一、侵袭性类风湿关节炎的治疗策略（论文文献综述）
李兆东[1]（2021）在《万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析》文中进行了进一步梳理类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性自身免疫性疾病,具有致残率高,治疗周期长,预后差和易复发等特点,常给患者家属和社会带来沉重负担。成纤维样滑膜细胞（rheumatoid arthritis-fibroblast-like synoviocytes,RAFLSs）是关节滑膜组织的重要组成细胞,其过度增殖可促进免疫细胞释放大量促炎因子,从而引发炎症反应,加剧RA病理进程。此外,关节腔内募集的促炎因子也会进一步激活RA-FLSs细胞。因此,抑制RA-FLSs细胞增殖或降低关节内促炎因子水平是治疗RA的一种有效手段。当前,药物治疗仍是RA的主要治疗方式,但由于化学合成药物的治疗不仅费用昂贵,且常伴有副作用,因此人们正积极寻找安全、有效和廉价的药物来治疗RA。近年来,中药以其具有的显着疗效和较少的副作用,在治疗RA方面已受到越来越多的关注。此外,中药可通过多成分、多途径、多靶点的方式参与RA的治疗过程。万通筋骨片是由25味中药组成的复方药,具有“祛风散寒、通络止痛”的功效,主要用于风湿和类风湿性关节炎等骨性疾病。由于其作用机理不明确,从而限制了它在国内外的推广和使用。因此,系统研究万通筋骨片在治疗RA中的作用和机制十分必要。首先,基于胶原诱导性关节炎（collagen-induced rheumatoid arthritis,CIA）大鼠模型,我们研究万通筋骨片对RA的抗炎作用;其次,基于RA-FLSs细胞的生物学活性,我们研究万通筋骨片对RA的抗炎机制;随后,在万通筋骨片抗炎作用的基础上,我们利用高通量测序技术继续挖掘万通筋骨片的抗炎基因靶点;最后,我们利用16S rDNA高通量测序和代谢组学分析研究万通筋骨片对肠道菌群和血清代谢物谱的影响,拟挖掘参与万通筋骨片抗炎作用的靶点微生物群和靶点代谢物。因此,本研究不仅为万通筋骨片在临床上治疗RA提供了实验依据,促进了其推广和应用,而且也为中药治疗RA的机制研究建立了新的思路。第一部分万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎作用首先,为了确定万通筋骨片的安全给药浓度,我们进行了急性毒性实验,血常规检测和肝脾肾功能分析。其次,为了评估CIA大鼠模型的构建效果,我们检测了大鼠的足趾肿胀度,关节内TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子水平,关节的病理结构变化,以及滑膜组织中FLSs特异性标志蛋白（Vimentin）的表达水平。最后,为了研究万通筋骨片对RA的抗炎作用,我们连续灌胃给药14天和28天后,检测了CIA大鼠足趾肿胀度,炎性关节病理结构变化,以及关节腔和关节组织中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子水平。结果显示:万通筋骨片给药的安全有效浓度可设为150、300和600 mg/kg;CIA大鼠成模率>99.00%。当连续治疗14天时,各组CIA大鼠足趾肿胀度没有明显变化;当连续治疗28天时,300和600 mg/kg组的CIA大鼠足趾肿胀度明显降低。组织病理切片显示,连续给药14天和28天时,各组CIA大鼠的关节病理结构发生不同程度的改善,尤以600 mg/kg连续给药28天的治疗组CIA大鼠,病理结构改善效果最佳。关节腔内促炎因子的水平变化结果显示,在连续给药14天和28天时,各给药浓度均表现出不同程度的抗炎作用,尤以600 mg/kg连续给药28天的抗炎效果最佳。关节组织中促炎因子的水平变化结果显示,连续给药14天时,TNF-α和IL-1β促炎因子水平显着降低;连续给药28天时,TNF-α,IL-1β和IL-6促炎因子水平明显下调。这些结果说明,万通筋骨片对RA具有抗炎作用,且呈现一定的时间依赖性和浓度依赖性。第二部分万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎机制基于万通筋骨片的抗炎作用,本研究在细胞水平和动物水平继续研究万通筋骨片的抗炎机制。首先,为了确定万通筋骨片对RA-FLSs细胞增殖的影响,我们观察了RA-FLSs细胞形态变化,并应用乳酸脱氢酶活性测定,Ed U核酸标记以及免疫组化等实验技术检测RA-FLSs细胞数目变化和滑膜组织中Vimentin蛋白表达情况。其次,我们利用蛋白免疫印迹,免疫荧光和免疫组化等技术检测了MEK、p MEK、ERK1/2和p ERK1/2蛋白在RA-FLSs细胞及CIA大鼠滑膜组织中的表达水平。同时,我们还利用ERK1/2质粒转染等相关实验,进一步验证MEK/ERK信号通路在万通筋骨片抗炎过程的作用。最后,为了研究万通筋骨片是否通过诱导滑膜细胞凋亡的方式参与抗炎作用,我们检测了RA-FLSs细胞中caspase-3/9蛋白酶活性,cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的蛋白表达水平,以及CIA大鼠滑膜组织中Bax,Bcl-2,caspase-3和cleaved-caspase-3蛋白表达水平。结果显示:药物处理24 h和48 h后,各组RA-FLSs细胞形态均发生改变,尤以3 mg/ml和4 mg/ml药物浓度处理48 h,细胞形态变化较为明显。药物处理24 h后,各组RA-FLSs细胞数目无明显变化;药物处理48 h后,2 mg/ml、3mg/ml、4 mg/ml给药浓度可以显着抑制RA-FLSs细胞增殖。经药物处理24 h和48 h后,MEK,p MEK,ERK1/2和p ERK1/2蛋白在RA-FLSs细胞中均呈现不同程度的降低趋势,尤以3 mg/ml和4 mg/ml药物浓度处理48 h,各蛋白表达差异最为明显。同时,过表达ERK1/2显着提升RA-FLSs细胞的增殖能力,而过表达ERK1/2的RA-FLSs细胞经3 mg/ml药物浓度处理后,细胞增值能力显着下降。同时,万通筋骨片可以下调MEK,p MEK,ERK1/2和p ERK1/2蛋白在滑膜组织中的表达。此外,药物处理24 h后,4 mg/ml药物浓度显着提高RA-FLSs细胞中caspase-3/9蛋白酶活性;药物处理48 h后,3 mg/ml和4 mg/ml明显上调caspase-3/9蛋白酶活性。我们还发现,药物处理24 h和48 h后,3 mg/ml和4mg/ml药物浓度显着上调cleaved-caspase-3蛋白表达,2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml药物浓度显着上调cleaved-PARP蛋白表达。同时,万通筋骨片可以上调滑膜组织中Bax和cleaved-caspase-3蛋白表达以及下调Bcl-2和caspase-3蛋白表达。这些结果表明,万通筋骨片通过抑制RA-FLSs细胞增殖及诱导RA-FLSs细胞凋亡参与抗炎过程。第三部分基于RNA高通量测序挖掘万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎靶点基于万通筋骨片对RA-FLSs细胞的影响,本研究针对药物处理后的RA-FLSs细胞进行RNA高通量测序分析。为了更加全面、准确的获得抗炎靶点,我们采用两种不同的分析方法进行筛选,即DESeq2差异分析以及STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析。DESeq2差异分析:通过DESeq2差异分析,拟筛选不同组别间的差异基因;针对这些差异基因,我们随后进行功能富集过滤和蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）网络分析,并根据PPI网络中节点连接度筛选备用核心基因。STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析:基于药物处理组和未处理组之间的差异基因,我们拟筛选与时间序列具有相同表达趋势的基因。针对这些基因,我们进一步筛选具有相同表达模式的差异基因。随后通过功能富集过滤,权重共表达网络分析,PPI网络分析,以及节点连接度来筛选备用核心基因。最后,我们利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹验证备用核心基因的表达模式,以便获得理想的抗炎靶点。结果显示:通过DESeq2差异分析,在不同比较组间,我们共获得184个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,且这些基因与细胞周期和同源重组等代谢通路密切相关。同时,基于PPI蛋白网络,我们共筛选出4个备选核心基因,即BRCA1,ATR,SMC3和BUB1。通过STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析,我们共获得111个具有相同表达趋势和表达模式的DEGs,且这些基因显着富集于细胞周期和RNA转运等代谢通路。同时,基于WGCNA和PPI网络,我们共筛选出6个备选核心基因,即PNN,SMC3,EIF3A,BUB1,ATR和ORC4。此外,TTK,STAG2和THOC1也与细胞周期密切相关,因此TTK,STAG2和THOC1也作为备选核心基因。至此,共获得10个备选核心基因,即:BRCA1、ORC4、TTK、BUB1、SMC3、ATR、PNN、EIF3A、STAG2和THOC1。基因和蛋白验证结果显示,只有SMC3和BUB1的表达模式与测序结果一致。这些结果表明,SMC3和BUB1可能是万通筋骨片在RA中的抗炎靶点。第四部分基于16S高通量测序和代谢组学联合分析挖掘万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎靶点基于万通筋骨片对CIA大鼠的抗炎作用,本研究针对CIA大鼠粪便样本和血清样本,分别进行16S高通量测序分析和代谢组学分析,拟挖掘万通筋骨片抗炎作用的肠道菌群靶点和代谢物靶点。16S高通量测序分析:基于操作单元聚类和物种多样性分析,我们拟研究万通筋骨片对肠道菌群结构的影响;基于肠道菌群差异分析,我们拟筛选相对丰度较高的差异菌群。代谢组学分析:基于样本相关性和多元统计分析,我们拟研究万通筋骨片对血清代谢物谱的影响;基于差异代谢物筛选,功能富集过滤和差异代谢物表达分析,我们拟筛选理想的差异代谢物。16S高通量测序与代谢组学联合分析:基于top10差异肠道菌属和top20差异代谢物,我们进行联合分析,拟研究肠道微生物群与血清代谢物的关系,并验证或筛选肠道菌群靶点和代谢物靶点。结果显示:通过16S高通量测序分析,我们发现万通筋骨片可以明显改变CIA大鼠的肠道菌群结构。在门水平上,拟杆菌、软壁菌和脱铁杆菌的菌群相对丰度得到显着改善。此外,拟杆菌与厚壁菌的菌群相对丰度比值（Bacteroidetes/Firmicutes）也恢复到正常水平。在属水平上,弧菌、巨型球菌和漫游球菌的菌群相对丰度下调至正常水平。通过代谢组学分析,我们发现万通筋骨片可以明显改变CIA大鼠的血清代谢物谱。其中,血清素、二硫化谷胱甘肽、N-乙酰神经氨酸、萘和血栓素B2等5种代谢物均有标准化的趋势,但不具有统计学差异。通过16S高通量测序与代谢组学联合分析,我们发现,弧菌、巨型球菌和漫游球菌都存在于top10差异肠道菌群范围内,且与这3种微生物群存在显着联系的代谢物包括5种。此外,考虑到代谢物鉴定过程中的假阳性,我们认为:在这5种代谢物中,只有微管素B是内源性代谢物。这些结果表明,万通筋骨片可能通过调节肠道菌群结构和血清代谢物谱发挥抗炎作用,且弧菌、巨型球菌和漫游球菌可能是万通筋骨片的抗炎靶点菌群;微管素B可能是万通筋骨片的抗炎靶点代谢物。
武泽文[2]（2021）在《FAPα对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞功能影响的研究》文中研究表明背景:类风湿关节炎（RA）是一种以滑膜成纤维细胞（Fibroblast-like synoviocytes,FLSs）的增殖、免疫细胞的浸润和血管翳的生成为主要病理表现的慢性系统性自身免疫性疾病。疾病进展会造成关节的滑膜组织损伤,最终致畸致残。但是到目前为止,RA的发病机制仍未完全诠释清楚。FLSs作为滑膜炎症中的重要参与者在疾病发生发展中的作用越来越受到人们的关注。成纤维细胞活化蛋白α（FAPα）主要表达于活化的成纤维细胞表面,研究表明FAPα于肿瘤、肺纤维化等多种疾病中表达升高,并与肿瘤细胞侵袭性相关。那么在RA-FLSs中FAPα扮演怎样的角色,有待进一步研究与讨论。目的:（1）通过对公共测序数据分析筛选RA患者与健康对照（health control,HC）滑膜组织中与FAPα表达相关的差异基因,预测FAPα可能通过哪些通路影响RA疾病的进程。（2）通过体外细胞实验探讨FAPα对RA-FLSs增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭能力的影响,以及FAPα对细胞功能的影响是否与SHH信号通路相关,揭示FAPα在RA-FLSs中可能的生物学功能,为将来靶向FAPα+FLSs治疗RA的临床转化提供实验基础。方法:1.生物信息学分析:（1）RA和HC滑膜组织和平台信息数据下载于NCBI GEO数据库。对原始数据进行标准化处理后,使用R语言中“limma”软件包对RA与HC组中的差异基因进行筛选,设定阈值为|log FC|>1且P<0.05;根据基因测序数据中FAPα表达情况将数据分为高低表达两组,筛选差异基因,设定阈值为|log FC|>1且P<0.05。取两组差异基因交集作为下一步分析的关键基因。R语言中“ggplot2”软件包用于绘制RA与HC的火山图和聚类热图。（2）利用Bioconductor中的R package cluster Profiler（10）对关键基因进行GO分析和KEGG分析,P<0.05有统计学意义。（3）利用STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络,分析关键蛋白之间可能存在蛋白相互作用,找到FAPα可能的致病相关基因。2.FLSs的获取和鉴定:（1）RA-FLSs和骨关节炎（osteoarthritis,OA）的FLSs均在无菌条件中从关节置换术患者的滑膜组织分离获得,将组织剪碎并用胰蛋白酶消化处理,于含DMEM完全培养基中进行培养。FLSs为贴壁细胞,生长较为缓慢,平均3-4天后贴壁到达80%以上,进行传代培养。本课题所用的细胞均为3-6代细胞。（2）细胞鉴定主要从通过观察细胞形态以及使用FLSs的表面标志物（阳性）FAPα、PDPN和CDH11,以及巨噬细胞表面标志（阴性）CD68进行细胞鉴定。3.si RNA转染实验:设计合成FAPα的小干扰（small interfering RNA,si RNA）,通过使用GP-transfect-Mate将si RNA转染至RA-FLSs中。设置空白对照（Blank组）、阴性对照（NC组）和FAPα干扰组（si RNA组）。使用Real-time PCR和Western blot法分别从m RNA和蛋白水平检测FAPα的抑制情况,筛选干扰率最高的si RNA进行后续实验。4.细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭能力的检测方法:（1）CCK8法检测实验组与对照组细胞增殖活性情况,利用流式细胞术对细胞的周期和凋亡进行检测,利用Transwell法比较各组FLSs细胞的迁移和侵袭能力改变;（2）Western blot法检测SHH信号通路SHH、PTCH1、GLI1蛋白的表达情况。结果:1.FAPα在RA滑膜中生物学作用的生物信息学分析:通过对RA和HC滑膜组织基因数据的分析,鉴定出与FAPα表达相关的关键基因,通过GO分析与KEGG分析进一步发现这些关键基因主要富集在类风湿关节炎,白细胞迁移、细胞与细胞间连接、细胞外基质胶原相关、受体配体和细胞因子活性、蛋白偶联受体结合、细胞因子受体结合、趋化因子和金属肽酶活性、CCR和CXCR趋化因子受体结合、纤维连接蛋白结合等几条重要信号通路。通过蛋白-蛋白相互作用网络筛选出FAPα表达相关的核心基因MMP1、MMP3、MMP13、CXCL9和CXCL13,经过Real-time PCR对RA-FLSs样本的验证发现MMP3、MMP13表达与FAPα表达差异相关。2.FAPα对FLSs细胞功能的影响:（1）对细胞增殖和周期的影响:细胞增殖检测表明,与NC组比较,转染24h和48h后si RNA组细胞生长率均受到了抑制,差异有统计学意义（P<0.05）。细胞周期检测表明与NC组相比,si RNA组中G0/G1期和S期所占的比例并没有明显的变化,但是G2/M期FLSs所占的比例降低（P<0.05）;（2）对细胞凋亡的影响:细胞凋亡检测表明,转染后48h si RNA组与NC组的细胞凋亡情况并没有显着性变化,差异无统计学意义（P>0.05）;（3）对细胞迁移和侵袭能力的影响:细胞迁移能力实验表明:与NC组比较,转染后24h si RNA组迁移能力无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）,侵袭实验表明转染后24h si RNA组侵袭能力明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;（4）对RA-FLSs中SHH信号通路的影响:Western blot法结果表明,与NC组相比,si RNA组中SHH和GLI1相对表达量均降低（P<0.05）,但PTCH1表达无明显差异（P>0.05）。结论:1.基因测序数据分析结果表明FAPα可以通过影响细胞因子受体结合、趋化因子活性、金属肽酶活性等细胞功能和信号通路影响RA滑膜病理学改变,并且与MMP3、MMP13等核心基因相关;2.FAPα的表达可以促进RA-FLSs的增殖和侵袭能力,但对细胞凋亡、迁移能力无明显作用;3.FAPα对RA-FLSs的增殖和侵袭能力的影响可以与其激活SHH信号通路相关。
谭卫星[3]（2021）在《外泌体Dvl3 mRNA调节Wnt通路对关节滑膜增殖、炎症的作用及其机制》文中提出一、背景类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种以对称性、侵蚀性和破坏性关节炎为特点的慢性全身性自身免疫性疾病,其中RA患者关节成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-1ike synoviocyte,FLS）的生物学特征改变及功能异常被认为与RA的发病密切相关。人们对导致RA-FLS“肿瘤样增殖”表型的分子机制目前仍知之甚少,猜测可能是细胞暴露于体内类风湿炎症环境中以某种方式的被动应答,而这一炎症环境中的效应分子包括最新研究发现的一些新的生物标志物如:外泌体,后者被认为同样具有潜在的临床诊断和治疗作用。我们既往研究显示在Wnt经典及非经典两条信号通路中扮演着交叉点角色的Dvl的一个亚型即Dvl3分子在RA血清外泌体中显着升高。推测Dvl3这一分子在RA中可能具有诱人的研究前景,因此本研究旨在探寻Dvl3在RA中的表达模式以及通过外泌体这一方式研究Dvl3 mRNA在RA中的功能及作用机制,为将来能够更深入了解RA的发病机制及发现新的可能的治疗靶点奠下基础。二、研究目的第一部分:明确Dvl3在RA患者滑膜组织和细胞以及胶原诱导关节炎小鼠模型（CIA）滑膜组织中的表达情况。第二部分:明确外泌体Dvl3 mRNA在体外对成纤维样滑膜细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及炎性反应的作用。第三部分:明确外泌体Dvl3 mRNA在体内对CIA模型疾病程度、疼痛、滑膜破坏和凋亡、软骨和骨破坏以及血清炎性因子水平的影响。第四部分:探讨Dvl3 mRNA发挥上述作用的可能下游机制。三、研究方法第一部分:（1）分别收集了6例RA和创伤（Trauma）患者的膝关节滑膜组织,经固定、包埋、切片机组织HE染色对两组滑膜组织病理进行比较;（2）分别通过免疫组化（IHC）、蛋白印迹（WB）及实时定量PCR（q PCR）比较Dvl3在两组患者滑膜组织中的表达水平;（3）从滑膜组织中原代提取成纤维样滑膜细胞,比较Dvl3的表达水平;（4）通过构建胶原诱导关节炎（CIA）小鼠模型,比较Dvl3在疾病模型小鼠及正常小鼠膝关节中的表达水平。第二部分:（1）构建Dvl3 mRNA过表达及干扰慢病毒,鉴定摸索慢病毒感染RA-FLS条件,获得能够稳定上调或下调Dvl3 mRNA的RA-FLS;（2）进一步摸索条件通过对细胞培养上清超速离心获得能够稳定介导目标RA-FLS中Dvl3 mRNA水平改变的外泌体,并通过q PCR及WB进行验证转染效果。（3）采用Tunel及流式检测法测定不同来源外泌体转染RA-FLS后对细胞凋亡的影响;CKK8测定RA-FLS细胞活性;（4）经划痕和Transwell迁移实验比较细胞迁移能力;（5）利用Transwell侵袭实验及基质金属蛋白酶（MMPs）表达水平检测反映细胞侵袭能力;（6）提取目的细胞RNA及上清分别使用q PCR及酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各细胞因子的mRNA及蛋白水平。第三部分:（1）外泌体获取同第二部分,构建CIA小鼠模型,对小鼠关节腔注射外泌体,每周一次;（2）第二次免疫次日起对小鼠疾病评分;（3）对小鼠足爪机械痛觉进行一次评分;（4）颈椎脱臼法处死小鼠获取小鼠膝关节,分别行HE染色、番红O-固绿染色及Tunel染色对小鼠膝关节病理、软骨破坏及滑膜细胞凋亡情况进行评价;（5）门静脉取血并采用ELISA法检测各细胞因子表达水平。第四部分:（1）提取不同来源外泌体处理后的RA-FLS中的RNA,q PCR检测Wnt信号通路的关键信号分子筛选Dvl3的可能下游通路;（2）进行WB验证;（3）构建Dvl3 mRNA过表达和干扰质粒并进行转染验证,上述质粒同双荧光素酶报告基因质粒进行共转染实验,验证Dvl3对TCf以及ROCK2启动子的活性。四、结果第一部分:（1）成功提取了RA和创伤患者关节滑膜的原代FLS进行培养、鉴定及传代。（2）RA组滑膜在滑膜增生、炎性细胞浸润及毛细血管增生等方面的评分明显更高。（3）Dvl3在RA患者滑膜中的表达水平明显升高。（4）Dvl3在RA-FLS中的表达同样明显高于对照创伤组。（5）Dvl3在炎性关节炎中的表达被显着上调。第二部分:（1）CKK8结果显示来自过表达外泌体组的外泌体能够显着促进细胞增殖活性,而干扰外泌体组外泌体可以起到抑制FLS增殖的作用。（2）凋亡结果显示过表达外泌体组较对照组显着下调了RA-FLS的凋亡水平。（3）迁移及侵袭实验提示了过表达Dvl3外泌体对细胞迁移及侵袭的促进作用,同时伴有上调基质金属蛋白酶表达水平的作用,在干扰外泌体组中则观察到几乎相反的作用。（4）q PCR及ELISA法检测细胞因子含量水平提示Dvl3 mRNA过表达外泌体能够显着促进TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-21的表达,干扰外泌体组则可以观察到IL-17和IL-21的显着下调。第三部分:（1）成功构建了CIA小鼠模型,小鼠疾病评分结果显示过表达外泌体注射组小鼠关节炎指数较对照组升高更快。（2）机械痛阈值测定结果显示干扰外泌体组小鼠疼痛阈值下降程度较对照组明显减缓。（3）WB及q PCR验证了外泌体注射干预效果。（4）HE染色提示过表达外泌体组病理评分明显高于对照组;而Sh-Dvl3 mRNA干扰外泌体注射组则有效缓解了小鼠的关节炎症。（5）番红O-固绿染色结果显示过表达外泌体组评分明显高于对照组,而干扰实验组则倾向表现出对关节软骨的保护性作用。（6）Tunel实验提示Sh-Dvl3 mRNA外泌体注射组表现出强烈的促凋亡结果。（7）ELISA结果显示Dvl3在膝关节的表达水平升高可以显着上调血清中TNF-α、IL-17及IL-21的水平。第四部分:（1）q PCR结果显示Dvl3 mRNA的过表达同样伴随着β-catenin及Rho A下游分子ROCK2的明显升高,而在Dvl3 mRNA干扰外泌体组则观察到β-catenin及Ro CK2较对照组的显着下降。以上结果经WB得到进一步验证。（2）双荧光素酶报告基因检测系统来明确Dvl3在Wnt通路两条通路中的作用,结果提示了Dvl3可以同时激活经典及非经典Wnt信号通路。五、结论本课题通过临床及动物组织样本表达、原代细胞培养体外实验研究、构建动物模型体内实验研究以及具体分子机制四个部分对Dvl3的表达以及外泌体Dvl3mRNA的功能进行了较为详尽的研究,发现了Dvl3在RA患者及炎性关节炎动物模型中的高表达,以及其在细胞水平可能具有促进细胞增殖抑制凋亡,促进迁移、侵袭及促炎性细胞因子的分泌等作用进而参与介导了关节炎的进展和加重,进一步的机制研究显示其发挥上述作用的下游途径可能离不开对Wnt经典及非经典通路的激活,包括β-catenin/TCF/LEF-1及Rho A/ROCK2通路的活化,同时Dvl3 mRNA干扰外泌体组获得的对炎症性关节炎的保护性结果为未来RA的干预治疗提供了理论基础和新的潜在靶点。
管印[4]（2021）在《金银花复方治疗活动期RA湿热瘀阻证临床观察及单体GALU对FLS影响的研究》文中指出目的:观察金银花复方对类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）活动期湿热瘀阻证的临床疗效和安全性;探讨复方君药金银花有效成分木犀草苷（Galuteolin,Galu）对于TNF-α诱导的类风湿关节炎成纤维滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte,FLS）的影响,从分子角度分析金银花复方缓解活动期RA的部分潜在作用机制;更好地继承和发掘名老中医经验,为进一步探讨金银花复方的作用机制打下基础。方法:1.临床试验部分:收集60例活动期类风湿关节炎湿热瘀阻证患者,通过临床随机对照试验,采集患者基本资料、四诊信息、实验室检查等资料,观察金银花复方治疗活动期类风湿关节炎湿热瘀阻证的临床疗效,主要观察了中医证候积分、疾病活动度评分（DAS28评分）、类风湿因子（RF）、血沉（ESR）等指标,依据中医证候疗效标准及ACR20/50/70标准,评价疾病治疗的总体疗效。2.基础实验部分:用TNF-α刺激经不同浓度Galu预处理过的RA-FLS,观察不同浓度Galu对TNF-α刺激下的RA-FLS细胞增殖的影响,选取最佳Galu浓度进行后续实验;观察Galu对RA-FLS增殖、凋亡、炎症方面的影响,探索Galu发挥作用的可能途径。在研究中,用CCK-8比色法检测细胞增殖情况;TUNEL法检测细胞凋亡;Western blot检测IKKβ、p-p65、p65、p-IκB、I-κB、Cleaved-caspase-3,Caspase-3,Bcl-2和Bax的表达;qRT-PCR检测HO-1;ELISA法检测促炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和MMP1的含量。结果:1.临床部分:本临床试验共有57例患者完成了 12周的观察,其中女性患者41例,男性患者16例。对于两组治疗前的性别、年龄、病程、治疗前中医证候积分、治疗前DAS28的基线进行统计学比较均无统计学差异（P>0.05）,具有可比性。1.1中医证候疗效方面,治疗组临床缓解的有10例,显效有15例,有效2例,无效2例;对照组临床缓解的有4例,显效有9例,有效9例,无效6例。因显效级别为等级变量,故采用秩和检验对两组疗效进行差异性分析可知,治疗组平均秩次为34.98,对照组为22.80,秩次越高表明疗效越好,Z=-2.918,P=0.004<0.05,即两组疗效存在差异,治疗组疗效更好。1.2 ACR20/50/70疗效方面,治疗组达到ACR20标准的患者有16例,达到ACR50标准的有7例,达到ACR70标准的有1例;对照组达到ACR20标准的患者有12例,达到ACR50标准的有9例,无达到ACR70标准的患者。因ACR疗效为等级变量,故采用秩和检验对两组ACR疗效进行差异性分析可知,治疗组平均秩次为29.41,对照组为28.57,Z=-0.208,P=0.835>0.05,即两组ACR疗效不存在差异。1.3中医证候积分方面,经12周的治疗后,治疗组及对照组均能明显降低患者的中医证候积分,且治疗组的疗效优于对照组。随后进一步比较了各症状的单项评分,发现治疗组及对照组均能明显降低患者的关节疼痛、关节肿胀、关节压痛及晨僵评分,治疗组还能显着降低屈伸不利、关节发热、疼痛夜甚及舌黯证候评分。在关节发热、疼痛夜甚、舌黯方面治疗组的疗效明显优于对照组,而在关节疼痛、关节肿胀、关节压痛、屈伸不利及晨僵五项积分中,两组疗效的差异尚未达到统计学意义。1.4治疗12周后,治疗组及对照组均能明显降低患者的DAS28评分,但两组之间比较无统计学差异,即在降低DAS28评分方面两组疗效相当。1.5在ESR/RF方面,治疗组及对照组均能明显降低患者的ESR、RF,在降低ESR水平方面治疗组的疗效优于对照组,在改善RF方面两组无统计学差异。2.实验部分2.1 Galu以剂量依赖性方式显着抑制RA-FLS细胞的增殖。2.2 Galu可上调HO-1、Cleaved-caspase-3和Bax的表达水平,降低Bcl-2的表达水平,显着促进RA-FLS细胞凋亡率;而且,HO-1可能参与了 Galu的促凋亡过程,并且是Galu诱导RA-FLS细胞凋亡中的下游靶标。2.3 Galu还能显着降低RA-FLS细胞中促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8和MMP1的水平,对TNF-α诱导的RA-FLS细胞炎症具有良好的抑制作用;并且,HO-1可能是Galu在抑制RA-FLS细胞炎症中的下游靶标。2.4 Galu可显着抑制IKKβ、p-p65和p-IκB的水平,而沉默HO-1可上调上述蛋白在RA-FLS中的表达。结果表明,Galu可能通过激活HO-1抑制IKKβ/NF-κB途径,以抑制TNF-α诱导的RA-FLS细胞的增殖和炎症。结论:1.联合运用金银花复方可以更好地缓解活动期RA湿热瘀阻证患者的临床症状,降低相关炎症指标水平,提高中医证候缓解程度。2.金银花复方君药单体Galu可能通过激活HO-1的表达,抑制IKKβ/NF-κB信号通路,从而抑制RA中滑膜细胞增殖和炎症反应,促进滑膜细胞的凋亡。
沐玉荣[5]（2021）在《AQP1通过wnt/β-catenin通路促进FLS活化参与大鼠胶原性关节炎发病的机制研究及（Ac）5GP对RAFLS生物学行为的影响》文中提出类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种以慢性滑膜炎、软骨骨破坏为特征的自身免疫性疾病,是造成人群致残和丧失劳动力的主要原因之一。RA发病机制尚未阐明,研究表明成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）活化是RA发病和病情进展的重要原因。水通道蛋白（aquaporins,AQPs）是一组与水通透性相关的膜转运蛋白,水通道蛋白的分子结构和生物功能以水通道蛋白1（AQP1）研究最为清楚。越来越多的证据表明,AQP1可以在滑膜组织等组织中表达,RA滑膜中AQP1的上调与滑膜炎症和关节肿胀有关。然而,尚不清楚AQP1在RA中的确切药理作用及潜在机制。乙酰唑胺（Acetazolamide,AZ）是一种广泛应用的碳酸酐酶抑制剂,已被报道在癫痫、青光眼、高原病和水肿等多种疾病的治疗中发挥作用。此外,AZ能抑制AQP1蛋白的表达,抑制AQP1介导的水渗透性,提示AZ在体内外均可作为AQP1的有效抑制剂。五乙酰栀子苷（（Ac）5GP,栀子苷的乙酰化衍生物）表现出比栀子苷更好的药理功能,例如抗炎,抗糖尿病,抗纤维化,抗氧化,抗凋亡和抗肿瘤活性。FLS是组成滑膜内膜的最丰富的细胞类型。在正常情况下,滑膜有助于关节的平滑运动,而在RA中,FLS具有侵袭性病理表型。与正常FLS相比,RA-FLS被激活并表现出独特的侵袭性和侵袭性表型,包括过度增殖,抗凋亡以及增强的迁移和侵袭。RA-FLS向软骨和骨骼的迁移增加以及随后细胞外基质的入侵是破坏RA关节的重要事件。在本研究中,探讨（Ac）5GP对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的保护作用,为RA的防治提供新的思路和药物靶标。本课题的主要研究内容包括以下2个方面:1.水通道蛋白1通过wnt/β-catenin通路促进FLS活化参与大鼠胶原性关节炎发病的机制研究目的:本研究旨证明AQP1可能通过调节β-catenin信号传导参与RA的发病过程,阐明AQP1抑制剂AZ对大鼠CIA的治疗作用并探讨其潜在机制。方法:采用继发性足肿胀和踝关节病理组织学变化来评价CIA大鼠的严重程度。免疫组织化学（IHC）和蛋白质印迹法（Western blot）检测滑膜组织AQP1和β-catenin的表达。使用AQP1 si RNA敲除培养CIA FLS中的AQP1。使用MTT法、PCNA免疫荧光法和transwell法检测RA FLS的增殖、迁移和侵袭。Western blot实验检测wnt/β-catenin通路中的β-catenin,p-GSK-3β（Ser9）,c-myc,cyclin D1和MMP9的蛋白水平。检测继发性足肿胀、关节炎指数、踝关节病理指标、血清中II型胶原抗体、IL-1β和TNF-α水平,以评估AQP1抑制剂AZ对CIA大鼠的抗关节炎作用。采用Ki67免疫组化和TUNEL实验检测AZ对滑膜细胞的抗增殖、促凋亡作用。Western blot检测凋亡相关蛋白和Wnt/β-catenin通路的蛋白水平。结论:水通道蛋白1通过wnt/β-catenin通路促进FLS活化参与大鼠胶原性关节炎的发病过程。2.五乙酰栀子苷通过抑制Wnt/β-catenin通路抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的迁移,侵袭和炎症目的:本研究旨在观察（Ac）5GP对RA成纤维样滑膜细胞MH7A细胞迁移,侵袭和炎症的影响,并探讨其可能存在的相关机制。方法:MTT法检测细胞活力,划痕和transwell实验检测细胞迁移和侵袭,F-actin检测细胞骨架重组,免疫荧光检测β-catenin的核易位。Elisa试剂盒用于检测IL-1β,IL-6,IL-8,MMP-2和MMP-9等炎症因子水平,western Blot检测迁移,侵袭,炎症因子和其他相关蛋白水平。结论:（Ac）5GP通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制MH7A的迁移、侵袭和炎症反应。
徐武岩[6]（2020）在《S100A4诱导成纤维样滑膜细胞表达VEGF的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨S100A4蛋白诱导RAFLSs表达VEGF参与RA发病的作用及机制,以期为RA的早期预防、诊治及特异性药物的开发提供依据。方法:1.选取我院行膝关节镜或膝关节置换术的RA患者滑膜,行原代滑膜组织成纤维样滑膜细胞的分离及培养。2.应用CCK-8法检测S100A4对RAFLSs增殖的影响。3.应用细胞免疫荧光法检测RAFLSs中VEGF蛋白水平的表达。4.检测S100A4孵育RAFLSs条件培养基诱导HUVECs体外形成血管的作用。5.应用Western blot检测S100A4对RAFLSs m TOR信号通路的影响。6.应用Western blot检测S100A4经m TOR信号通路对RAFLSs VEGF蛋白水平表达的影响。结果:1.rh S100A4能促进RAFLSs增殖,m TOR信号通路抑制剂雷帕霉素Rap可抑制rh S100A4对RAFLSs的增殖作用且呈浓度依赖效应。2.rh S100A4能促进VEGF蛋白水平表达且呈浓度依赖效应,Rap可抑制rh S100A4对VEGF蛋白的促表达作用。3.rh S100A4孵育RAFLSs培养基可促进HUVECs体外形成血管,呈时间及浓度依赖效应,Rap可抑制上述效应。4.rh S100A4可刺激RAFLSs,活化m TOR信号通路下游蛋白S6,使其磷酸化水平升高,呈时间及浓度依赖效应。5.rh S100A4活化m TOR信号通路下游蛋白S6及增强VEGF蛋白表达作用可被Rap抑制。结论:在RA发病过程中,S100A4通过激活m TOR信号通路,从而提高RAFLSs VEGF活性,促进VEGF表达增加,导致血管翳形成,参与RA发生发展。
李佳会[7]（2020）在《双氯芬酸钠治疗类风湿性关节炎中影响滑膜细胞能量代谢作用的实验研究》文中研究说明目的双氯芬酸钠治疗类风湿关节炎机制的再研究,并从糖酵解方面探讨其可能机制。方法MTT法检测细胞增殖抑制;基因芯片检测糖酵解和线粒体相关基因的变化;利用计算机辅助药物设计基于蛋白结构的靶点进行预测,使双氯芬酸分别与糖代谢相关的蛋白晶体结构进行分子对接,选择结合活性预测高的靶点进行详细分子作用分析;乳酸试剂盒检测胞内乳酸变化,通过脂质体Lipofectamine 2000将si-COX-2 Inhibitor、si-PKM2 Inhibitor、si-GLUT1 Inhibitor分别转染至人RA FLS细胞,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,RT-q PCR法和Western blot法分别检测糖酵解相关基因和蛋白的相对表达水平;2-NBDG检测大鼠关节滑膜组织葡萄糖摄取变化;免疫组化法检测大鼠滑膜组织COX-2糖酵解相关蛋白PKM2、GLUT1相对表达量。结果双氯芬酸对RA FLS细胞糖酵解有显着抑制作用,其中对糖酵解酶PKM2和GLUT1抑制作用较明显,机制为双氯酚酸钠通过COX-2介导RA FLS细胞中GLUT1/PKM2途径的诱导细胞凋亡。免疫组化结果同样证明双氯芬酸钠对大鼠滑膜组织糖酵解酶GLUT1,PKM2有显着抑制作用。结论双氯芬酸能够抑制RAFLS细胞上升的糖酵解,通过抑制COX-2介导RAFLS细胞中GLUT1/PKM2途径进而诱导RAFLS细胞凋亡。
赵萌萌[8]（2020）在《神经酰胺相关合成酶在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞调控白细胞介素-6生成中的作用》文中提出背景:类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是一种以慢性破坏性关节病变为特征的全身性炎性自身免疫病。以滑膜增生,炎症细胞浸润,血管翳形成为主要病理特征。RA患者的外周血和滑膜局部存在的复杂细胞因子及趋化因子网络使炎症环境持续存在。成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte,FLS）既是RA关节炎症损伤的效应细胞,也可导致关节软骨和骨的破坏。在关节靶向阶段,FLS与固有免疫细胞和适应性免疫细胞相互作用,产生大量炎性细胞因子,进而构建了RA关节中的促炎微环境,FLS与其相关的细胞因子在RA的发生中起到关键作用。其中IL-6作为发挥核心作用的促炎因子,通过与FLS及其他免疫细胞的相互作用,促进组织损伤、急性期反应及自身免疫反应,在RA的发病机制中发挥多种作用。IL-6R拮抗剂已经在临床反馈中取得非常好的疗效,调控IL-6信号转导途径被视为治疗RA的重要靶点。鞘脂类是细胞膜的重要组成部分,且与许多细胞功能息息相关。鞘脂类对IL-6的生成有调节作用,同时TNF-α及IL-1β等促炎性细胞因子可以影响鞘脂类的代谢。鞘脂类相互代谢是在许多酶的参与下逐步进行的。其中,神经酰胺是鞘脂类的核心,通过重组给定的信号体,在多种疾病和免疫调节中发挥诸多功能。神经酰胺打捞途径相关酶ASM（Acid Sphingomyelinase,酸性鞘磷脂酶）和GBA1（Acidβ-glucosidase 1,酸性β葡糖苷酶1）与肿瘤细胞生成IL-6相关,ASM/神经酰胺通过p38途径,在IL-6m RNA表达的稳定性中起独立的正向作用,从而使IL-6生成增加。且ASM通过调节IL-6的生成,参与肿瘤细胞的侵袭性病理生物学行为。而GBA1在乳腺癌细胞中则以GBA1-神经酰胺-p38δ途径与IL-6的生成负相关。因此本课题组推测神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1通过p38途径调控RAFLS生成IL-6,进而可能影响RAFLS的异常增殖、抗凋亡、迁移及侵袭能力,参与RA的疾病进程。本研究将采用RA患者外周血和FLS作为研究对象,深入探讨神经酰胺合成酶ASM和GBA1在RA中对IL-6的调控作用及其相关作用机制。第一部分:类风湿关节炎患者外周血中神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1的表达情况目的:研究神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1在RA患者外周血中的表达情况,以及与TNF-α、IL-6及其他临床指标进行相关性分析。方法:收集中国医科大学附属第一医院风湿免疫科住院符合2010年美国风湿病学会（ACR）/欧洲抗风湿病联盟（EULAR）修订的RA分类诊断标准的RA患者42例,以及同期年龄、性别匹配的健康对照15例。收集患者年龄、性别、病程、合并脏器受累情况、药物治疗史,肿胀关节数（SJC）、压痛关节数（TJC）、VAS评分、红细胞沉降率（ESR）、C-反应蛋白（CRP）、类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸多肽抗体（anti-CCP）及临床常规实验室检查结果,评估疾病活动度（DAS28-ESR、DAS28-CRP、CDAI、SDAI）及关节骨侵蚀分级（双手X线平片）。应用ELISA法检测RA患者外周血清中的ASM和GBA1以及TNF-α、IL-6的水平。两组间的差异符合正态分布样本应用独立样本t检验,非正态分布数据应用Mann-Whitney秩和检验。血清中ASM和GBA与细胞因子TNF-α、IL-6以及各临床相关指标之间的相关性分析采用Spearman相关性分析（非参数相关性分析）。结果:42例RA患者中处于缓解及低疾病活动度（DAS28-CRP≤3.2）有4例（10%）,中度疾病活动度（3.2<DAS28-CRP<5.1）有13例（41%）,重度疾病活动度（DAS28-CRP≥5.1）25例（59%）,入选RA患者以中重度疾病活动度居多。RA患者组血清中的ASM和GBA1表达水平与健康对照组相比显着增高（p=0.0419,p<0.0001）。进行Spearman相关性分析,结果发现血清GBA1水平与IL-6（r=-0.4957,p=0.0008）呈负相关;与PLT（r=0.4625,p=0.002）和CRP（r=0.3946,p=0.0097）呈正相关;而血清ASM与GBA1、IL-6、TNFα以及PLT、ESR、CRP、RF、anti-CCP等临床相关指标无显着相关性。结论:RA患者外周血中神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1的表达水平升高,GBA1与IL-6的水平呈负相关。ASM和GBA1可能通过调控炎症的不同作用参与RA的发病。第二部分:神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中调控白细胞介素-6的作用目的:分离、培养及鉴定RAFLS;研究神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1对RAFLS产生IL-6以及增殖、凋亡、迁移及侵袭的调控作用。方法:10例符合诊断标准RA患者在骨科及运动医学科进行膝关节置换术后,留取滑膜组织标本,应用酶消化法获得原代FLS,采用免疫荧光检测FLS中Vimentin的表达情况进行鉴定。采用ELISA法检测RAFLS上清IL-6的水平,real-time PCR方法检测RAFLS中IL-6 m RNA的表达。采用CCK8法检测细胞增殖,采用流式细胞术（Annexin V/PI）检测细胞凋亡,应用划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果:体外分离、培养的原代滑膜细胞,传代至（P3-4）高表达Vimentin,鉴定为RAFLS。应用不同浓度IL-1β刺激RAFLS不同时间,各不同刺激时间组内,IL-1β2.5ng/ml和IL-1β10ng/ml组细胞上清中IL-6含量均较空白对照组有显着升高（p<0.05,p<0.0001）,选择2.5ng/ml诱导24小时作为刺激RAFLS的作用条件。托珠单抗（IL-6R拮抗剂）、地昔帕明（ASM抑制剂）、托珠单抗联合地昔帕明及托珠单抗联合环己烯四醇β环氧化物（GBA抑制剂）均可显着下调由IL-1β刺激RAFLS中的IL-6蛋白和m RNA表达（p<0.05、p<0.001或p<0.0001）;环己烯四醇β环氧化物可显着上调IL-1β刺激RAFLS中IL-6蛋白和m RNA表达（p<0.0001）;托珠单抗联合地昔帕明较单用托珠单抗组的IL-6蛋白和m RNA表达显着下降（p<0.05、p<0.0001）。托珠单抗、地昔帕明、托珠单抗联合地昔帕明均可显着抑制IL-1β诱导的RAFLS增殖能力（p<0.01、p<0.05、p<0.001）;而环己烯四醇β环氧化物则显着增加IL-1β诱导的RAFLS增殖能力（p<0.05）,各组药物对细胞凋亡无明显影响。托珠单抗、地昔帕明、托珠单抗联合地昔帕明均可显着抑制IL-1β诱导的RAFLS的迁移和侵袭能力（p<0.05）;而环己烯四醇β环氧化物则显着增加IL-1β诱导以及托珠单抗处理的RAFLS迁移和侵袭能力（p<0.05、p<0.0001）。结论:功能性ASM抑制剂可以下调RAFLS分泌IL-6及抑制RAFLS细胞增殖、迁移及侵袭功能,且功能性ASM抑制剂与IL-6拮抗剂伍用,可以协同抑制RAFLS分泌IL-6及RAFLS细胞增殖、迁移及侵袭功能。因此三环类抗抑郁药等功能性ASM抑制剂可能对RA的关节滑膜炎症有潜在的治疗作用,并可以与IL-6拮抗剂联合应用进行协同治疗。而GBA1抑制剂可以上调RAFLS分泌IL-6并增强RAFLS细胞增殖、迁移及侵袭功能,GBA1可能参与RA的疾病进程。第三部分:神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1通过p38通路在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中调控白细胞介素-6的生成目的:研究神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1调控RAFLS产生IL-6的分子机制。方法:采用原代分离培养并经过鉴定的P3-6的RAFLS进行实验。应用Western Blot法测定RAFLS MAPK信号通路中p38α、p38δ、ERK、JNK及蛋白磷酸化水平。构建针对人源GBA、ASM沉默慢病毒载体并转染RAFLS,应用Real-time PCR方法和Western Blot方法检验沉默慢病毒转染RAFLS后GBA m RNA、ASM m RNA和GBA和ASM的蛋白表达。采用ELISA法检测RAFLS上清IL-6的水平,real-time PCR方法检测RAFLS中IL-6 m RNA的表达。结果:地昔帕明、托珠单抗及地昔帕明+托珠单抗可以显着抑制IL-1β诱导的p38α、p38δ、ERK、JNK的磷酸化（p<0.0001）;地昔帕明+托珠单抗较托珠单抗组显着下调IL-1β诱导p38α、p38δ磷酸化水平（p<0.01、p<0.05）。而环己烯四醇β环氧化物则可以显着上调IL-1β诱导的p38α、p38δ、ERK、JNK的磷酸化（p<0.05、p<0.01、p<0.0001）。构建沉默慢病毒质粒转染RAFLS,与阴性对照感染组相比,LV-GBA及LV-ASM转染组相应m RNA及蛋白表达显着下降。GBA沉默病毒转染RAFLS可以显着上调IL-1β诱导细胞产生的IL-6蛋白和m RNA水平（p<0.001）;ASM沉默病毒转染RAFLS可以显着下调IL-1β诱导细胞产生的IL-6蛋白和m RNA水平（p<0.0001）。GBA沉默病毒转染RAFLS可以显着上调IL-1β诱导的p38α、p38δ、ERK、JNK的磷酸化（p<0.0001、p<0.01、p<0.05、p<0.01）;ASM沉默病毒转染RAFLS可以显着下调IL-1β诱导的p38α、p38δ、ERK、JNK的磷酸化（p<0.0001）。p38 MAPK抑制剂SB202190可以显着下调GBA和ASM沉默慢病毒载体转染RAFLS经IL-1β诱导细胞产生的IL-6蛋白和m RNA水平（p<0.0001）。结论:功能性ASM抑制剂和ASM沉默慢病毒均可以通过抑制p38活化进而下调RAFLS分泌IL-6,功能性ASM抑制剂和IL-6拮抗剂伍用可以协同抑制p38活化。GBA抑制剂和GBA沉默慢病毒可以通过激活p38通路进而促进RAFLS分泌IL-6。
牛若雯[9]（2020）在《ASIC1a通过Ca2+/Rac1信号通路调控类风湿关节炎滑膜侵袭的作用及其机制的研究》文中研究说明类风湿关节炎（RA）是一种原因不明的慢性自身免疫性疾病,主要影响关节并最终导致其破坏。现在,位于滑膜边缘的RA成纤维样滑膜细胞（RA-FLSs）被认为是RA病理生理过程的关键参与者,研究表明RA-FLSs与肿瘤细胞具有许多相似的特性,包括不受接触抑制的过度增殖,及其对软骨的迁移和侵袭能力。酸敏感离子通道（ASICs）作为细胞外酸性PH的关键受体,在各种炎症,缺血,缺氧,肿瘤等疾病中具有不同的表达,并且与疾病潜在的发病机制有关。诸多研究表明ASIC1a参与了肝癌,胃癌等肿瘤细胞的迁移和侵袭。因此,我们旨在探索ASIC1a是否也参与了类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLSs）这种类肿瘤细胞的迁移和侵袭,从而造成软骨和骨质破坏。目的:本课题通过检测在RA-FLSs以及佐剂性关节炎（AA）大鼠中ASIC1a的表达情况,从而探讨ASIC1a是否调控类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLSs）迁移和侵袭从而导致滑膜对关节软骨的侵袭性破坏,以及酸化激活ASIC1a是否是通过介导Ca2+内流从而活化Rac1信号,进而促进RA-FLSs迁移和侵袭。方法:采用免疫组化法检测ASIC1a在RA患者和正常人滑膜组织中的表达水平。采用Western blot法,免疫荧光法,q RT-PCR检测ASIC1a在RA滑膜成纤维细胞和正常人滑膜成纤维细胞中的表达情况。采用弗氏佐剂建立佐剂性关节炎AA大鼠模型,处理组的AA组在造模成功后第14天注射ASIC1a的特异性阻断剂PCTX-1或阳性药醋酸曲安奈德（1mg/kg）或PBS,采用HE染色,甲苯胺蓝染色法观察大鼠关节处滑膜增生,浸润,侵袭软骨现象,Western blot和免疫组化检测大鼠关节滑膜中迁移和侵袭相关基因的表达。使用ASIC1a sh RNA的慢病毒质粒转染RA-FLSs,构建ASIC1a基因沉默组以及过表达组。用q RT-PCR,western blot和ELISA法评估不同PH下和ASIC1a-RNAi或过表达ASIC1a转染的RA-FLSs中靶基因和蛋白的表达。通过划痕和transwell法检测不同组别中RA-FLSs迁移和侵袭能力。将RA-FLSs分为对照组,PH6.0酸化组以及PCTX-1+PH6.0酸化组。分别使用钙离子荧光探针Fluo-3 AM标记每组RA-FLSs中的钙离子,采用激光共聚焦显微镜观察细胞中钙荧光强度变化。将RA-FLSs分为PH7.4,PH6.0和PH6.0+ASIC1a-RNAi或过表达ASIC1a组。再使用Rac1活性检测试剂盒检测RA-FLSs中Rac1的活性。在BAPTA-AM螯合细胞内钙离子后,检测RA-FLSs中Rac1的活性变化。采用Rac1特异性抑制剂NSC23766抑制Rac1活性后用q RT-PCR,western blot和ELISA法评估不同PH下和ASIC1a-RNAi或过表达ASIC1a转染的RA-FLSs中靶基因和蛋白的表达,通过划痕和transwell法检测细胞迁移和侵袭。结果:我们的结果显示ASIC1a在RA滑膜组织和RA-FLSs中高表达。PCTX-1对ASIC1a的抑制作用可降低滑膜侵袭,并能保护AA大鼠关节软骨,降低MMP2,MMP9,p-FAK的表达。此外,ASIC1a-RNAi和PCTX-1抑制ASIC1a后,酸诱导的RA-FLSs的侵袭和迁移降低,而过表达-ASIC1a则使之升高。MMP2,MMP9,p-FAK的表达也与此相一致。ASIC1a介导Ca2+内流和Rac1的激活,而胞内钙螯合剂BAPTA-AM降低Rac1的活性。同时,Rac1特异性阻断剂NSC23766抑制了RA-FLSs的迁移侵袭以及MMP2,MMP9,p-FAK的表达。总之,这项研究表明ASIC1a可能是通过Ca2+/Rac1途径引起的滑膜侵袭的主要调节因子。结论:1.ASIC1a能够调控RA-FLSs的迁移和侵袭。2.ASIC1a通过Ca2+/Rac1信号通路调控RA-FLSs的迁移和侵袭。
王俊[10]（2020）在《转录因子Forkhead box C1调控类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌的分子机制研究》文中指出类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种以滑膜炎为主要病理特征,同时伴有关节软骨破坏和软骨下骨侵蚀的全身性自身免疫性疾病。RA滑膜成纤维细胞（RA synovial fibroblasts,RASFs）的活化是上述病理过程的重要参与者。有证据表明Wnt/β-catenin信号通路在RA中处于激活状态,参与了RASFs的活化。活化的SFs具有增殖,侵袭力增强,炎症因子分泌异常,类肿瘤样生长特性。转录因子Forkhead box C1（Fox C1）,近年来发现在多种肿瘤的发生机制中异常表达且在肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭方面发挥重要作用。尽管在肿瘤中已有关于Fox C1的报道,但目前在RA中还缺少关于Fox C1表达及功能的相关研究。因此,本研究着重探讨Fox C1在RA滑膜组织和RASFs中的表达情况以及Fox C1对RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌的影响的相关分子机制。本实验共分为四个部分。一、Fox C1和β-catenin在RA滑膜组织及RASFs中高表达获取RA和正常创伤组（Control）患者的滑膜组织,通过免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）、蛋白质印记（western blot,WB）和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（q RT-PCR）等方法检测Fox C1和β-catenin的表达情况。结果发现:RA滑膜组织中的Fox C1,β-catenin基因和蛋白的表达明显高于Control患者。另外,从滑膜组织中提取原代SFs后进行检测,结果同样显示:Fox C1和β-catenin在RASFs中的表达高于Control SFs。滑膜组织的IHC和SFs的免疫荧光检测结果显示:Fox C1和β-catenin在SFs的细胞质和细胞核中均有表达,并且在细胞核中Fox C1和β-catenin的表达量明显高于Control组。这部分结果提示Fox C1和β-catenin在RA病理中异常表达。二、Fox C1调控RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌为了进一步探究Fox C1在RA中的功能,提取原代RASFs并通过转染过表达Fox C1的慢病毒,观察其对RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌的影响。结果发现:在体外过表达Fox C1的RASFs的增殖、迁移、侵袭能力明显增强;通过酶联免疫吸附检测（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）发现:过表达Fox C1能够增加RASFs上清中白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）、及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）分泌,同时降低白细胞介素10（interleukin-10,IL-10）的分泌。通过转染抑制Fox C1表达的si RNA片段,观察其对RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌的影响。结果发现:在体外抑制Fox C1的RASFs的增殖、迁移、侵袭能力明显减弱;通过ELISA检测发现:抑制Fox C1可降低RASFs上清中的IL-1β、IL-6及TNF-α分泌,同时促进IL-10的分泌。三、Fox C1通过调控β-catenin激活Wnt/β-catenin信号通路影响RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌结合上述结果,我们推测Fox C1调控RASFs的增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌,很有可能是通过调控Wnt/β-catenin信号通路。因此,我们应用WB和q RT-PCR方法对与Wnt/β-catenin通路相关,以及RA病理相关的基因进行检测,结果发现在RASFs中过表达Fox C1后可促进Wnt/β-catenin通路重要的信号分子β-catenin的表达,同时与Wnt/β-catenin通路相关的基因细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、原癌基因（c-Myc）,以及RA相关的基因纤连蛋白（fibronectin）和基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3,MMP3）的表达都升高。然而这一现象在抑制Fox C1的表达后出现了相反的结果。为了进一步明确Fox C1可能是通过调控β-catenin来影响Wnt/β-catenin通路并实现上述功能。接下来我们进行正反验证。首先在过表达Fox C1的情况下同时抑制β-catenin,发现cyclin D1,c-Myc,fibronectin和MMP3的基因和蛋白表达都降低;RASFs的增殖、迁移、侵袭以及促炎症因子（IL-1β、IL-6及TNF-α）分泌抑制,抗炎因子（IL-10）的分泌增加。其次我们在抑制Fox C1的情况下过表达β-catenin,发现cyclin D1,c-Myc,fibronectin和MMP3的基因和蛋白表达都升高;RASFs的增殖、迁移、侵袭以及促炎因子（IL-1β、IL-6及TNF-α）分泌增加,抑炎因子（IL-10）的分泌降低。最后,通过免疫共沉淀技术（co-immunoprecipitation,COIP）我们发现:Fox C1蛋白在RASFs中与β-catenin蛋白存在结合。进一步通过双荧光素酶实验和染色质免疫共沉定技术（chromatin immunoprecipitation,CHIP）发现:在RASFs中Fox C1与β-catenin启动子结合,促进β-catenin的转录。四、体内抑制Fox C1能够降低胶原诱导关节炎大鼠（collagen-induced arthritis,CIA）模型的关节炎进展建立CIA模型14天后,我们在大鼠的左后踝关节中注射能够抑制Fox C1表达的si RNA（Fox C1-specific si RNA）,通过活体成像确定一次注射药物在体内能够有一周的有效时间。干预治疗3周后,通过HE染色、IHC、Micro-CT、番红固绿染色分别评价Fox C1-specific si RNA对于CIA大鼠的滑膜、骨和软骨的治疗作用。我们的结果显示Fox C1-specific si RNA能够缓解CIA大鼠的关节炎进展。综上所述,我们的研究从体外和体内两个系统,全面探讨了Fox C1在RASFs中的表达以及对RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子的影响。发现Fox C1之所以能发挥这些作用,是通过调控Wnt/β-catenin途径中重要的信号分子β-catenin。最后,我们证实局部抑制Fox C1的表达能够缓解CIA大鼠的关节炎进展。Fox C1的发现为理解、探索RA的病理机制提供了重要线索,同时为寻找RA新的治疗靶点提供新的思路。
二、侵袭性类风湿关节炎的治疗策略（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、侵袭性类风湿关节炎的治疗策略（论文提纲范文）
（1）万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 类风湿关节炎概述 |
| 1.2 类风湿关节炎发病机制 |
| 1.2.1 触发阶段 |
| 1.2.2 成熟阶段 |
| 1.2.3 靶向阶段 |
| 1.2.4 爆发性阶段 |
| 1.3 类风湿性关节炎现代药物疗法 |
| 1.3.1 传统DMARDs |
| 1.3.2 生物DMARDs |
| 1.3.3 小分子DMARDs |
| 1.4 肠道微生物群与类风湿关节炎 |
| 1.4.1 肠道菌群与免疫调节细胞 |
| 1.4.2 肠道菌群介导炎症性关节炎 |
| 1.4.3 肠道菌群介导类风湿关节炎治疗 |
| 1.4.4 益生菌 |
| 1.5 中草药对RA-FLSs细胞凋亡的影响及机制 |
| 1.5.1 RA-FLSs细胞凋亡 |
| 1.5.2 死亡受体介导的凋亡途径 |
| 1.5.3 线粒体依赖性凋亡途径 |
| 1.5.4 .NF-κB介导的凋亡途径 |
| 1.5.5 MAPK介导的凋亡途径 |
| 1.5.6 .其他凋亡途径 |
| 1.6 万通筋骨片研究进展 |
| 1.7 技术路线 |
| 第2章 万通筋骨片在类风湿性关节炎中的抗炎作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂与耗材 |
| 2.2.3 实验细胞与实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大鼠急毒实验 |
| 2.3.2 CIA大鼠模型建立 |
| 2.3.3 动物分组与给药 |
| 2.3.4 酶联免疫吸附试验 |
| 2.3.5 HE染色 |
| 2.3.6 免疫组化分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 万通筋骨片安全给药浓度 |
| 2.4.2 CIA大鼠模型 |
| 2.4.3 万通筋骨片对RA具有抗炎作用 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 万通筋骨片在类风湿性关节炎中的抗炎机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂与耗材 |
| 3.2.3 实验细胞与实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 万通筋骨片溶液配制 |
| 3.3.2 RA-FLSs细胞培养 |
| 3.3.3 细胞形态观察 |
| 3.3.4 RA-FLSs细胞增殖检测 |
| 3.3.5 蛋白免疫印迹分析 |
| 3.3.6 实时荧光定量PCR分析 |
| 3.3.7 细胞免疫荧光 |
| 3.3.8 质粒转染 |
| 3.3.9 Caspase-3/9蛋白酶活性检测 |
| 3.3.10 免疫组化分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 万通筋骨片乙醇提取物对RA-FLSs细胞的影响 |
| 3.4.2 MEK/ERK信号通路介导万通筋骨片的抗炎作用 |
| 3.4.3 万通筋骨片乙醇提取物促进RA-FLSs细胞凋亡 |
| 3.4.4 线粒体依赖性凋亡途径介导万通筋骨片的抗炎作用 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 基于RNA高通量测序挖掘万通筋骨片对RA的抗炎靶点 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验试剂与耗材 |
| 4.2.3 实验分析软件 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 RA-FLSs细胞培养与分组 |
| 4.3.2 样品收集和准备 |
| 4.3.3 数据分析 |
| 4.3.4 实时荧光定量PCR |
| 4.3.5 蛋白免疫印迹 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 DESeq2差异分析 |
| 4.4.2 差异基因功能注释分析 |
| 4.4.3 KEGG富集通路提取及蛋白互作网络分析 |
| 4.4.4 STEM时间聚类分析 |
| 4.4.5 权重共表达网络分析及功能富集分析 |
| 4.4.6 基因共表达网络分析及蛋白互作网络分析 |
| 4.4.7 核心基因筛选与验证 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 基于16S高通量测序和代谢组学联合分析挖掘万通筋骨片对RA的抗炎靶点 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验分析软件 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 16S rDNA扩增子测序 |
| 5.3.2 16S rDNA扩增子信息分析 |
| 5.3.3 代谢物提取 |
| 5.3.4 色谱条件 |
| 5.3.5 质谱条件 |
| 5.3.6 代谢物鉴定 |
| 5.3.7 肠道菌群与代谢物联合分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 万通筋骨片改变CIA大鼠肠道菌群结构 |
| 5.4.2 万通筋骨片作用特定肠道菌群 |
| 5.4.3 万通筋骨片改变CIA大鼠血清代谢物谱 |
| 5.4.4 差异代谢物筛选 |
| 5.4.5 靶点代谢物筛选 |
| 5.4.6 16S rDNA高通量测序与代谢物组学联合分析 |
| 5.5 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 附表 |
（2）FAPα对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞功能影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩略词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分:通过生物信息学分析FAPα在RA滑膜中的作用 |
| 1 对象与方法 |
| 1.1 数据的获取和标准化处理 |
| 1.2 差异基因分析 |
| 1.3 GO和KEGG分析 |
| 1.4 蛋白-蛋白相互作用网络的构建 |
| 2 结果 |
| 2.1 数据标准化处理结果 |
| 2.2 FAPα相关差异基因的表达 |
| 2.3 GO分析与KEGG分析 |
| 2.4 蛋白与蛋白互作网络分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分:FAPα对RA-FLSs功能的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂与设备 |
| 1.2 主要工作液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养与鉴定 |
| 2.2 细胞转染及验证 |
| 2.3 细胞增殖 |
| 2.4 细胞周期 |
| 2.5 细胞凋亡 |
| 2.6 细胞迁移和侵袭能力 |
| 2.7 SHH信号通路蛋白表达的检测 |
| 2.8 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 原代FLSs的培养与鉴定 |
| 3.2 细胞转染效率的验证 |
| 3.3 FAPα对FLSs增殖的影响 |
| 3.4 FAPα对FLSs周期的影响 |
| 3.5 FAPα对FLSs凋亡的影响 |
| 3.6 FAPα对FLSs迁移及侵袭能力的影响 |
| 3.7 FAPα对SHH通路影响的蛋白水平的验证 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 文献综述 FAPα在类风湿关节炎中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）外泌体Dvl3 mRNA调节Wnt通路对关节滑膜增殖、炎症的作用及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 Dvl3在RA患者以及小鼠CIA模型关节滑膜中的表达情况 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 外泌体Dvl3 mRNA对RA-FLS增殖、凋亡、迁移以及炎症因子分泌的影响 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 外泌体Dvl3 mRNA对胶原诱导关节炎小鼠模型关节炎症的影响 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 外泌体Dvl3 mRNA通过调控Wnt途径参与影响RA-FLS生物学行为 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 复杂Wnt信号通路网络中的舞者：Dvl蛋白 |
| 参考文献 |
| 在读期间论文发表和参与科研工作情况 |
| 致谢 |
（4）金银花复方治疗活动期RA湿热瘀阻证临床观察及单体GALU对FLS影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 理论研究 |
| 一、类风湿关节炎的发病 |
| 1. 滑膜炎是类风湿关节炎发生的重要标志 |
| 2. 细胞因子网络促使滑膜炎持续存在 |
| 3. 成纤维滑膜细胞具有独特侵袭性,是RA滑膜炎关键效应细胞 |
| 二、RA炎症效应机制信号通路 |
| 1. 肿瘤坏死因子通路与NF-κB信号通路在RA疾病发展中的意义 |
| 2. IKKβ是激活NF-κB经典途径的关键激酶 |
| 三、对于RA活动期湿热瘀阻证的中医药治疗研究 |
| 1. 湿热瘀阻证是活动性RA的主要证型 |
| 2. 中医药治疗可有效抑制RA滑膜炎症、促进滑膜细胞凋亡 |
| 3. 汪悦教授运用金银花复方治疗活动性RA的经验 |
| 四、中药金银花单体Galu治疗RA的潜在分子机制 |
| 1. 金银花单体Galu对于炎症及细胞增殖的调控作用 |
| 2. HO-1可能是Galu对于炎症调节的潜在作用靶点 |
| 第二章 临床研究 |
| 一、试验目的 |
| 二、试验设计类型: 随机非盲对照 |
| 三、病例选择 |
| 1. 诊断标准 |
| 2. 纳入标准 |
| 3. 排除标准 |
| 4. 病例的脱落 |
| 5. 病例的剔除 |
| 四、治疗方案 |
| 1. 试验用药 |
| 2. 服药方法 |
| 五、观察项目 |
| 1. 一般记录项目 |
| 2. 观察指标 |
| 3. 观测时点 |
| 六、统计分析 |
| 七、研究结果 |
| 1. 一般资料 |
| 2. 总体疗效指标 |
| 3. 各临床及实验室观察疗效指标 |
| 4. 安全性评价 |
| 第三章 实验研究 |
| 一、实验材料 |
| 1. 实验主要材料 |
| 2. 实验主要仪器 |
| 二、实验方法及步骤 |
| 1. 细胞培养及处理 |
| 2. 细胞转染 |
| 3. CCK 8 |
| 4. TUNEL |
| 5. qRT-PCR |
| 6. ELISA |
| 7. Western blot |
| 8. 统计分析 |
| 三、实验结果 |
| 1. Galu抑制RA-FLS细胞的增殖并诱导细胞凋亡 |
| 2. Galu抑制RA-FLS细胞的炎症 |
| 3. 沉默HO-1减弱了Galu对RA-FLS细胞增殖和凋亡的影响 |
| 4. 沉默HO-1减弱了Galu对RA-FLS细胞炎症反应的影响 |
| 5. Galu通过激活RA-FLS细胞中HO-1的表达来抑制IKKβ/NF-κB信号通路 |
| 第四章 讨论 |
| 一、从“湿、热、瘀”论治活动期类风湿关节炎 |
| 1. 湿热瘀是RA疾病进展的病机关键 |
| 2. “清热解毒,化瘀除湿”为活动期RA的治疗大法 |
| 二、金银花复方方解 |
| 三、成纤维滑膜细胞对类风湿关节炎疾病进展具有特殊意义 |
| 1. 维持RA细胞因子网络 |
| 2. 主导RA软骨破坏 |
| 3. 促进T、B细胞持续存活 |
| 四、NFkB与滑膜细胞浸润以及凋亡的关系 |
| 五、H0-1是RA潜在治疗靶点 |
| 六、研究结果分析 |
| 1. 临床试验结果分析 |
| 2. 单体Galu对成纤维滑膜细胞影响的实验结果分析 |
| 第五章 结论 |
| 特色及创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1: 28个关节肿痛计数 |
| 附录2: 中医证候积分 |
| 附录3: 患者对当前疾病造成的疼痛和不适的主观评价(VAS评分) |
| 附录4: 患者生活能力的自我评价量表(HAQ) |
| 附录5: 英文缩略词说明表 |
| 硕士期间学术成果 |
| 致谢 |
（5）AQP1通过wnt/β-catenin通路促进FLS活化参与大鼠胶原性关节炎发病的机制研究及（Ac）5GP对RAFLS生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 AQP1 通过 wnt/β-catenin 通路促进 FLS 活化参与大鼠胶原性关节炎发病的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 CIA大鼠模型的构建,分组和药物治疗 |
| 3.2 关节炎指数评分方法 |
| 3.3 踝关节损伤的病理学检查和评估 |
| 3.4 AQP1,β-Catenin和 Ki67 的免疫组织化学检测 |
| 3.5 大鼠FLS制备和实验分组 |
| 3.6 AQP1 siRNA转染 |
| 3.7 MTT法检测细胞增殖 |
| 3.8 免疫荧光检测增殖细胞核抗原(PCNA) |
| 3.9 Transwell实验 |
| 3.10 TOP/FOP Flash双荧光素酶实验 |
| 3.11 血清Col II抗体及炎症因子水平测定 |
| 3.12 TUNEL法检测滑膜细胞凋亡 |
| 3.13 Western blot实验 |
| 4 统计分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 CIA大鼠模型的评价 |
| 5.2 滑膜组织中的AQP1 过表达加重大鼠CIA:参与β-Catenin信号激活 |
| 5.3 AQP1 siRNA转染降低了CIA FLS中的AQP1 蛋白水平 |
| 5.4 LiCl消除了AQP1 siRNA对 CIA FLS增殖的抑制作用 |
| 5.5 LiCl消除AQP1 siRNA对 CIA FLS迁移和侵袭的抑制作用 |
| 5.6 AQP1 si RNA抑制CIA FLS中 β-catenin信号通路的激活 |
| 5.7 AZ减轻了CIA大鼠关节炎的严重程度 |
| 5.8 AZ缓解了CIA大鼠踝关节的病理变化 |
| 5.9 AZ减轻了CIA大鼠踝关节的软骨损伤 |
| 5.10 AZ降低CIA大鼠血清Col II抗体、IL-1β和 TNF-α水平 |
| 5.11 AZ抑制CIA大鼠滑膜组织中Ki67 的表达 |
| 5.12 AZ促进CIA大鼠滑膜滑膜细胞凋亡 |
| 5.13 AZ调控CIA滑膜组织中Bcl-2、Bax和 caspase3 蛋白水平 |
| 5.14 AZ抑制CIA大鼠滑膜组织中Wnt/β-catenin通路的激活 |
| 6 讨论 |
| 7 结论 |
| 第二部分 (Ac)_5GP 通过抑制 Wnt /β-catenin 信号通路抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的迁移,侵袭和炎症 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 细胞培养与分组 |
| 3.2 MTT法检测细胞增殖 |
| 3.3 Transwell实验 |
| 3.4 划痕实验 |
| 3.5 ELISA实验 |
| 3.6 免疫荧光实验 |
| 3.7 western blot实验 |
| 4 统计分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 (Ac)_5GP对 MH7A细胞活力的影响 |
| 5.2 (Ac)_5GP抑制TNF-α诱导的MH7A迁移和侵袭 |
| 5.3 (Ac)_5GP抑制TNF-α诱导的MH7A细胞骨架重组 |
| 5.4 (Ac)_5GP降低了TNF-α诱导的MH7A中促炎因子和MMPs的产生 |
| 5.5 (Ac)_5GP抑制TNF-α诱导MH7A中 Wnt/β-catenin通路的激活 |
| 5.6 XAV939对Wnt/β-catenin通路的抑制促进了(Ac)_5GP对TNF-α诱导的MH7A的治疗作用 |
| 6 讨论 |
| 7 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 乙酰唑胺的药理作用及研究进展 |
| 参考文献 |
（6）S100A4诱导成纤维样滑膜细胞表达VEGF的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 类风湿关节炎 |
| 1.2 S100A4蛋白 |
| 1.3 mTOR信号通路 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学处理 |
| 2.4 实验技术线路图 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CCK-8法检测S100A4对成纤维样滑膜细胞增殖的影响 |
| 3.2 细胞免疫荧光法检测RAFLSs中 VEGF蛋白水平的表达 |
| 3.3 S100A4 孵育RAFLSs条件培养基诱导HUVECs体外形成血管的作用 |
| 3.4 S100A4对RAFLSs mTOR信号通路的影响 |
| 3.5 S100A4经m TOR信号通路对RAFLSs VEGF蛋白水平表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 S100A4与RA |
| 4.2 VEGF与 RA |
| 4.3 mTOR与 RA |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录：中英文缩略词表 |
| 附录 S100A4 参与类风湿关节炎发病机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表论文 |
| 致谢 |
（7）双氯芬酸钠治疗类风湿性关节炎中影响滑膜细胞能量代谢作用的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 双氯芬酸钠对RAFLS细胞增殖和凋亡的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 .实验材料、试剂 |
| 1.2 .细胞培养 |
| 1.3 .MTT比色法检测细胞增殖 |
| 1.4 .Annexin V-FITC/ PI双染法检测细胞凋亡 |
| 1.5 .透射电子显微镜观察细胞死亡的方式 |
| 1.6 .统计学处理 |
| 2.结果 |
| 2.1 .双氯芬酸钠对RAFLS细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第二章 COX-2 调节RA FLS细胞中PKM2/GLUT1 的表达诱导细胞凋亡 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 .实验材料、试剂 |
| 1.2 .细胞培养 |
| 1.3 .RT-q PCR |
| 1.4 .蛋白质印迹 |
| 1.5 .基因芯片 |
| 1.6 .乳酸的测定 |
| 1.7 .检测细胞葡萄糖摄取 |
| 1.8 .细胞内ATP水平检测 |
| 1.9 .Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 1.10 .大鼠滑膜组织葡萄糖摄取 |
| 1.11 .Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 1.12 .计算机辅助药物设计 |
| 2 体内实验 |
| 2.1 .动物模型的准备 |
| 2.2 .动物分组和管理 |
| 2.3 .免疫组化 |
| 2.4 .组织病理学 |
| 2.5 .统计学处理 |
| 3.结果 |
| 3.1 .双氯芬酸钠对RAFLS细胞糖酵解的影响 |
| 3.2 .基于计算机辅助药物设计预测双氯芬酸钠糖酵解蛋白结构靶点 |
| 3.3 .COX-2 调节RA FLS细胞中PKM2 的表达诱导细胞凋亡 |
| 3.4 .GLUT1与COX-2/PKM2 通路的调节有关 |
| 3.5 .双氯芬酸钠对AA大鼠滑膜组织病理学及大鼠滑膜组织COX-2,PKM2 和GLUT1表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A |
| 附录B |
| 附录C |
| 个人简历 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（8）神经酰胺相关合成酶在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞调控白细胞介素-6生成中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:类风湿关节炎患者外周血中神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1的表达情况 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 纳入标准 |
| 2.1.2 排除标准 |
| 2.1.3 收集临床资料 |
| 2.2 主要试剂及仪器 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法和步骤 |
| 2.3.1 受试者标本采集与保存 |
| 2.3.2 ELISA法检测受试者血清中ASM、GBA、TNF-α、IL-6的表达量 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 RA患者与健康对照受试者的临床资料 |
| 3.2 RA患者与健康对照受试者血清中ASM水平差异 |
| 3.3 RA患者与健康对照受试者血清中GBA水平差异 |
| 3.4 RA患者血清中ASM与GBA的相关性 |
| 3.5 RA患者血清中ASM与细胞因子IL-6、TNF-α及各临床相关指标的相关性 |
| 3.6 RA患者血清中GBA与细胞因子IL-6、TNF-α及各临床相关指标的相关性 |
| 4 讨论 |
| 第二部分:神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中调控白细胞介素-6的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要试剂及仪器 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法和步骤 |
| 2.3.1 原代人RAFLS的分离与培养 |
| 2.3.2 人RAFLS的鉴定(免疫荧光检测) |
| 2.3.3 ELISA法检测RAFLS细胞上清中IL-6水平 |
| 2.3.4 Real-time PCR检测细胞中IL-6 mRNA表达 |
| 2.3.5 细胞增殖实验(CCK-8) |
| 2.3.6 细胞凋亡实验 |
| 2.3.7 细胞划痕实验 |
| 2.3.8 Transwell侵袭实验 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 膝关节滑膜组织来源RA患者的临床资料 |
| 3.2 人RAFLS的分离、培养与鉴定 |
| 3.3 IL-1β刺激人RAFLS产生IL-6 |
| 3.4 神经酰胺合成酶(ASM及GBA1)酶抑制剂对RAFLS产生IL-6生成的影响 |
| 3.5 神经酰胺合成酶(ASM及GBA1)酶抑制剂对RAFLS细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.6 神经酰胺合成酶(ASM及GBA1)酶抑制剂对RAFLS细胞迁移及侵袭的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三部分:神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1通过p38通路在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中调控白细胞介素-6的生成 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要试剂及仪器 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法和步骤 |
| 2.3.1 Western Blot法检测原代人RAFLS中各通路蛋白表达 |
| 2.3.2 构建针对人源GBA、ASM沉默慢病毒载体 |
| 2.3.3 人源GBA、ASM沉默慢病毒载体转染RAFLS |
| 2.3.4 Real-time PCR法验证RNA水平GBA及ASM基因的敲除效率 |
| 2.3.5 Western Blot法验证蛋白水平GBA及ASM基因的敲除效率 |
| 2.3.6 ELISA法检测慢病毒转染RAFLS细胞上清后中IL-6的水平 |
| 2.3.7 Real-time PCR法检测慢病毒转染RAFLS细胞中IL-6 mRNA表达 |
| 2.3.8 p38 MAPK通路抑制剂实验 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 神经酰胺合成酶(ASM及GBA1)酶抑制剂对RAFLS细胞中MAPK信号通路活化的影响 |
| 3.2 构建针对人源GBA、ASM沉默慢病毒载体并转染RAFLS |
| 3.2.1 构建慢病毒质粒载体 |
| 3.2.2 验证RNA水平GBA及ASM基因的敲除效率 |
| 3.2.3 验证蛋白水平GBA及ASM基因的敲除效率 |
| 3.3 GBA、ASM沉默慢病毒载体转染RAFLS对细胞产生IL-6的影响 |
| 3.4 GBA、ASM沉默慢病毒载体转染RAFLS对细胞中MAPK信号通路活化的影响 |
| 3.5 p38 MAPK通路抑制剂对GBA、ASM沉默慢病毒载体转染RAFLS细胞中产生IL-6的影响 |
| 4 讨论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 酸性鞘磷脂酶/神经酰胺在自身免疫性疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）ASIC1a通过Ca2+/Rac1信号通路调控类风湿关节炎滑膜侵袭的作用及其机制的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简介 |
| 致谢 |
| 综述 RA滑膜成纤维细胞在类风湿性关节炎发病机制中的研究进展 |
| 参考文献 |
（10）转录因子Forkhead box C1调控类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 FoxC1和β-catenin在类风湿关节炎滑膜组织及滑膜成纤维细胞中表达情况 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 滑膜样本的基本临床资料 |
| 3.2 滑膜组织的病理表现 |
| 3.3 SFs形态及鉴定 |
| 3.4 滑膜组织中FoxC1和β-catenin蛋白和基因的表达情况 |
| 3.5 FoxC1和β-catenin蛋白和基因在SFs中的表达情况 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第二部分 FoxC1调控RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 LVFoxC1高效转染RASFs |
| 3.2 SiFoxC1高效转染RASFs |
| 3.3 FoxC1对RASFs增殖的影响 |
| 3.4 FoxC1对RASFs迁移的影响 |
| 3.5 FoxC1对RASFs侵袭的影响 |
| 3.6 FoxC1对RASFs炎症因子的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第三部分 FoxC1 通过调控β-catenin激活Wnt/β-catenin信号通路影响RASFs增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 FoxC1对RASFs中 Wnt/β-catenin通路相关基因以及RA相关基因的影响 |
| 3.2 FoxC1 通过调控β-catenin引起RASFs中 Wnt/β-catenin通路相关基因以及RA相关基因的变化 |
| 3.3 FoxC1 通过调控β-catenin引起RASFs的病理变化 |
| 3.4 FoxC1和β-catenin蛋白和基因在RASFs中存在相互作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第四部分 FoxC1对胶原诱导关节炎大鼠踝关节的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 FoxC1-specific siRNA能够在CIA大鼠中稳定表达 |
| 3.2 FoxC1-specific siRNA能够降低CIA大鼠关节肿胀和关节炎临床评分 |
| 3.3 FoxC1-specific siRNA能够降低CIA大鼠滑膜病理变化 |
| 3.4 FoxC1-specific siRNA能够降低CIA大鼠软骨破坏 |
| 3.5 FoxC1-specific siRNA能够降低CIA大鼠骨破坏 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
四、侵袭性类风湿关节炎的治疗策略（论文参考文献）
- [1]万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析[D]. 李兆东. 吉林大学, 2021(01)
- [2]FAPα对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞功能影响的研究[D]. 武泽文. 山西医科大学, 2021(01)
- [3]外泌体Dvl3 mRNA调节Wnt通路对关节滑膜增殖、炎症的作用及其机制[D]. 谭卫星. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [4]金银花复方治疗活动期RA湿热瘀阻证临床观察及单体GALU对FLS影响的研究[D]. 管印. 南京中医药大学, 2021(01)
- [5]AQP1通过wnt/β-catenin通路促进FLS活化参与大鼠胶原性关节炎发病的机制研究及（Ac）5GP对RAFLS生物学行为的影响[D]. 沐玉荣. 安徽医科大学, 2021(01)
- [6]S100A4诱导成纤维样滑膜细胞表达VEGF的作用及机制研究[D]. 徐武岩. 暨南大学, 2020(03)
- [7]双氯芬酸钠治疗类风湿性关节炎中影响滑膜细胞能量代谢作用的实验研究[D]. 李佳会. 蚌埠医学院, 2020(01)
- [8]神经酰胺相关合成酶在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞调控白细胞介素-6生成中的作用[D]. 赵萌萌. 中国医科大学, 2020(02)
- [9]ASIC1a通过Ca2+/Rac1信号通路调控类风湿关节炎滑膜侵袭的作用及其机制的研究[D]. 牛若雯. 安徽医科大学, 2020(02)
- [10]转录因子Forkhead box C1调控类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移、侵袭及炎症因子分泌的分子机制研究[D]. 王俊. 安徽医科大学, 2020(01)