相关肽和2型囊泡谷氨酸转运蛋白表达显着升高。结论:SC具备自主神经调控的解剖基础,自主神经可能通过支配SC参与眼压的调控。本研究为“自主神经以Schlemm’s管作为靶器官起到一定的眼压调节作用”理论奠定了基础,为探讨外周自主神经对房水排出通道中SC的调节机制提供了参考。

栾晓^[9]（2019）在《Orexin-A对肥胖及肥胖抵抗大鼠LHA GS神经元放电、摄食及胃功能调控研究》文中认为目的:Orexins（胖素,Orexin-A和Orexin-B）是下丘脑分泌的神经肽,主要参与摄食和奖赏调控,尤其是Orexin-A在该调控过程中扮演重要角色。在下丘脑,表达Orexin的神经元主要分布于外侧区（Lateral Hypothalamus,LHA）和穹隆周区（Perifornical Area,PFA）。研究发现,啮齿类动物侧脑室、下丘脑室旁核（Paraventricular Nucleus,PVN）、LHA或PFA微量注射Orexin-A,均可促进大鼠摄食。虽然侧脑室注射Orexin-B也能产生与Orexin-A类似的促摄食效应,但核团内注射Orexin-B无促食效应。另有研究发现,Orexin-A或Orexin-B的促食效应依赖于Orexin-1受体（OX-1R）。但Orexins对肥胖或肥胖抵抗大鼠葡萄糖敏感（GS）神经元兴奋性、以及摄食和胃功能等调控研究较少。因此,本研究拟采用荧光免疫组化、分子生物学、电生理学等方法,观察和比较下丘脑LHA Orexin-A和OX-1R免疫阳性细胞及其mRNA在正常、肥胖及肥胖抵抗大鼠表达的异同,以及LHA Orexin-A对GS神经元兴奋性、摄食和胃功能的影响及潜在机制,并比较和分析Orexin-A在这三组大鼠中调控效应差异,目的是补充和完善Orexin-A对能量平衡调控理论,为临床肥胖治疗提供新的研究思路。方法:建立肥胖和肥胖抵抗大鼠模型:选取雄性健康SD大鼠（180-200g）,高脂饲料（每100 g含基础饲料80 g,蛋黄粉10 g,猪油10 g）饲喂2周,随之根据大鼠体质增量对大鼠进行排序,体质增量排序位于中间1/3的大鼠转喂基础饲料,其作为正常大鼠进行后续研究;体质增量排序位于上1/3（体质增量多）或下1/3（体质增量少）的大鼠继续以高脂饲料喂养6周,再次排序,体质增量位于上1/3为肥胖大鼠,体质增量位于下1/3为肥胖抵抗大鼠,弃去体质增量排序位于中间1/3的大鼠。采用荧光免疫组织化学染色和Real time-PCR方法,比较和分析正常、肥胖和肥胖抵抗大鼠LHA内Orexin-A和OX-1R免疫阳性细胞及其mRNA表达的异同。采用单细胞外放电记录,观察Orexin-A对正常、肥胖和肥胖抵抗大鼠GS神经元放电活动的影响,以及黑皮质素3和4受体（Melanocortin 3/4 Receptors,MC3/4R）信号通路的调控。采用LHA核团置管术和核团微量注射药物,观察Orexin-A对正常、肥胖和肥胖抵抗大鼠摄食、胃运动及胃排空的影响,以及OX-1R和MC3/4R信号通路的调控。将正常、肥胖以及肥胖抵抗大鼠均随机分为6组:（1）生理盐水（NS）组:LHA注射NS;（2）Orexin-A组:LHA内微量注射100 pmol Orexin-A;（3）SB-334837组:LHA微量注射1 nmol Orexin-1受体拮抗剂SB-334837;（4）SHU9119组:LHA微量注射0.1μg MC3/4R受体拮抗剂SHU9119;（5）Orexin-A+SB-334837组:LHA微量注射1 nmol SB-334837+100 pmol Orexin-A混合液;（6）Orexin-A+SHU9119组:LHA微量注射0.1μg SHU9119+100 pmol Orexin-A混合液。每组给药总体积为0.5μL,结果:荧光免疫组化结果显示,正常、肥胖及肥胖抵抗大鼠下丘脑LHA内Orexin-A免疫阳性细胞表达无显着差异（P>0.05）。但与正常大鼠相比,肥胖大鼠或肥胖抵抗大鼠LHA内OX-1R免疫阳性细胞表达显着增多（P<0.05-0.01）,且肥胖抵抗大鼠增加的更为显着（P<0.05）。PCR结果进一步证实,在正常、肥胖及肥胖抵抗大鼠,LHA内Orexin-A mRNA表达无显着改变（P>0.05）,但与正常大鼠相比,肥胖和肥胖抵抗大鼠LHA内OX-1R mRNA表达显着增加（P<0.05-0.01）,尤其是肥胖抵抗大鼠的增加最为显着（P<0.05）。电生理研究显示,在正常大鼠LHA微量注射Orexin-A,葡萄糖兴奋性（GS-EXC）神经元放电频率显着降低（由5.93±1.84 Hz降低至3.78±0.73 Hz;P<0.05）;而葡萄糖抑制性（GS-INH）神经元放电频率则显着升高（由5.47±1.64 Hz升高至7.62±1.84 Hz;P<0.05）;若预先LHA微量注射SB-334867再给予Orexin-A,Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应可被完全阻断;若预先LHA微量注射SHU9119再给予Orexin-A,可使Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应进一步增强（P<0.05）。在肥胖大鼠,LHA微量注射Orexin-A,GS-EXC神经元的放电频率由6.12±1.68 Hz降低至3.24±0.97 Hz（P<0.05）;而GS-INH神经元放电频率由5.26±1.82 Hz升高至8.19±2.37 Hz（P<0.05）;若预先LHA注射SB-334867再给予Orexin-A,Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应可被完全阻断,但若预先LHA注射SHU9119再给予Orexin-A,Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应进一步增强（P<0.05）。在肥胖抵抗大鼠,LHA微量注射Orexin-A,GS-EXC神经元放电频率显着降低（由5.86±1.94 Hz降低至3.07±0.84 Hz;P<0.05）,而GS-INH神经元放电频率显着增加（由5.39±1.48 Hz升高至8.19±2.42 Hz;P<0.05）;若预先LHA注射SB-334867再给予Orexin-A,Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应同样可被完全阻断;而LHA预先注射SHU9119再给予Orexin-A,同样,Orexin-A对GS神经元的兴奋或抑制效应进一步增强（P<0.05）。与正常大鼠相比,Orexin-A对肥胖或肥胖抵抗大鼠GS神经元的兴奋或抑制效应显着增强（P<0.05）,SHU9119对Orexin-A诱导的GS神经元兴奋性改变更为显着（P<0.05）,即黑皮质素3/4受体信号通路对Orexin-A该效应的调控更为敏感。但这些调控效应在肥胖大鼠和肥胖抵抗大鼠之间无明显差异（P>0.05）。摄食量研究结果显示,LHA微量注射Orexin-A,正常、肥胖和肥胖抵抗大鼠0-2h摄食量均显着增加（P<0.05）,且肥胖和肥胖抵抗大鼠摄食量增加的幅度显着高于正常大鼠（P<0.05）,尤以肥胖抵抗大鼠摄食量增加最为显着（P<0.05）。预先LHA注射SB-334867,可完全阻断Orexin-A促大鼠摄食效应（P>0.05）;若LHA注射SHU9119+Orexin-A混合液,可显着增强Orexin-A促摄食效应（P<0.05）。在体胃运动研究结果显示,大鼠下丘脑LHA微量注射Orexin-A,5 min后胃收缩频率及幅度显着增加（P<0.05）,且该效应可被LHA注射SB-334867完全阻断;与Orexin-A组相比,LHA微量注射Orexin-A+SHU9119混合液,大鼠胃收缩频率及幅度显着升高（P<0.05）。提示,黑皮质素3/4受体信号通路参与Orexin-A促大鼠胃收缩频率及幅度的调控（P<0.05）。胃运动指数（MI）分析结果显示,在正常、肥胖及肥胖抵抗大鼠之间MI无明显差异（P>0.05）;但LHA微量注射Orexin-A,三组大鼠MI均显着升高（P<0.05）,其中肥胖及肥胖抵抗大鼠升高幅度显着高于正常大鼠（P<0.05）,且肥胖抵抗大鼠升高幅度高于肥胖大鼠（P<0.05）。Orexin-A对大鼠MI的促进作用可被LHA注射SB-334867完全阻断（P<0.05）,而LHA注射SHU9119能增强Orexin-A对大鼠MI的促进作用（P<0.05）。胃排空研究结果显示,下丘脑LHA微量注射Orexin-A,三组大鼠胃排空显着增加（P<0.05）,Orexin-A对胃排空的促进作用强弱依次为肥胖抵抗大鼠>肥胖大鼠>正常大鼠（P<0.05）。LHA注射SB-334867,可完全阻断Orexin-A对胃排空的促进作用;若LHA注射SHU9119,可增强Orexin-A促大鼠胃排空效应（P<0.05）。结论:Orexin-A在下丘脑LHA参与正常、肥胖和肥胖抵抗大鼠GS神经元兴奋性、胃动力、胃排空以及摄食活动调控,该效应可能是通过OX-1R信号通路而实现的;MC3/4R受体信号通路可能也参与了该过程的调控;Orexin-A上述调控效应在肥胖和肥胖抵抗大鼠更为显着,其可能与肥胖和肥胖抵抗大鼠LHA中OX-1R表达增加有关。

唐亚杰^[10]（2019）在《下丘脑室旁核对病原系统性炎症的响应和调控功能的研究》文中进行了进一步梳理内毒素脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的活性成分,当注射到动物体内时,会诱导机体产生大量的细胞因子,从而引发全身系统性炎症和一系列特定的病理生理和行为改变。但是这些改变在宿主防御中的作用很大程度上是未知的。免疫系统与神经内分泌系统之间的相互作用是生物体克服炎症或感染等疾病状态的必要条件。下丘脑室旁核（PVN）是一个重要的核团,它通过整合神经内分泌、自主神经和行为反应,对体内平衡的变化（如感染）做出反应。下丘脑室旁核借助神经脉冲获得大量信息,当机体出现异常时,就会释放各种化学物质到垂体,从而调节机体内稳态的平衡。本研究旨在利用神经生物学技术手段,特异性操控下丘脑室旁核,通过分析细胞因子、神经递质、神经肽、激素等来初步探索下丘脑室旁核在神经内分泌免疫系统中发挥的作用;同时,通过分析动物在系统性炎症模型中的行为,对下丘脑室旁核在宿主防御过程中的作用进行初步探索。以上研究为进一步探索在受到外来病原入侵时,神经系统是如何对机体进行调控的提供了新的理论基础。本课题的研究内容主要分为以下几个方面:1.LPS引起的系统性炎症对小鼠内稳态及行为的影响腹腔注射LPS能导致小鼠中枢、外周细胞因子的升高和下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）的激活,引起免疫激活。其中下丘脑与垂体组成的完整的神经内分泌功能系统,也会被LPS影响。为了探索LPS引起的全身系统性炎症对小鼠内稳态和行为的影响,我们对垂体前叶细胞进行了基因表达谱的分析和动物行为的测定。分析结果显示,LPS注射1 h后引起特异激素、神经肽及其相应的信号通路的改变,并产生大量的细胞因子,导致机体的稳态失衡;同时,LPS注射24 h内,小鼠出现饮食、饮水的下降、运动能力的下降、耗氧量的降低、体温的下降等一系列的疾病行为特征。2.下丘脑室旁核在LPS引起的系统性炎症下对小鼠内稳态的调控免疫荧光染色和光纤钙信号检测技术的结果显示,在LPS刺激引起的系统性炎症下,PVN对该刺激产生了明显的神经响应。为了研究在该刺激下,下丘脑室旁核是如何影响并调控机体内稳态的,我们利用化学遗传学的技术手段抑制PVN内神经元的放电活动,以抑制神经递质的释放,从而达到抑制神经元活动的效果。通过分析,我们确定了一些重要的激素、受体、神经肽及一些重要的信号通路,它们对于下丘脑室旁核在炎症下对机体进行调控是至关重要的。3.下丘脑室旁核在LPS引起的系统性炎症下对小鼠行为的影响中枢神经系统的一项重要功能是根据变化来调控动物的行为。前期结果显示LPS注射后,会引起体重的降低和体温的下降。为了理解这种神经系统调节背后的机制,我们利用病毒示踪技术对下丘脑室旁核进行了全脑输入网络的示踪。通过分析发现,下丘脑室旁核与大脑内其他核团之间存在广泛的联系,包括控制动物摄食的“饥饿中枢”—下丘脑外侧核和体温调节中枢—下丘脑视前区。接着利用化学遗传学的技术手段对其进行操控,结果显示,在应对外来病原刺激的情况下,下丘脑室旁核会通过一系列的调控手段使小鼠的体温和体重得以快速的恢复。因此得出,下丘脑室旁核在病原菌刺激反应中起着尤为重要的作用。4.激活下丘脑室旁核可以缓解疾病行为利用化学遗传学技术手段对下丘脑室旁核激活的实验结果显示,当PVN被激活后,因LPS刺激机体导致的体重降低和体温下降的恢复时间明显缩短,这表明下丘脑室旁核被激活后,可以通过释放激素、细胞因子等对疾病行为的恢复起重要作用。本研究利用病毒示踪技术对下丘脑室旁核的全脑输入网络的示踪有助于更好的理解它在参与整合感知信息、传递并调节内分泌活动、生理功能等方面的作用。通过利用化学遗传学技术对下丘脑室旁核进行功能操控,揭示出其在对抗LPS刺激中的重要调节作用,补充人们对下丘脑室旁核在对抗疾病中的功能认识。

二、交感神经系统中的神经肽（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、交感神经系统中的神经肽（论文提纲范文）

（1）PACAP/PAC1受体介导电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症的作用机制研究（论文提纲范文）

（2）神经肽Y在骨折愈合中的作用及成骨机制研究（论文提纲范文）

（3）基于肿瘤神经新生学说探讨p75NTR介导的电针围刺的抑瘤机制（论文提纲范文）

（4）神经相关因子在结直肠癌患者中的表达及迷走神经对免疫微环境的影响（论文提纲范文）

（5）内源性孤啡肽通过调节交感神经活性与去甲肾上腺素转运蛋白影响大鼠缺血性心律失常（论文提纲范文）

（6）运动调控外周NPY表达对动脉粥样硬化影响的机制研究（论文提纲范文）

（7）多巴胺在抑制金黄色葡萄球菌感染引起的巨噬细胞炎症反应中的作用研究（论文提纲范文）

（8）小梁网-Schlemm’s管自主神经标记物表达的研究（论文提纲范文）

（9）Orexin-A对肥胖及肥胖抵抗大鼠LHA GS神经元放电、摄食及胃功能调控研究（论文提纲范文）

（10）下丘脑室旁核对病原系统性炎症的响应和调控功能的研究（论文提纲范文）

四、交感神经系统中的神经肽（论文参考文献）

• [1]PACAP/PAC1受体介导电针改善顺铂致小鼠白细胞减少症的作用机制研究[D]. 黄锦. 天津中医药大学, 2021(01)
• [2]神经肽Y在骨折愈合中的作用及成骨机制研究[D]. 张波. 山东大学, 2021(11)
• [3]基于肿瘤神经新生学说探讨p75NTR介导的电针围刺的抑瘤机制[D]. 田叶红. 北京中医药大学, 2021(01)
• [4]神经相关因子在结直肠癌患者中的表达及迷走神经对免疫微环境的影响[D]. 周辉. 河北医科大学, 2021(02)
• [5]内源性孤啡肽通过调节交感神经活性与去甲肾上腺素转运蛋白影响大鼠缺血性心律失常[D]. 李占峰. 山西医科大学, 2020(12)
• [6]运动调控外周NPY表达对动脉粥样硬化影响的机制研究[D]. 吴伟强. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
• [7]多巴胺在抑制金黄色葡萄球菌感染引起的巨噬细胞炎症反应中的作用研究[D]. 吴昱青. 南京医科大学, 2020(06)
• [8]小梁网-Schlemm’s管自主神经标记物表达的研究[D]. 季娉婷. 华中科技大学, 2020(01)
• [9]Orexin-A对肥胖及肥胖抵抗大鼠LHA GS神经元放电、摄食及胃功能调控研究[D]. 栾晓. 青岛大学, 2019(07)
• [10]下丘脑室旁核对病原系统性炎症的响应和调控功能的研究[D]. 唐亚杰. 华中农业大学, 2019(01)

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